DNA的复制与修复(下册

1、第34章、DNA的复制与修复（下册 P406）本章的重点：本章是重点，要求掌握：一、半保留复制，掌握半保留复制的概念。（一）半保留复制的实验依据，了解半保留复制的实验依据。（二）半保留复制的意义，熟悉半保留复制的意义，半保留复制与遗传相对保守性之间的关系。二、DNA复制的酶学掌握DNA复制系统的组成（底物，聚合酶，模板，引物，其他酶和蛋白质因子）。（一）复制的化学反应，熟悉复制过程中磷酸二酯键的形成，复制过程中新链延伸的方向性。（二）DNA聚合酶 熟悉大肠杆菌DNA聚合酶的不同种类和功能。了解真核生物的DNA聚合酶的种类及功能。了解真核生物DNA-pol 与mt DNA复制。熟悉DNA聚合酶的

2、两种催化活性（聚合，外切）。熟悉复制的保真性的三种机理及DNA聚合酶所起的作用。（三）复制中解链和DNA分子的拓扑学变化，熟悉解螺旋酶、DNA拓扑异构酶、单链DNA结合蛋白在DNA复制中的主要作用。（四）引物酶和引发体，熟悉引物酶的本质及其作用（构成引发体、催化引物RNA生成）。（五）DNA连接酶，熟悉DNA连接酶的作用。了解DNA聚合酶、拓扑酶及连接酶三者的活性对比。三、DNA生物合成过程，（一）复制的起始，熟悉DNA复制起始概况（选点，解链解旋，引发体及引物的生成）及各种酶、蛋白质因子的作用。熟悉双向复制、复制叉、复制子的概念。（二）复制的延长,熟悉DNA复制延长的一般概况、模板阅读方向及

3、复制的不连续性（双向性, 领头链，随从链）。掌握冈崎片段的概念。了解滚环复制。（三）复制的终止，熟悉复制终止的概况，引物的取代及DNA连接酶的作用，新链的完整化。熟悉真核生物的端粒和端粒酶，了解端粒与细胞生长、肿瘤形成的关系。四、DNA损伤（突变）与修复（一）突变的意义，熟悉突变的概念，了解突变的后果（积极，有害，多态）。（二）引发突变的因素，了解引发突变的物理及化学因素。（三）突变分子改变的类型，了解DNA突变时DNA分子改变的类型（错配、缺失、插入、框移突变、重排）（四）DNA损伤的修复，了解四种修复途径的概况。五、逆转录现象和逆转录酶，掌握逆转录的概念，熟悉逆转录酶的作用及应，了解逆转录

4、现象，逆转录病毒。本章的主要内容：DNA是生物遗传的主要物质，DNA复制即以原来DNA分子为模板合成出相同分子的过程。9-1 DNA复制生物系统的遗传信息主要表现为DNA分子中特异的核苷酸排列顺序。DNA整个分子复制，可以将遗传信息由亲代传给子代，碱基配对原理是遗传信息传递的基本机制。（一） DNA的半保留复制：一个亲代DNA分子变成两个子代分子，每个子代分子双链中一条来自亲代分子，一条是新合成的互补链，这种复制方式称为半保留复制。见P407 图34-2。证实：同位素标记法1. 在15NH4Cl培养基中连续培养E. coli 12代，制备15N标记的E. coli的DNA。2. 半保留复制证实

5、：将15N DNA的E. coli转移到14N氮源中培养，一代后，所有DNA密度介于15N-DNA和14N-DNA之间，形成一半含15N，一半含14N的杂合分子。两代后，14N分子和14N-15N杂合分子等量出现。当把14N-15N杂合分子加热变性，可分开成14N-链和15N-链两条链，且这些亚单位经许多代复制仍保持完整性。DNA半保留复制机制可以说明DNA在代谢上的稳定性，是所有已知基因的复制形式。即使一些病毒在生命周期一部分中出现单链DNA，但复制时必为双链DNA。（二） DNA复制的起点和方式：复制叉：DNA复制生长点处形为叉形，故称为复制叉。新DNA合成与亲代DNA解链在同一部位同时进

6、行。DNA复制时大多是双向进行，形成两个复制叉或生长点。也有单向的，只形成一个复制叉或生长点。见P408 图34-4。对称复制：两条链同时进行复制。不对称复制：一条链复制后再进行另一链的复制。环形DNA复制时在显微镜下可以看到形如眼形的型结构。P409 图34-5。P411 图34-8显示了DNA不同复制方式。A：直线双向， B：多起点双向， C：型双向， D：型单向， E：滚动环， F：D环， G：2D环。细菌DNA复制叉移动速度大约为5万bp/分，E. coli完成复制40分钟，在丰富培养基中20分钟即可分裂一次。（三） DNA聚合反应有关的酶：（1） DNA聚合反应和聚合酶1. DNA聚

7、合反应需要下面五个要素 底物：四种脱氧核苷三磷酸（dATP，dGTP，dCTP和dTTP），统称为dNTP，且四种都必须存在。 模版：指导反应进行。模版可以是单链DNA，也可以是在一处或几处断开的双链DNA。 引物链：为具有3-OH的RNA（体内）或DNA（体外）短链。 DNA聚合酶：为模板指导酶，按模版将一个个dNTP根据碱基配对原则催化加成在引物链的3-OH端上。 Mg2+2 DNA聚合酶反应特点： 以四种脱氧核糖核苷三磷酸为底物。 反应需接受模板指导。 反应需引物3-OH存在。 DNA生长方向为5 3，新合成链与模板链互补。 产物DNA性质与模板相同，为模板复制物，与何种聚合酶及四种核苷

8、酸前体的相对比例无关。（2） 大肠杆菌DNA聚合酶E. coli共含有五种不同的DNA聚合酶。1. DNA聚合酶单一多肽链，分子量103000，是一个多功能酶，可以催化以下反应： 聚合反应，使DNA链沿5 3方向延伸。 由3端水解DNA链，为3 5核酸外切酶，可迅速切除错配的核苷酸，具有校对功能，使DNA复制错误率从10-5降至5×10-7。 由5端水解DNA链，为5 3核酸外切酶，用于DNA合成中切除引物及DNA损伤修复。 由3端使DNA链发生焦磷酸解，为聚合反应逆反应。 无机焦磷酸盐与dNTP之间焦磷酸基交换。此酶在E. coli体内由于催化聚合速度慢，主要负责切除和修复。DNA

9、聚合酶被蛋白水解酶有限水解，可生成两个片断：大片断称为Klenow片断，有聚合酶和3 5核酸外切酶活性；小片断具有5 3核酸外切酶活性。2. DNA聚合酶和：均为多亚基酶，均有聚合DNA和3 5核酸外切酶活力，但无5 3 外切酶活力。聚合酶可能与DNA修复有关，聚合酶由于催化合成速度达到了体内DNA合成速度（为聚合酶的100倍），是E. coli真正负责重新合成DNA的复制酶。新近发现的DNA聚合酶和，参与易错链的修复。3. DNA连接酶：DNA聚合酶只能催化链延长，而催化两条链的末端之间形成共价连接则由连接酶完成。连接酶要求：一条DNA链3端有自由OH，另一条DNA链5端有一磷酸基因，连接反

10、应需供能，细菌由NAD供能，动物和噬菌体由ATP供能。P417 图34-17 DNA连接酶催化的反应。一般要求需要连接的两条链，由互补链将它们聚在一起形成双螺旋结构（使缺口闭合），而不能将两条游离的DNA分子连接起来。（四） DNA的半不连续复制：（1） 问题的提出：DNA两条链反向平行，一条链走向为5 3，另一条链为3 5，但所有DNA聚合酶合成方向都是在引物3-OH上合成，使链从5 3延长，那么5 3链是如何同时作为模板复制呢？1968年冈崎提出DNA不连续复制模型（P418图34-18），认为新合成的3 5走向的DNA链实际上是有许多5 3方向合成的DNA片断连接起来的。（2） DNA半

11、不连续复制：DNA复制时，以3 5走向为模板的一条链合成方向为5 3，与复制叉方向一致，称为前导链；另一条以5 3走向为模板链的合成链走向与复制叉移动的方向相反，称为滞后链，其合成是不连续的，先形成许多不连续的片断（冈崎片断），最后连成一条完整的DNA链。（3） DNA合成由RNA引物引发：DNA聚合酶不能发动新链的合成，只能催化已有链的延长；RNA聚合酶则不同，只要有模板存在，不需引物，就可以合成新RNA链。因此在体内先由RNA聚合酶合成RNA引物，DNA聚合酶再从RNA引物的3-OH端开始合成新的DNA链。催化RNA引物合成的酶称为引物合成酶。引物长度通常只有几个10多个核苷酸，冈崎片断合

12、成也需要引物。RNA引物的消除和缺口填补是由DNA聚合酶完成的，最后由DNA连接酶连接。（4） DNA复制的复杂性保证了复制的高度忠实性。E. coli复制时，每个碱基对错配频率为10-910-10，是高保真系统。新DNA链合成时需引物，引物后又要切除，再以DNA链取代，DNA聚合酶在合成时还有校对功能，每引入一个核苷酸都要复查一次，未核实则不能继续进行聚合反应。在复制过程中还有许多辅助蛋白，E. coli就至少有15种。复制叉的复杂结构进一步提高复制准确性。DNA复制还存在正调控和负调控，调控分子可以是蛋白质，也可以是RNA。（五） DNA复制的拓扑性质：DNA复制时首先需将超螺旋解开。DN

13、A拓扑异构酶通过切断与封闭DNA骨架上的磷酸二酯键而使DNA解旋，此过程热力学有利，不需ATP，每次反应改变L=+1；具有类似功能还有拓扑异构酶。DNA复制后，由拓扑异构酶使DNA连续引入负超螺旋，需能由ATP供给，每次反应改变DNA连环数为L=-2。在DNA解链后，由单链结合蛋白（SSB）覆盖，稳定DNA单链，阻止DNA复性和保护不被核酸酶降解。（六） DNA复制的过程：DNA复制可分为三个阶段：起始、延伸和终止。其间的反应和参与作用的酶与辅助因子各有不同。在DNA合成的生长点即复制叉上分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白因子（至少50种以上），它们构成的复合物称为复制体。大肠杆菌复制体结构示

14、意图如P423 图34-22所示。复制体的基本活动包括： 双链的解开； RNA引物的合成； DNA链的延长； 切除RNA引物，填补缺口，连接DNA片断； 切除和修复错配碱基。真核生物的DNA通常都与组蛋白结合，构成核小体，以染色质的形式存在于细胞核中。复制过程需疏松染色质和解开核小体，复制后又需装配并凝缩成染色体，再分配到两个子细胞中去。真核生物有五种DNA聚合酶，其中DNA聚合酶合成引物，是复制酶，是线粒体合成酶，和是修复酶。真核生物染色体DNA的末端有端粒结构，端粒是由端粒酶合成的。端粒是由许多成串短的重复序列组成，该重复序列通常一条链上富含G，而其互补链上富含C。人的端粒为TTAGGG，

15、TG链常比AC链更长些，形成3单链末端。端粒的功能为稳定染色体末端结构，防止染色体间末端连接，并可补偿滞后链5末端在消除RNA引物后造成的空缺。复制使端粒5末端缩短，而端粒酶可外加重复单位到5末端上，结果维持端粒一定长度。端粒酶是一种催化合成含有约150个碱基的RNA链的逆转录酶，它以酶中所含RNA为模板合成DNA的3末端（P427 图34-24），合成一个重复单位后酶再向前移动一个单位。在动物生殖细胞中，由于端粒酶的存在，端粒一直保持着一定的长度，体细胞随着分化而失去端粒酶活性。在缺乏端粒酶活性时，细胞连续分裂将使端粒不断缩短，短到一定程度即引起细胞生长停止或凋亡。端粒在决定细胞寿命中起重要

16、作用，经过多代培养老化的细胞端粒变短，染色体也变得不稳定。然而，主要的肿瘤细胞中均发现存在端粒酶活性，因此设想端粒酶可作为抗癌治疗的靶位点。9-2 DNA的损伤修复DNA复制过程中可能产生错配，DNA重组，基因的整合等都会局部破坏DNA双螺旋结构。某些物理化学因素，如紫外线，辐射和化学诱变剂等都能使DNA结构和功能破坏，从而引起生物突变、致癌甚至死亡。为此生物已进化了如下一些保护自己，修复损伤DNA的系统。（一）错配修复：识别错配位点以及“新”“旧”链，将错配新链切除并加以修复。如E. coli体内有一种甲基化酶，使DNA序列中腺嘌呤N6位甲基化（可维持数分钟），发现错配碱基，即将未甲基化的新

17、链切除。E. coli参与错配修复的蛋白质至少有12种。（二）光复活修复（直接修复）：它分解紫外线引起的嘧啶二聚体。光照下光复活酶激活，分解嘧啶二聚体，如P429 图34-28。这种修复对植物特别重要，高等动物没有。（三）切除修复：在一系列酶作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成切去的部分，然后使DNA恢复正常。是比较普遍的修复机制，有多种酶参加，见P430 图34-29。切除修复若有关酶缺乏，可导致癌症，如紫外线引起的DNA损失若不能修复，会出现皮肤癌。 切除修复为复制前修复。（四）重组修复：为复制后修复。当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位先复制再修复，如P

18、430 图34-30所示。复制时遇损伤部位先跳过去，在子代链对应损伤处先留下缺口，然后从另一条完整DNA母链上将相应核苷酸序列片断移至子链缺口处，最后再用合成的序列来补上母链的空缺。也有一系列酶参加。（五）应急反应（SOS）和易错修复：上述DNA损伤修复功能可以不经诱导而发生。而许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理却能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应。SOS反应包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制等。细胞癌变可能与SOS反应有关。 SOS反应是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，为求生存而出现的应急效应。SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复和易产生差错的修复两类。易产生差错的修复会导致变异，变异一方面有利于生物进化，另一方面可致癌。大多致癌因素如X-射线，黄曲霉素等都能在细菌中诱导产生SOS反应，由此可根据细菌的SOS反应检测对动物诱发肿瘤的致癌物。9-3 DNA的突变 DNA作为遗传物质有三个功能：复制，转录和变异（包括突变和遗传重组）。（一）突变类型：（1） 碱基对置换：原来一个碱基被另一碱基