CGRP和NGF对全脑缺血再灌注大鼠脑组织PKB表达的调节作用

1、CGRP和NGF对全脑缺血再灌注大鼠脑组织PKB表达的调节作用         08-10-16 15:26:00     作者：邢雪松，吕威力，臧晋    编辑：studa20【摘要】  研究大鼠脑缺血再灌注后蛋白激酶B（protein kinaseB, PKB）的表达，探讨降钙素基因相关肽（CGRP）和神经生长因子（NGF）对脑组织缺血再灌注的保护作用及机制。方法：根据Nagasawa线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉栓塞(MC

2、AO)模型,采用电镜、免疫组织化学SABC法及显微图像分析检测海马及皮质内PKB的表达。结果：大鼠缺血再灌注海马及顶叶皮质内PKB反应产物较正常组增多(P<0.05),而注射CGRP或NGF后阳性产物明显高于缺血再灌注组(P<0.01),二者联合应用效果更加显著(P<0.05)。结论：CGRP及NGF参与缺血神经元PKB的调节,二者对缺血神经元有协同修复作用。 【关键词】  蛋白激酶 神经生长因子：To investigate the expression of protein kinase B(PKB) in hippocampusafter regional c

3、erebral ischemia and reperfusion in rats, explore the protective effects and mechanism of calcitonin and generelated peptide(CGRP) and nerve growth factor(NGF) on brain tissue.Methods：An novel model of regional cerebral ischemia and reperfusion induced by middle cerebral artery occluded (MCAO)in rat

4、s was modeThe expression of PKB in hippocampus and cortex was detected with electron microscope,SABC immunohistochemical method and analyzed by microimage system. Results：The expression of PKB in hippocampus and cortex was increased after cerebral ischemia and reperfusion(P<0.05)ompared with this

5、, the percentage of PKB immunoreaction positive cells in CGRP or NGF group were higher (P<0.01)The combined usage of CGRP and NGF enhanced such effects(P<0.05).Conclusion：The results indicate that CGRP and NGF participate in the regulation of expression of PKB in ischemic neurons,and they may

6、cooperate with each other.calcitonin generelated peptide; nerve growth factor; protein kinase B; hippocampus; neuron ischemia    脑缺血导致神经元坏死变性、迟发性神经元死亡和（或）凋亡，其机制十分复杂，至今尚不完全清楚。降钙素基因相关肽（calcitonin generelated peptide, CGRP）是于1982年第一个利用基因重组技术发现的活性多肽，由37个氨基酸组成，广泛存在于神经组织，具有改善脑血流及神经保护作用1。神经生

7、长因子（nerve growth factor, NGF）作为中枢神经系统中最重要的生物活性物质，可控制神经细胞存活的数量和分化，维持成熟神经元的存活，参与受损神经元的修复。此外，NGF可以增强CGRP的表达，刺激CGRP的合成2,3。近年来，许多研究表明，蛋白激酶B(proteih Kinase B,PKB)在脑缺血再灌注损害的病理生理机制中可能扮演重要角色4。本实验通过检测PKB的表达，来研究CGRP和NGF对脑缺血再灌注的保护作用及其机制。    1材料与方法1.1脑缺血再灌注模型与分组健康雄性Wistar大鼠30只，体重300350g，由沈阳医学院实验动物

8、中心提供。分设假手术组、缺血再灌注组、NGF组、CGRP组、NGF与CGRP合用组(N&C组),每组6只大鼠。根据Nagasawa线栓法制作右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，实验大鼠以0.4%戊比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉。将大鼠固定于手术操作台,作颈前正中切口,游离出右侧颈总动脉、颈内、外动脉后结扎颈总动脉和颈外动脉起始部,于颈总动脉分叉部下方剪一小口,将一预先烧成圆头的尼龙线插入颈内动脉,向上至遇到轻微阻力为止(一般线的头端已达大脑中动脉起始部)以栓塞血管。由颈总动脉分叉部起始,其插入的深度平均为(20.5±0.5)mm。栓塞90 min后回抽出线栓约10 mm

9、,恢复再灌注。其它各组分别向颈动脉内注入NGF（500 U/ml，0.5ml）、CGRP（2g/ml，0.5ml）、CGRP（2g/ml，0.5ml）和NGF（500U/ml，0.5ml）30min注射完。此后分别于24 h后处死取材。手术过程中常规检测肛温,使肛温保持在(37.0±0.5)。大鼠术毕清醒后,观察其行为学变化,按ZeaLonga评分标准将动物的行为变化分为5级:0级,行为无明显变化;1级,左前肢屈曲,左后肢伸展;2级,有左侧追尾现象;3级,行走困难,摇摆不定;4级,意识不清。将1、2、3级动物定为模型成功大鼠,0、4级弃去不用。假手术组仅夹闭右侧颈总、颈外动脉以中断血

10、流90min,术后未见行为异常。用4%多聚甲醛灌注，常规冰冻切片。1.2电镜实验结束后,将各组大鼠断头处死,迅速取出海马,按电镜样品取材要求,3%戊二醛、1%锇酸双固定,常规包埋,光镜选区,制备超薄切片,铀、铅双染,100CX 型透射电镜观察。1.3免疫组织化学染色脑的冠状切面冰冻切片，片厚12m。常规HE染色,光镜下观察假手术组及缺血组的组织学变化，采用免疫组化SABC法检测大脑皮质及海马PKB的表达。多克隆PKB抗体（兔抗大鼠，Santa Cruz,中国Boster公司代理）以1：100稀释，按SABC试剂盒（Boster公司）说明操作。阳性对照实验磷酸验缓冲液代替一抗进行免疫组化染色。用

11、图像分析仪取每张切片每个部位各测5个相同单位面积的平均灰度值。1.4统计学方法数据采用t检验并进行统计学处理。    2结果2.1电镜假手术组大鼠海马神经元核比较大、呈圆形或椭圆形,核膜清晰、完整,核质电子密度低,常染色质多,呈细颗粒状,分布均匀,核仁呈网状,居中;胞质内细胞器丰富,线粒体呈椭圆形或杆状,粗面内质网(RER)散在分布,结构清晰。缺血再灌注组可见核染色较浅,核仁增大且致密,胞质水肿,线粒体肿胀、嵴断裂,基质电子密度增高,粗面内质网脱颗粒;轴突内线粒体空泡样变,髓鞘分层、散乱。神经元胞体水肿,核膜断裂、模糊不清或崩解,异染色质增多,核仁浓密,胞质内线粒体外膜模糊、不连续,嵴断裂、溶解、消失呈空泡化,内质网水肿、扩张、脱颗粒。有的神经元部分核膜清晰,核周隙增宽,部分核膜溶解,染色质呈团块状凝集,核仁碎裂;胞质内细胞器明显减少而致电子密度变低,残存的线粒体崩解呈空泡状,但尚可辨认;内质网减少,神经丝增多,出现细胞凋亡。2.2免疫组化染色及定量分析结果正常组，PKB在顶叶皮质(Brodmann分区第4区)及海马CA1区细胞核内无表达，胞浆内极少表达；I/R组，PKB表达较sham组有所增加（P<0.05）；CGRP组和NGF组，大脑皮质及海马PKB表达较I