T载体与目的基因连接

1、重组的DM分子是在DM连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统 中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接 酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DM连 接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连 接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体D7A 连接酶浓度或増加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化 DNA连接反应分为3步：首先，T4 DNA连接酶与辅因子ATP形成W-ATP复

2、合物；然 后，酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'軽基切口的D对上，使DNA腺昔化; 最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断 相连。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3'端加上一 个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载依，载体每条链的3'端带有一 个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对, 在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的 重组载体。连接反应的温度在37T时有利于连接酶的活性。但是在这

3、个温度下粘末端的氢键 结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16£,连接12-16h （过夜），这样既 可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。二.感受态制备原理细菌在0 ° C CaC4低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易 吸收外源DNA的感受态。三.B-半乳糖甘酶显色反应选择法LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码B半乳糖核昔酶。半乳糖核昔酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解.用X-Gal为底物 进行染色时，呈蓝色。现在一些待定的质粒（比如pUC/PBS等），常带有B-半乳糖核昔酶的调控序列 和B半乳糖核昔酶N端1

4、46个氨基酸（a肽段）的编码序列，在这个编码序列里还 插入一个多克隆位点（HCS），它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有 B半乳糖核昔酹C端部分序列（0肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这 些质粒与大肠杆菌各自编码的卩一半乳糖核昔酶片段都没有酶的活性。只有当携带a 肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质 粒能够合成B半乳糖核昔酶N端（a肽段），这样就与宿主细胞合成的半乳糖 核昔酶C端部分序列（B肽段）互补，形成完整的B半乳糖核昔酶活性蛋白。而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能 表达，从而不能合成B

5、半乳糖核昔酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过a 互补合成B半乳糖核昔酶，分解培养基里的色素底物X-gal,最终形成蓝色的化合 物，出现蓝色菌斑。实验准备：清洗，5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶, 接种环，涂布棒。准备100ml超纯水。溶液:LB300ml（液体50ml+50ml,固体100ml）,0. lmol/L CaC12 10ml, lOOmg/mlAmp 1 ml, 20mg/mlX-gal 1 ml, 200mg/ml IPTG 1 ml o大肠杆菌菌液lml。感受态细胞连接产物4管4x5= 20ul 做 4 份目的基因T载体T4连接酶10x冲

6、液4 x 4uL4xluL4x0. 5uL4xluL灭菌：5个lOOnd锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种 环，涂布棒，10ml超纯水，LB培养基 1.5mlEP管，大小枪头，过滤用具2副0. lmol/L CaC12实际配置20mg/ml X-gal X-gal为5-漠-4-氯-3引喙-B-D半乳糖昔。用二基甲醜 胺（DMF）溶解X-gal配制成的20mg/ml （取0. 02gX-gal,用DMF定容为lml）的贮存 液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光 照而被破坏，并应贮存于-20X：o X-gal溶液无须过滤除菌。（DMF二

7、甲基甲酰胺； Dimethylfo r mam ide； NtNDi methyl formamide； DMF； CAS： 68-12-2 理化性质：无色、 淡的胺味的液体。分子式C3-H7-N-0o分子量73. 10。相对密度0.9445（25°C）。熔点 -61°Co沸点152. 8°Co ） 溶于DMSO,溶解度可达20mg/mlo也溶于DMF溶于DMSO, 溶解度可达20mg/mlo也溶于DMF200mg/ml IPTG在0. 8ml蒸榴水中溶解0. 2g IPTG后，用蒸馆水定容至lml,用 0. 22u m滤器过滤除菌，贮存于-20。（2。LB培养基

8、：配制每升培养基，应该在950 ml去离子水中加入：腹化蛋白腺10g酵母提取物 5g NaCl 10R揺动容器直至溶质溶解用5mol/LNa0H调pH至7. 3用去离子水定容至 1L在15psi高压下蒸汽灭菌20min. （ 100mlLB培养基加入15g琼脂粉为固体培养 基）0. lmol/LCaC12:取0. 11098g氯化钙固体定容至10mlAmp （lOOmg/ml）:溶解0. lg氨节青霉素钠盐于足量的水中，最后定 容至lml,用0.22 m m滤膜过滤除菌.实验过程（一）.目的基因片段与载体连接器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双 面离心管架，台式

9、离心机，干式恒温气浴。试剂T载体，T4 DNA连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water。操作步骤PCR产物与T载体直接连接：（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在1416。C。（2）取4个灭菌的200ul M量离心管，加入：（需要调整）4ml目的基因； lml T 载体；0.5ml T4 DNA 连接酶（TAKARA, 350U/ul） ； lml 连接酶缓冲液 10 x buffer ； 3. 5 ml dd Water 总量 10ml 体系。（3）述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14° C干式恒温仪（或14° C 水中）中保温过夜（12-16h） &l

10、t;>（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4° C冰箱备用。（二）大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化仪器：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml微量离心管， 1.5ml微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计， 超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培 养皿（已铺好固体LB-Amp），酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过 滤器试剂：E. coli 粛护,LB 培养基,0. 1 mol/L CaC12 溶液，无菌 dd Water , LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌dd water, IPTG,

11、 X-galo步骤（1）在超净工作台中，将lml大肠杆菌菌液加入100ml LB液态培养基（不含 抗菌素），37X2摇床培养过夜。（2）取0.5ml上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37°C下 250r/min 摇床培养 2'3h,测定 0D590 为 0. 35、0. 4 左右（<0.40.6,细胞数<108/mL, 此为关键参数！）。（注意：此步摇菌的时候，要有一管不加菌的LB培养液同时摇 菌）（3）将lml菌液加入到4支1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置 10min,然后于 4°C, 5000rpm 离心 5min。（

12、4）将离心管倒置以倒尽上清液，加入lml冰冷的0. 1 mol/L CaC12溶液， 立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。（5）4乜，5000rpm离心5min,弃上清液后，用100 u L冰冷的0. 1 mol/L CaC12 溶液垂悬，插入冰中放置2h,可以直接用作转化实验，或立即放入-4摄氏度冰柜中 保藏。（6）事先将恒温水浴的温度调到42弋。（7）从-70£超低温冰柜中取出一管（100 PL）感受态菌，立即用手指加温融 化后插入冰上，冰浴5、10min。（8）加入5uL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng）,轻轻宸荡后敖 置冰上20min。（9）轻轻摇匀

13、后插入42乜水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，靜置 3min。（10）在超净工作台中向上述各管中分别加入300 p L LB培养基（不含抗菌素） 轻轻混匀，然后固定到揺床的弹簧架上37乜宸荡lh。（11）在超净工作台中取上述转化混合液200 uL,分别滴到含合适抗菌素（Amp 100ug/L）的固体LB平板培养皿中，再在平板上滴加40 pL 20mg/ml X-gal, 7 u L 200mg/nil IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：一个不含抗生素作为 对照组，玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂，菌液涂皿操作时， 应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞

14、壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使 细胞破裂，影响转化率。）。（12）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37X：恒温培养箱中30min直到表 面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来敖入37乜恒温培养箱过夜。（13）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。（14）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌 斑O（三）转化克隆的筛选和鉴定器材旋涡混合器，小镶子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管， 双面离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台， 酒精灯，无菌牙签，摇菌管。试剂LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提取用试

15、剂，酶切需要 的限制性且酶及其缓冲液，65%甘油（65%甘油,0. lmol/LMgS04, 0. 025mol/L Tris Cl pH8. 0） o操作步骤 方法一：快速PCR筛选法（1）在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔 在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。（2）在0. 2ml PCR微量离心管中配制25u 1反应体系。dd water 16 u 110XPCR buffer （不含 MgC12） 2. 5 p 125mM MgC12 1. 5 U12. 5mmol/L dNTP 2 u 1 （每种 dNTP 终浓度 0加M）10 u mol/L Pr

16、imer 1 1 u 1 （12.525pmoles ）10umol/L primer2 1 u 1 （12.525pmoles）模板质粒 用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗Taq 酶 0.5U1 （ 1. 5u）总体积25 y 1（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序（本实验室已经设置为WZ）： 94°C5min 94°Clmin 60°Clmin 72°C IminSOsgoto29 times 72°C10min（2）PCR结束后，取10u 1产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片断同时比 对）。观察胶上是否有预计的主要产物带。（3）按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒（4）提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，以进 步确认。方法二：提质粒再PCR或酶切鉴定（1）在超净工作台中取3支无菌揺菌管，各加入3mL LB （含50mg/mL氨节青寄 素），用记号笔写好编号。（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小蹑子头用酒精灯烤过，镀取一支无菌牙 签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有 3mLLB