A群脑膜炎球菌荚膜多糖纯化工艺的优化.docx

1、.论著A群脑膜炎球菌荚膜多糖纯化工艺的优化陈作江，冯鹏，赵海平，冯佳丽，魏振洲，张宏兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州730046摘要：目的对A群脑膜炎球菌荚膜多糖纯化工艺的关键步骤进行分步研究,优化每一步工艺参数。方法优化十六烷基三甲基浪化铉的加入浓度、复合多糖的解离浓度和解离时间、不同厂家的苯酚、超滤和透析等工艺过程对荚膜多糖的影响。结果十六烷基三甲基浪化铉质量体积终浓度0.10%(w/v)沉淀效果更好，纯化获得的英膜多糖产量更高相对分子质量更大。复合多糖解离浓度越高,纯化获得的荚膜多糖相对分了质垦越小。延K复合多糖解离时间有利于提高荚膜多糖产最。不同厂家的

2、苯酚、超波和透析等工艺对荚膜多糖的产量和分子大小没有影响。结论现行A群脑膜炎球菌英膜多糖纯化工艺复杂,优化后的工艺提高了英膜多镭产量，缩短了工艺用时，增加了工艺稳定性。关键词:脑膜炎球菌;荚膜多糖;纯化工艺;优化;稳定性中图分类号：R378.1+5文献标志码：ADOI：10.I3309/ki.pmi.2014.05.007OptimizationofpurificationprocessforcapsularpolysaccharidefromgroupAMeningococcusCHENZuo-jiang,FENGPeng,ZHAOHai-ping,FENGJia-ii,WEiZhen-zh

3、ou,ZHANGHongLanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Hd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Ixinzhou730046,GansuProvincetChinaCorrespondingauthor；CHENZuo-jiang,Enuiil：zjchenAbstract:ObjectiveKeyprocessesofpurificationtechnologyforcapsularpolysaccharidefromgroupAMeningococcuswerestudie

4、dstepbystepsoastooptimizeparametersinprocess.MethodsFinalconcentrationofCTAB,dissociationtimeandconcentrationofcompoundpolysaccharide,phenolofdifferentmanufacturesandtechniquesusedinultrafiltrationanddialysiswereoptimized.ResultsToobtainaminimumKbvalueandhigheryieldofpolysaccharide,thefinalconcentra

5、tionofCTABwitha0.1%(w/v)isselected.Higherconcentrationfordissociationofcompoundpolysaccharidemakesasmallermolecularsizeforcapsularpolysaccharide.Extendeddissociationtimeofcompoundpolysaccharideisbeneficialtoimprovetheyieldofcapsularpolysaccharide.Phenolfromdifferentmanufacturesandtechniquesusedinult

6、rafiltrationanddialysismakenodifferencestomolecularsizeandyieldofcapsularpolysaccharide.ConclusionTherearemanystepsintheconventionalpurificationprocessofcapsularpolysaccharidefromgroupAMeningococcus.ItisbyoptimizedparametersinprocessofpuriGcationthattheyieldofcapsularpolysaccharideisimproved,thetime

7、isshortenedandconsistenceofprocessisincreased.Keywords:Meningococcus；Capsularpolysaccharide；Purificationtechnology;Optimization；Stability脑膜炎球菌是流行性脑脊髓膜炎(流脑)的病原菌，荚膜多糖是其主要的保护性抗原和毒力因子,也是细菌性疫苗最重要的靶抗原之一，其分离纯化是制备疫苗的首要步骤"。中华人民共和国药典三部(2010版)对A群作者简介：陈作江，学士，医学生物学工程师，主要从辛细菌性疫苗的生产和科研工作。通讯作者：陈作江,Email:zjchen

8、Q脑膜炎球菌荚膜多糖的纯化工艺做出了明确规定,主要包括菌体离心，加入十六烷基三甲基漠化铉(Cetavlon,CTAB)沉淀获得复合多糖,高盐离子浓度解离复合多糖，乙醇分级沉淀,苯酚抽提去除蛋白质等步骤按照A群脑膜炎球菌荚膜多糖纯化工艺规程,采用分段分析研究的方法，优化了各个步骤的纯化参数对A群脑膜炎球菌荚膜多糖产量和分子大小的影响。1材料与方法11材料1.1.1 试剂琼脂糖SepharoseCL-4B为GE公司产品。盐酸羟胺、三麻化铁、氢氧化钠、盐酸、浓硫酸、高氯酸、钥酸铉、抗坏血酸、氯化钠均为分析纯，均购自国药化学试剂有限公司。十六烷基三甲基漠化铉为分析纯，购自上海试剂一厂。氯化钙为药用级，

9、购自中国医药集团化学试剂有限公司。苯酚为药用级，购自中国医药集团化学试剂有限公司（国药）和北京益利精细化学品有限公司（益利）。112仪器层析系统Purifier10购自GE公司。紫外分光光度计UV-1800购自SHIMADZU公司。碟片式分离机购自WESTFALIA公司。沙培分离机购自ALFALAVAL公司。Cryofuge6000i大容量离心机购自Thermo公司。1QK超滤膜购自MILL1PORE公司。MWC010000透析袋购自Spectrum公司。1.2方法A群脑膜炎球菌荚膜多糖的制备A群脑膜炎球菌发酵液经过碟片式分离机17000xg离心去菌体，加入CTAB至质量体积终浓度0.10%0

10、.15%（w/v）,冷库静置20h。沙培分离机21000xg离心获得夏合多糖，复合多糖用1moI/L氯化钙溶液解离1h,加入乙醇至终浓度25%,冷库静置20h,l500xg离心1h去核酸。加入乙醇至终浓度80%,1500xg离心30min离心获得粗糖，粗糖经过三次苯酚抽提去除蛋白质，苯酚抽提上清液经过透析或超滤去除残余苯酚后获得精糖。1.2.2分子大小的检测A群脑膜炎球菌荚膜多糖粗糖按照4mg/mL溶解过夜,0.45jim膜过滤后进行SepharoseCL-4B凝胶柱层析,洗脱液0.2mol/L氯化钠，pH7.0o流速0.35mL/min,于206nm、260nm.280nm三波长监测，以3m

11、L/管分布收集，分别以4825和4地对每管的磷含量和氧乙酰基含量进行检测，以必25或4汹为纵坐标,匕值为横坐标作图，得出粗糖的值。A群脑膜炎球菌荚膜多糖精糖按照4mg/mL溶解过夜,SepharoseCL-4B凝胶柱层析，洗脱液0.2mol/L氯化钠，pH7.0。流速0.35ml/min,以206nm波长检测，通过206nm的保留时间（第二峰保留时间）得出精糖的匕值。1.2.3不同浓度CTAB对荚膜多糖产量和分子大小的影响A群脑膜炎球菌荚膜多糖生产工艺规程中规定加入CTAB的质量体积终浓度为0.10%0.15%,为了确定CTAB的最适浓度，将20I，发酵液平均分成4份，每份5L,分别加入CTA

12、B质量体积终浓度为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%，分别纯化获得荚膜多糖，称M并检测、值。1.2.4复合多糖解离浓度对荚膜多糖产量和分子大小的影响复合多糖解离时需要高离子强度，一般是用1mol/L的氯化钙溶液解离复合多糖，但没有对解离时复合多糖本身的浓度做出规定，现行的A群脑膜炎球菌荚膜多糖工艺规程中仅仅是以发酵罐培养量的0.5%1.0%计算，由于每批复合多糖的产量不同，导致每批复合多糖的解离浓度差异很大。实验以同批次的复合多糖为基础，以1mol/L的氯化钙为解离溶液，分别验证50mg/mLJ00mg/mL、150mg/mL、200mg/mL、250mg/mL、300mg/mL共

13、6个解离质量浓度,纯化获得荚膜多糖后，并称量及检测其值。1.2.5复合多糖解离时间对荚膜多糖产量和分于大小的影响复合多糖的解离需要一定的作用时间,现行的A群脑膜炎球菌荚膜多糖生产工艺规程中规定解离时间为1h。实验以1mol/L的氯化钙为解高溶液，以100mg/mL的复合多糖为解离质量浓度,分别验证解离1、6、2。h对荚膜多糖产量和分子大小的影响。12.6不同厂家的苯酚去除蛋白质效果的对比在现行生产工艺中，A群脑膜炎球菌荚膜多糖精制时，使用苯酚抽提去除蛋白质。为确认不同厂家的苯酚去除蛋白质的效果，以及苯酚对荚膜多糖分子大小的影响程度，在荚膜多糖精制时分别使用国药和益利两个厂家生产的苯酚进行5次对

14、比试验，每个样品苯酚抽提3次后用0.5tn?的10K超滤膜超滤,0.5mol/L氯化钙清洗4次。1.2.7超滤法与透析法去除残余苯酚效果的对比中华人民共和国药典三部（2010版）对A群脑膜炎球菌荚膜多糖纯化去除残余苯酚推荐使用超滤法和透析法,为了比较两种方法的差异,分别对同一批样品采用透析法和超滤法去除残余苯酚的效果进行5次对比研究。超滤样品苯酚抽提3次后用0.5m2的10K超滤膜超滤,0.5mol/L氯化钙清洗4次。透析样品苯酚抽提3次后用MWCO10000的透析膜透析4次,0.5mol/L氯化钙作为透析液。1.2.8不同超滤盐溶液去除残余苯酚效果的比较超滤时提高盐离子浓度有利于更快地去除残

15、余苯酚和小分子蛋白质。在现行生产工艺中，A群脑膜炎球菌荚膜多糖超滤时使用0.5mol/L的氯化钙溶液。为了对比不同盐溶液去除残余苯酚的效果.实羚分别使用0.5mol/L的貌化钙溶液和Imol/L的筑化钠溶液对同一批的英膜多糖进行对比试脸。2.1不同浓度CTAB对美膜多糖产量和分子大小的影响*CTAB质呐体积终浓度为0.10%时，所获炎膜多慵粗糖产蜡最高，但CTAB的浓度并不是越高越好,高浓度的CTAB会沉淀更多的菌体碎片等物质。试验中，当CTAB质此体枳终浓度为0.15%和0.20%时，出现CTAB沉淀复合多糖产置虚高的表象,从值来看，当CTAB质ht体积终浓度为0.10%时，获得的荚膜多糖匕

16、值小，峰型更好，见表1。表1CTAR加入终浓度对荚膜多情的影响2.2及合多糠解高浓度对荚膜多糖产量和分子大小的影响巾表2所列可见，随着岌合多糖解离浓度的增高.英膜多糖产ht有逐渐降低的挡势。可能过高的岌合多糖解离质呐浓度导致乙醇沉淀时损失r更多的荚膜多糖随监复含多傩解离质林浓度的增高,值也有增大的趋势，见图1；其中复合名糖解离质代浓度为KM)mg/niL时，解离后纯化获得的英膜多糖、值最小，虬=0.32。可见，在荚膜多糖解离时，荚膜多糖本身的浓度不能太高。Tab.1ofthefinalcoiurntrationof(7i'ABonthe<*a|>sular|M>lys

17、accliari(14*CTAB终浓度()复合多械产fit(g)粗慵产ft(g)K”0.0510.000.150.240.1017.003.250.240.1520.002.970.260.2020.0()3.040.29O.(M>(HIS».770.K50.130.21().20()370.450.S3<).6i0.69*2址合多艄解高质缺浓度对英膜多慵产砒的唆响发合名惦解肉质ht浓度(mg/ml.)50100150200250300岌合多糖择)100.00100.00100.00100.00100.00100.00m«(g)16.3416.1016.()41

18、5.8415.0415.27Tab.2EffectofdisR>cialionmassconcentrationofcompoundpolyuccharideontheyieldofcapsularpolysaccharideI.HOI.(101.101.20W1.01)V<>.»()0.600.141().20<HX)图1岌合多糖解肉质址浓度对英膜多械分了大小的影响Fig.1Effectofdisscx-iationmassconcentrationofcompoundpolysaccharideonthemolecularsizeofcapsularpol

19、ysaccharide2.3复合多糖解离时间对荚膜多糖产量和分子大小的影响解离1、6、20h对纯化获得的荚膜多糖分子大小影响不大，但解离时间越长,纯化获得的荚膜多糖产量越高，见表3。2.4不同厂家的苯酚去除蛋白质效果的比较试验利用国药和益利两个厂家的苯酚纯化获得的同一批荚膜多糖的蛋白质含量全部合格，检测结果全部小于检测限，没有显著差别，见表4。表3复合多糖解离时间对荚膜多糖的影响Tab.3Effectofdissociationtimeofcompoundpolysaccharideonthecapsularpolysaccharide复合多慵解离时间(h)荚膜多糖产量X(g)19.490.3

20、769.730.402010.860.40表4不同厂家苯酚对荚膜多糖的影响Tab.4Effectofthedifl'erentmanufacturesofphenolonthecapsularpolysaccharide试验次数精提批号苯酚厂商4值蛋白质含量第1次H精-20120703-1益利0.32合格H精-20120703-2国药0.33合格第2次H精-20120801-1益利0.33合格H精-20120801-2国与0.34合格第3次H精-20121004-1益利0.30合格H-20121004-2国药0.28合格第4次H精-20121006-1益利0.32合格H精-201210

21、06-2国药0.31合格第5次H精-20121007-1益利0.28合格H精-20121007-2国菊0.29合格2.5超滤法与透析法去除残余苯酚效果的比较超滤法和透析法二者去除残余苯酚的效果相同,且均对荚膜多糖分子大小没有影响，见表5。这表明超滤时的剪切力很小;透析法所需时间较K,需48h以上，操作不便；而超滤法操作方便，耗时较短仅需要4h°从工艺用时的角度考虑,超滤法比透析法更优。2.6不同超滤盐溶液去除残余苯酚的效果及对荚膜多糖分子大小的影响试验发现无论是使用1mol/L的氯化钠溶液，还是使用0.5mol/L的氯化钙溶液超滤，两者去除残余苯酚的效果无差异,且均对荚膜多糖的分子大

22、小没有影响(见表6)。表5超滤法和透析法对荚膜多糖的影响Tab.5Effectofultrafiltrationanddialysisonthecapsularpolysaccharide透析法超滤法原液批号L残留苯酚原液批号Kd残留苯酚B-20101201-10.31合格B-20101201-20.31合格B-20110202-10.32合格B-20110202-20.32合格B-20110501-10.31合格B-20110501-20.32合格B-20110601-10.32合格B-2011060I-20.30合格B-20I10803-10.33合格B-20110803-20.29合格B

23、-20110901-10.32合格B-20110901-20.33合格B-20111102-10.34合格B-20111102-20.29合格B-20!11202-10.35合格B-20111202-20.32合格B-2O12O1O1-10.34合格B-20120101-20.35合格表6超滤盐溶液对荚膜多糖的影响Tab.6Effectofthesaltsolutionforthetechniqueofultrafiltrationonthecapsularpolysaccharide精精批号超滤用盐溶液残留苯酚kH精-20120901-21mol/L氯化钠合格0.320.5mol/L氯化钙合

24、格0.32H精-201209021mol/L氯化钠合格0.300.5mol/L氯化钙合格0.32H精-20120904-11mol/L氯化钠合格0.330.5mol/L氯化钙合格0.31H精-201209061mol/L氯化钠合格0.310.5mol/L氯化钙合格0.303讨论CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多糖的特性，已经广泛的用于从多种细菌培养上清液中沉淀荚膜多糖。它的沉淀作用与浓度、pH值、温度等因素有关。有报道指出CTAB浓度越高，荚膜多糖沉淀效果越好;温度越高，沉淀效果越差。试验发现,CTAB的浓度并不是越高越好，增加CTAB的浓度是否能增加荚膜多糖产

25、量不能以复合多糖的产量为准，而应该以纯化后抽干的荚膜多糖产量为准，过高的CTAB浓度并不能增加荚膜多糖产量，而且CTAB浓度过高会增加复合多糖解离的难度。以往复合多糖的解离大多只关注解离时的盐浓度，但忽略了复合多糖本身的浓度和复合多糖解离的时间，其实这3个因素之间的关系是一致的。解离时的盐浓度要以复合多糖的浓度和解离时间为基础，不能单纯以离子强度的大小来衡量。试验发现解离时复合多糖本身的浓度不能太高，复合多糖浓度越高，荚膜多糖分子则有变小的趋势，可能是因复合多糖浓度过高，而盐浓度相对不足，导致高分子的荚膜多糖没有解离。超滤是一种膜分离过程,利用膜表面孔径机械筛分作用,在外界推动力（压力）作用下截留溶液中相对分子质量较高的物质，而小分子的溶质透过膜的分离过程：5-6Jo超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，尤其是超滤技术的实验条件温和，不易引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的降解。与透析法比较，超滤法简化了A群脑膜炎球菌荚膜多糖去除残余苯酚的工艺，同时缩短了工艺用时c历来都认为超滤时机械剪切力会对荚膜多糖的分子大小造成影响，而试验发现超滤时机械剪切力对A群脑膜炎球菌荚膜多糖的分子大小没有影响。参考文献赵精，章以浩,李河民.