一株鸡传染性支气管炎病毒地方分离株膜蛋白基因的遗传变异分析.docx

1、中圈食孝通掘2009,25(12):10-13ChineseAgriculturalScienceBulletin株鸡传染性支气管炎病毒地方分离株膜蛋白基因的遗传变异分析闫芳，岳文斌，吉文汇，李绪英，赵宇军，刘娟，刘风波，吴倩，任家琰,化丽珍(山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801)摘要：对从山西省分离到的1株IBV(IBVSX16)的膜蛋白基因片段进行序列测定及分析，结果发现，IBVSX16株膜蛋白基因含有一个长681bp的ORF,编码226个氨基酸残基组成的多肽，与疫苗株H120和中国分离株LX4推导的氨基酸序列比对发现，存在基因突变现象，未发现缺失和插入现象，变异主要发生在217

2、位。系统进化关系显示19株IBV毒株分属于5个群oIBVSX16株位于第II群，中国IBV分离毒株主要集中在第III群和第IV群，具有较明显的地理区域性，可见IBV分离株在基因进化关系上形成了自己较为独立的进化群。关键词：鸡传染性支气管炎病毒;M基因；遗传变异中图分类号:S855.3文献标识码:AGeneticVariationsofMembraneGeneofInfectiousBronchitisVirusStrainsIsolatedinShanxiProvinceYanFang,YueWenbin,JiWenhui,LiXuying,ZhaoYujun,LiuJuan,LiuFengb

3、o,WuQian,RenJiayan,HuaLizhen(CollegeofAnimalScienceandTechnologyShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801)Abstract:Menibrane(M)proteingeneof1BVSX16strainisolatedinisolatedinShanxiwassequencedandanalyzed.TheresultsshowedthattheMgeneofisolatewascomposedof681nucleotides,encodingpolypeptideof226ami

4、noacidresidues.VariationsofthededucedaminoacidsofMgenemainlyoccurredatpositions2to17,deletionandinsertionwasnotfoundintheNgeneofIBVSX16comparingwiththatoftheIBVstrainsH120andLX4.AphylogenetictreebasedonaminoacidsequencesofMgeneofthe19IBVstrainsshowedthatthesestrainswereclassifiedintofivedistinctclus

5、ters.IBVSX16strainwasinclusterIII.MostoftheChineseIBVstrainswereincludedinclustersIIIandIV»formingdistinctphylogeneticgroupsinChina.Keywords：infectiousbronchitisvirus,membranegene,geneticvariation0引言鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(IBvirus,IBV)引起的一种急性高度接触性传染病，其感染的主要特征是气管啰音、咳嗽和打喷嚏。IB

6、V还口J以侵害鸡的肾脏、肌肉、输卵管和肠道等组织器官，造成感染鸡发生肾炎或产蛋母鸡的产蛋量以及蛋品质的下降，给养禽业造成严重的经济损失。IBV属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)第三抗原群的成员。其基因组为不分节段的单股正链RNAJBV含有4个结构蛋白：纤突蛋基金项目：山西省自然科学基金"【BV山西变异株基因型调查及其S、M和N基因试驶免疫研究"(20070110830)；山西高校科技研究开发项目“山西变异型鸡传染性支气管炎灭活疫苗的开发研究"(200611014)；山西农业大学博士后基金资助“鸡传染性支气管炎病毒山西地方

7、分离株S1及N基因遗传变异分析第一作者简介:闫芳.女，1966年出生，山西平遥人，博士后，副教授,主要从事动物传染病的诊断与防治研究。通信地址：030801山西太谷山西农业大学动物科技学院,TelE-mail:yanfang66l5通讯作者：岳文斌，男，1952年出生，教授，研究方向：动物遗传育种与繁殖。通信地址：030801山西太谷山西农业大学校办.TelE-mail：wb_yue.收稿日期:2009-03-03，修回日期:2009-04-13.白(Spike,S)、小膜蛋白(Smallenvelope,E)、膜蛋白(Membrane,

8、M)和核蛋白(Nucleocapsid,N)。M蛋白与病毒的复制有关,M蛋白在粗面内质网中聚集之处是病毒出芽位点,它能控制并介导病毒粒子从粗面内质网膜或高尔基体膜出芽，在病毒装配时与核衣壳相互作用而将其结合到囊膜上I。与N蛋白和S蛋白相比，其免疫原性最低叫然而也有报道认为M蛋白上存在着具有重要免疫原性的抗原决定簇叫近年来的研究表明,M基因与基因组的变异也有关系皿气笔者从山西地区疑似IB的病料中，分离到1株IBV,对其M基因的分子特征进行了分析,现将结果报告如下。1材料与方法1.1毒株IBVSX16株自山西省文水县某个体养鸡场发病鸡的肾脏病变组织中分离获得，由山西农业大学动物科技学院预防兽医实验

9、室分离和保存。1.2材料及试剂E.coli感受态细胞DH5a由实验室保存，克隆载体PMD18-T购自大连宝生物工程有限公司；DNAMarkerDL2000、DL15000、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、间DNA聚合酶、dNTP,RNA提取试剂盒,购自大连宝生物工程有限公司；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。1.3引物设计通过分析GenBank中发表的IBV核昔酸序列，设计IBVN基因特异性引物,序列如下：上游引物：5，一ATGTCCAACGAAACAAATTGTAC一3，；下游引物：5'-TTATGTGTACAGACTACTCCCTCCTG一3、

10、IBVM基因的RT-PCR扩增IBVSX16株尿囊腔接种911日龄SPF鸡胚，37C培养72h后(弃去24h内死亡的鸡胚)，无菌收集尿囊液，按RNA提取试剂盒说明书操作，提取病毒基因组RNAo溶于5gl0.01%DEPC水，加入5、AMVBuffer5四1,dNTP(2.5mmol/L)10jiL下游弓I物1四1，RNA酶抑制剂0.5似，反转录酶(AMV)0.5以,补加0.01%DEPC水，总体积为25以。室温静置10min后，将EP管放于42C水浴1h,取出后置冰上，冷却2min,即得到cDNAoPCR体系：10xPCRBuffer5pl,财酶0.25”l,dNTP4由，上、下游引物各1山，

11、反转录产物3可,补加双蒸水至总体积50讯,混匀。PCR反应参数设置为：94C预变性3min,94C变性40s,60C退火50s,72C延伸100s,30个循环后,72C再延伸10min,以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。1.4 M基因克隆与序列测定按照pMD18-T载体操作说明，把所得的RT-PCR纯化产物连接于PMD18-T载体，将连接产物转化DH5a感受态细胞。碱裂解法提取质粒，经PCR初步鉴定，随机选取3个阳性质粒委托北京博迈德生物有限公司进行核昔酸序列测定。1.5 IBVM基因核苻酸及其推导氨基酸序列的比较将获得的IBVM基因核昔酸序列用DNAStar软件参照GenBank中IBV毒株

12、N基因序列，确定IBV分离株M基因开放阅读框(openreadingframe,ORF)序列，然后将其与所选的参考毒株的M基因核昔酸序列及推导的氨基酸序列进行比较分析，所选参考毒株包括常用疫苗株、近年中国的部分IBV分离毒株及美国的国部分毒株共18株参考株(见表1),使用MegAlign(DNAStar)中的JotunHeinMethod方法绘制N基因氨基酸系统进化树。表118株IBV参考株及其GenBank登录号2结果与分析”段，将其克隆到PMD18-T载体，经PCR初步鉴定后进ReferencestrainOriginAccessionnumberReferencestrainOrigin

13、AccessionnumberH120VaccinestrainCRespirationType)AY028295GrayUSA(Kidineytype)AF363607H52VaccinestrainCRespirationtype)AF286185CU-T2USA(Variancestrain)U49858D41Vaccinestrain(Kidineytype)AY322367LX4XinjiangAY326960W93Vaccinestrain(Kidineytype)AY846835CK/CH/LHLJ/04VHeilongjiangFJ641062M41Vaccinestrain(

14、RespirationType)AF286184CK/CH/LGD/04IITGuangdongEF602447BeaudetteUSA(Respirationtype>AJ311362CK/CH/LSD/03IShangdongEE602457QXIBVShangdongAF221667SAIB20SichuangAY302749Ark99USA(Arkserotype)AY942740.1GX1-98China(Guangxi)AY325727HKVaccinestrainAY761141BJBeijingAY3196512.1IBV分离株M基因及推导氨基酸的变异分析行序列测定。结果

15、表明，IBVSX16株M基因的ORF应用RT.PCR扩增到了大小与预期相符的基因片序列由681bp组成，编码226个氨基酸残基组成的多-12-中在孝渔眼肽。以中国分离株LX4和疫苗株H120作为参考毒株，M基因推导的氨基酸序列进行比对，没有发现缺失和插入现象，但存在基因突变（点突变），与LX4和疫苗株H120M蛋白氨基酸主要差异见表2,变异主要发生在217位，其他区域较为保守，仅有个别氨基酸发生替换现象。此外JBVSX16株推导的M蛋白氨基酸序列含有9个高度保守的半胱氨酸,3个跨膜区主要位于25-40位、4973位和79100位，亲水性分析表明，M蛋白N端20个左右氛基酸为亲水性的，具有较强的

16、抗原性，C端的177201位有一段很强的亲水性氨基酸，含两个潜在的糖基化位点（NET和NCT）o表2IBVSX16株与参考毒株LX4和疫苗株H120M蛋白氨基酸主要差异比较分离株12131516173341464761859295113138151189205SX16SEAILIYRLLIFISGATAH120FESVELYKFLILVSEVIALX4SDAII.ISRVIVFIAEATT2.2M基因序列同源性及系统进化树分析将IBVSX16株与18株参考毒株的M基因核甘酸序列及推导纽基酸序列同源性进行，结果见表3JBVSX16株与参考毒株核昔酸及推导氨基酸的同源性分别为81.8%91.2%和

17、80.6-93.8%。根据推导的M蛋白氨基酸序列，可将这19个IBV毒株分成5个群（图1）。第I群由疫苗株及中国部分分离株组成,IBVSX16株位于第II群，第III包括美国Ark99、Gray及疫苗株HK。第IV群包括中国的部分分离株。美国变异株CU-T2与中国分离株亲缘关系较远，形成一个相对独立的进化群。注12HK、13LX4,14M4M5QXIBV,16SAIB20.3讨论IBVM蛋白是一种完整的糖蛋白，以N-糖昔键进行糖基化，M蛋白实际上是一种横跨囊膜的蛋白，它至少跨膜3次，它的C端在囊膜内侧与核衣壳相连，仅有一小部分（约10个）的N端暴露于囊膜外并被糖基化,形成N.连接的寡聚糖，它可

18、能形成抗原决定簇心。叫表3IBVSX16株与参考毒株的M基因核昔酸和氨基酸同源性比较（%）:1Ark99、2Beaudette3BJ、4CK-CH-LGD-04fIh5CKCHLHU-04V、6CK-CH-LSD-03I7CU-T2、8Gray9GX1-98、10H120.llH52、12345678910111213141516171*89.288.589.389.489.283.797.689.889.589.796.489.289.889.691.990.6292.0*84.487.386.796.283.889.097.895.498.289.188.698.487.888.187.0

19、391.689.4*93.593.286.482.288.485.886.685.589.787.985.892.885.391.3491.689.896.0*94.788.283.088.588.588.588.389.688.988.692.787.689.6591.288.594.797.888.983.089.688.388.388.290.588.388.594.987.989.6692.996.091.291.691.283.290.097.598.296.890.588.996.989.189.788.2779.979.28L982.482.481.4*83.386.082.48

20、5.384.481.685.483.679.681.8898.292.992.992.992.494.281.7*89.490.389.397.288.889.488.893.990.0992.996.091.291.691.299.681.494.295.699.089.788.688.51092.996.091.291.691.298.781.494.298.7*96.090.689.196.288.989.888.31192.996.091.291.691.298.781.494.298.798.789.689.199.989.288.588.11296.091.

21、592.492.492.993.382.196.993.393.393.3*88.789.789.992.389.41389.888.989.490.388.990.778.891.190.790.390.790.289.188.389.591.21493.496.591.692.091.699.181.994.693.890.789.588.688.21592.589.895.696.096.992.582.893.892.592.592.593.889.492.9*86.689.71692.590.388.190.389.491.677.993.891.691.69

22、1.692.490.392.089.4*89.41793.890.793.893.893.092.580.694.692.592.592.593.393.492.993.492.0*IBVSX16分离株的M基因ORF序列测定及分析结果表明，推导的M蛋白序列由226个氨基酸残基组成,含有3个保守的跨膜疏水区及9个高度保守的半胱氨酸，这对于维持M蛋白的结构及功能可能具有重要作用。现己确定M蛋白近N端有两个糖基化位点，而且M蛋白糖基化位点处的敏基酸序列（NCT）是高度保守9.2dD41H120W93H52_jCK-CH-LSD-031'GX1-98M41BeaudetteArkggGrayH

23、KLX4SX16SAIB20CK-CH-LGD-041111CK-CH-LHLJ-04V/QX1BVBJCU-T2*-III642NucleotideSubstitutions(X100)图1IBVSX16株与参考毒株M基因推导的氮基酸系统进化树分析的。IBVSX16株的M蛋白在N端形成两个糖基化位点，氛基酸序列不仅有NCT,还存在有NET,与参考毒株相比JBVSX16株M蛋白推导氨基酸序列的变异主要位于N端亲水区的2工位。亲水区与蛋白抗原位点的形成有密切关系，亲水区氨基酸的改变可能直接影响到M蛋白上的抗原决定簇，推测M基因核昔酸点突变导致的氨基酸碱基替代也可能是养禽场变异株流行的原因之一。与

24、参考毒株的M蛋白氨基酸序列进行比较发现，19株IBV毒株被分成5个群（图1）。从M基因氨基酸进化树上分析，中国1BV分离毒株进化关系较为独立，主要集中在第III群和第IV群,IBVSX16株与LX4属于同-群，核昔酸同源性和氨基酸同源性分别为91.2%和93.4%,这与该毒株S1和N基因分群结果是一致的。另外，中国部分分离毒株也存在于第I群中，与疫苗株亲缘关系较近，这可能与病毒在遗传衍化过程中由于各种选择压力（如疫苗的免疫压力）而发生了不同程度的变异有关他。可见，国内主要的1BV分离株M基因可能具有类似的起源，并在遗传衍化过程中由于选择压力（如疫苗的免疫压力）而发生了不同程度的变异。参考文献1

25、 BoursnellME,BrownTD,FouldsIJ,etal.Completionofthesequenceofthecoronavirusavianinfectiousbronchitisvirus".JGenVirol,1987,68:57-77.2 MastersPS.ThemolecularbiologyofcoronavirusesJj.AdvVirusRes,2006,66:193-292.3 CorseE,MachamcrCE.InfectiousbronchitisvirusEproteinistargetedtotheGolgicomplexanddirectsreleaseofvirus-likeparticlesJ.JVirol,2000,74(9):4319-4326.4 deHaanCA,RottierPJ.MolecularinteractionsintheassemblyofcoronavimsesJ.AdvVirusRes,2005,64:165-230.5 IgnjatovicJ,GalliL.Structuralproteinsofavianinfectiousbronchitisvims:roleinimmunityandprotcctionJ.AdvExpMedBio】,1993,342:449*453