唾液富组蛋白5表达载体的构建

1、唾液富组蛋白5表达载体的构建【摘要】 目的 将唾液富组蛋白5 cDNA克隆至表达载体pGEX4T1。方法 EcoR+ Sal双酶切克隆载体pMD19Thrp5及pGEX4T1，回收目的片段hrp5及双酶切载体pGEX4T1，将二者连接后转化大肠杆菌DH5，氨苄青霉素筛选阳性菌落，PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。结果 唾液富组蛋白5的cDNA正确克隆至表达载体pGEX4T1，无突变。 结论 重组载体pGEX4T1hrp5构建成功。 【关键词】 唾液富组蛋白5 克隆 表达载体 Construction of Expression Vector of Salivary Histatin 5 ZHOU

2、 Qi，JIN Kehua，LUO Desheng，et al (Students of Grade 2004, Xianning University Medical School，Xianning Hubei 437100，China) ABSTRACT：Objective To clone the cDNA of salivary histatin 5 to expression vector pGEX4T1.Methods pMD19Thrp5 and pGEX4T1 were digested by Sal+ EcoR.The digested hrp5 and pGEX4T1 we

3、re linked and transformed to E.coli DH5，and the positive colonies were screened by ampicillin, and identified by PCR，digestion and sequencing. Results The cDNA of hitatin 5 was correctly inserted into expression vector pGEX4T1 without mutation. Conclusion Recombinant vector pGEX4T1hrp5 was construct

4、ed successfully. KEY WORDS:Salivavry Histatin 5；Clone；Expression vector 唾液富组蛋白5（HRP5）为富含组氨酸的阳离子多肽，存在于人类和灵长类动物腮腺唾液分泌物中。研究表明HRP5能有效杀灭耐药的白色念珠菌，且具有抗细菌、抗肿瘤及治疗关节炎的作用，作用机理独特，未发现毒副作用，不易诱导抗药菌株的产生，作为多肽类药物防治口腔等疾病潜力巨大1。唾液中HRP5含量低，采集唾液极为不便，提取过程繁琐，产率低；化学合成成本高；我们构建了含HRP5基因的原核表达载体，以望表达具有生物活性的HRP5。 1 材料与方法 1.1 材料 克隆

5、载体pMD19Thrp5为前期构建2，原核表达载体pGEX4T1、大肠杆菌DH5购自invitrogen公司，限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒、酶购自宝生物（大连）公司。氨苄青霉素（Amp）、琼脂糖、Yeast Extract、Tryptone、DNA Marker购自武汉凌飞科技公司，引物由上海英骏公司合成。 1.2 提取质粒pGEX4T1 将含pGEX4T1的菌株于含 Amp（100g/ml）的固体LB培养基上划线，37倒置培养过夜。 选择生长良好的单菌落，接种至4ml含Amp（100g/ml）的LB培养基，37 200转/min（rpm）振荡培养12h。

6、 取1.5 ml×2菌液，按试剂盒抽提质粒。 1.3 目的片段的酶切和回收 按文献2体系，酶切5份克隆载体，合并反应液，沉淀后进行2琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，按试剂盒回收。 1.4 酶切表达载体并回收 酶切体系如下： pGEX4T1 6l 10×H Buffer 6l EcoR 2l Sal2l dH2O 44l 温和混匀，37水浴4h；加入120l无水乙醇，6l 3mol/L 醋酸钠，混匀，-80沉淀1h；12000 rpm离心5min，弃乙醇，600l 70乙醇洗涤沉淀，12000 rpm离心5min，弃乙醇，室温风干，加入20l dH2O溶解沉淀，0.8琼脂糖

7、凝胶电泳分离，按试剂盒回收表达载体。 1.5 表达载体构建 取目的片段及酶切载体各4l，10×ligation buffer 1l，T4 DNA ligase 1l，混匀，16连接过夜。转化DH5感受细胞，于含Amp（100g/ml）的LB培养基筛选阳性菌落。 1.6 重组表达载体的鉴定 1.6.1 PCR鉴定 挑取阳性菌落，用鉴定引物P1: 5GTGAATTCGACTCTCATGCG 3,P2: 5ATGTCGACATAACCGCGATG 3 PCR鉴定，反应体系：dNTPs（10mmol/L）1l，10×buffer 5l， MgCl2（25mmol/L）3l，P1(5

8、pmol/L) 2l，P2(5pmol/L) 2l，Taq DNA聚合酶(5U/l) 0.25l，ddH2O 36.5l。循环参数：始变性 95 3min；94 30s，54 30s，72 30s 30个循环；72延伸10min。扩增后电泳检测。 1.6.2 酶切鉴定 培养PCR鉴定的阳性菌落，抽提质粒，酶切鉴定。酶切体系： pGEX4T1 20l 10×H Buffer 10l EcoR 3l Sal3l dH2O 64l 温和混匀，37水浴4h；按1.4方法沉淀、洗涤、溶解，2.0%琼脂糖凝胶鉴定。 1.6.3 测序鉴定 将1.6.2酶切鉴定的阳性质粒送宝生物（大连）公司进行DN

9、A序列测定。 2 结 果 2.1 质粒pGEX4T1的提取 电泳后可见1、2泳道抽提片段大小位于43676557bp，与质粒pGEX4T1（4900bp）相符，即为所需质粒（图1）。 2.2 重组表达载体的鉴定 2.2.1 PCR鉴定 由图2可知，重组质粒PCR产物略小于100bp，与目的片段（92 bp）长度相符。 2.2.2 酶切鉴定 酶切后鉴定结果如图3，重组载体双酶切（1、2泳道）后出现略小于100bp片段，与插入目的基因大小一致。 2.2.3 重组载体序列测定 将PCR、酶切鉴定的阳性重组载体送宝生物（大连）公司进行序列测定，结果表明，目的基因正确重组至表达载体pGEX4T1，无点突

10、变、移码突变。 图 1 质粒pGEX4T1的提取 M：DNA Marker；12：pGEX4T1 图2 重组载体PCR鉴定 M：DNA Marker；1：PCR鉴定产物；2：阴性对照 图 3 重组载体酶切鉴定 M：DNA Marker；12： 重组载体 EcoR I+Bam H I双酶切 3 讨 论 HRP5是一种具有细菌毒性的蛋白，对大肠杆菌有一定杀伤作用，不宜选择组成性表达的原核载体。本实验选用的表达载体pGEX4T1在酶切位点的5 端带有编码谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因，将目的片段插入其下游，可与其融合表达。由于GST可干扰HRP5的空间结构的形成，屏蔽或降低HRP5对大肠杆菌的细胞毒作用，以利其在细胞中高效表达，同时利用GST与标记有谷胱甘肽的的凝胶进行亲和层析，便于融合蛋白表达后分离纯化。 HRP5基因不足100bp，只占重组载体分子量的极小部分，酶切后电泳条带不明显，应增加酶切体系中重组载体量，保证有足量的酶切片段，增强鉴定目的片段亮度，以便确认重组与否。 pGEX4T1载体在GST近BamH I位点处有凝血酶（Thrombin）水解位点，可水解融合蛋白，获取重组HRP5。【参考文献】 1Oppenheim FG，Xu T，McMillian FM,et alHistatins，a novel family of