不同攻毒剂量对评估H9亚型禽流感疫苗免疫效果的影响.docx

1、第39卷第4期2017年4月Vol.39,No.4Apr.2017中国预防兽医学报ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicinedoi:10.3969/j.issn.1008-0425.2017.04.11不同攻毒剂量对评估H9亚型禽流感疫苗免疫效果的影响石文军，曾显营，臧金凯，吴姣姣，白洁，陈化兰二田国彬(中国农业科学院哈尔滨兽房研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150069)摘要：为了解不同攻毒剂量对评估H9亚型禽流感疫苗免疫效果的影响，本研究选取禽流感病毒(AIV)CK/HuN/174/08和CK/H

2、uB/S4196/09株制备成灭活疫苗免疫21日龄SPF鸡，免疫后采血检测血凝抑制(HI)抗体，免疫后3周时分别采用这两株亲本病毒经鼻腔途径攻毒。H【抗体测定结果显示：两株疫苗免疫21d时，平均HI抗体滴度均可达10log2以上，表明这两株病毒均具有良好的免疫原性。测定每0.1mLCK/HuN/174/08株病毒EID50和CID收稿日期：2016-12-12基金项目：现代农业产业技术体系专项资金(CARS-42-G08);国家重点研发计划(2016YFD0501602)；科技基础性工作专项(2013FY113300-8)作者简介：石文军(1990-),男，山东青岛人，硕士研究生，主要从事禽流

3、感疫苗研究.通信作者：E-mail:tgb；chenhualan分别为10总和IO气CK/HuB/S4196/09株为10*和l05J8o分别以IEIDr、10CID及10?CIDjo剂量攻毒，CK/HuN/174/08株和CK/HuB/S4196/09株疫苗对亲本病毒株攻去的保护率分别为100%和0、100%和80%与60%和0,表明依据EIDjo和ClDso攻毒，CK/HuN/174/08株疫苗可以得出免疫保护效果一致的结论，而CK/HuB/S4196/09株疫苗免疫保护效果不一致。本研究表明，EID和CID”均可以作为H9亚型禽流感疫苗攻毒剂量的参考依据，但以C山知为依据更可靠；10CI

4、D是最佳的攻毒剂量。本研究为科学评价H9亚型禽流感疫苗的攻毒保护效果提供了依据，对于研制疫苗时选择种毒株以及临床上选用有效疫苗均具有指导意义。关键词：攻毒剂量；H9亚型禽流感疫苗；免疫效果；评估中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2017)04-0301-05DifferentchallengedosesinfluencetheimmunityefficacyevaluationofH9subtypeavianinfluenzavirusSHIWen-jun,ZENGXian-ying,ZANGJin-kai,WUJiao-jiao,BAIJie,CHENHu

5、a-Ian*,TIANGuo-bin,(AnimalInfluenzaLaboratoryoftheMinistryofAgricultural,StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150069,China)Abstract:Toinvestigatetheinfluenceofdifferentreferentialchallengedosestoimmunityefficacyevalu

6、ationofH9subtypeavianinfluenzavirus(A1V)vaccines,21-day-oldspecificpathogenfree(SPF)chickenswereintramuscularlyvaccinatedwithinactivatedvaccinespreparedfromAIVsofCK/HuN/174/08andCK/HuB/S4196/09andintranasallychallengedbythetwoviruswithreferentialdoseofE1DWandCID”tocomparetheirinfluencetoefficacyeval

7、uationoftheH9subtypevaccines.TheHIantibodyresultsshowedthatbothvaccinesofCK/HuN/174/08andCK/HuB/S4196/09inducedthehighHIantibodytitersabove101og2inthe3"weekpostvaccination.TheEID”andCID»per0.1mLwereIO"925and10'3®forCK/HuN/174/08andwere10"and10'5MforCK/HuB/S4196/09,wh

8、ichconcludedthatEID”andClDwwerenotaccordance.TheprotectiverateofvaccinesCK/HuN/174/08andCK/HuB/S4196/09were100%and0,100%and80%,60%and0,whenchallengedwith106EIDjo,10CID”，and102CIDm,respectively.TheresultsshowthatthechallengereferentiallywithEIDj,andCIDvaccineCK/HuN/174/08couldcompletelyprotectchicken

9、sfromviruswhilevaccineCK/HuB/S4196/09showeddifferentoutcomes.Inthisstudy,weexplainedthatbothEID50andCIDacouldbethechallengereferenceofH9subtypeavianinfluenzavaccineefficacyevaluation,butCID50isCorrespondingauthormorecrediblethanEID*,andthemostidealchallengedoseis10CIDw.Wcofferedascientificreferencef

10、ortheassessmentofH9subtypeavianinfluenzavaccineimmunizationefficacy,whichhasguidingsignificanceforthechoiceofbothvaccinestrainandeffectivevaccinesinclinicwhenstudyaboutvaccines.Keywords：challengedoses;H9subtypeavianinfluenzavaccine;immuneefficacy;evaluation禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AlV)是具有囊膜、分节段、单股负

11、链RNA病毒，属于正黏病毒科，流感病毒属A型川。根据病毒表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原的差异，AIV可以分为16个HA亚型和9个NA亚型。其中H9N2亚型A1V致病性低，主要侵害家禽生殖系统，导致蛋鸡产蛋量下降、饲料报酬降低。此外，与其它病原混合感染可以造成较高的死亡率.从而给养禽业造成严重的经济损失。而且H9N2亚型AIV也在不断进化。我国于1994年首次分离得到H9N2亚型AIV,2004年之前流行的H9N2亚型AIV亚群包括Gl、Y280、Y439和CK/HU/35/01心】。Sun等对2004年2008年的H9N2亚型AIV进行的遗传进化分析结果将该亚型病毒分为BJ/94、

12、Gl、BG、F/98和Aq5个亚群。而Pu等的研究表明，2010年2013流行的优势病毒株主要属于G57基因型，该基因型与之前的基因型相比，抗原性发生了变化，病毒复制能力和致病力均有所增强国。最新的研究显示，H9亚型AIV为H7N9亚型AIV以及H10N8亚型AIV提供了6个内部基因，L同时，H9亚型AIV能够识别人源受体，感染哺乳动物，在哺乳动物间通过空气传播，表明H9亚型A【V也具有重要的公共卫生意义。疫苗免疫是预防禽流感的主动措施、关键环节和最后防线，并且已广泛应用于禽流感的防控。目前，国内外H9亚型禽流感疫苗评估的攻毒剂量多依据鸡胚半数感染量(EIDso),如1伊EIDJ0.1mU5】

13、。本研究室对7个病毒株的H9亚型禽流感疫苗免疫效果评价时发现，以106EIDjo剂量攻毒，疫苗间的免疫效果存在很大差别，因此EID©是否是评价H9疫苗攻毒保护效果时所用剂量最佳参考依据有待于深入研究。本研究在前期研究的基础上，选择2株H9N2亚型AIV,测定E1D”和鸡半数感染量(C1D%)，比较分别以EID和CID”作为参考依据攻毒后禽流感疫苗的免疫效果，确定H9亚型禽流感疫苗攻毒保护的最佳攻毒剂量。1材料与方法病毒株、抗原及血清A/ChickerVHunan/S12174/08(CK/HuN/174/08)和A/Chicken/Hubei/S4196/09(CK/HuB/S419

14、6/09)由国家禽流感参考实验室分离鉴定。HI试验用H9N2亚型禽流感HI试验抗原及相应的阳性和阴性血清均由本实验室制备。1.1 SPF鸡及鸡胚1日龄SPF鸡、10日龄SPF鸡胚均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心；10日龄非免疫鸡胚购自哈尔滨维科生物技术开发公司。1.2 病毒增殖将CK/HuN/174/08和CK/HuB/S4196/09株病毒以10、10,和10,稀释度分别经尿囊腔接种15枚10日龄SPF鸡胚，0.15mU胚，接种后以石蜡封孔，放置于37C中培养72h后.测定每个鸡胚尿囊液的血凝价，混收血凝价较高鸡肌尿囊液后再次测定血凝价作为病毒原液分装于冻存管中，置于-80C

15、保存备用。1.3 EIDjo和CIDso的测定将病毒原液以10【O'稀释度分别经尿囊腔接种5枚10日龄非免疫鸡胚，0.10mL/胚，接种后以石蜡封孔，放置于37C中培养48h后测定每个鸡胚血凝价阳性数(HA41og2判为阳性)，利用Reed-Muench法计算病毒的EIDo将病毒原液以1010稀释度分别经鼻腔感染5只42日龄SPF鸡，100L/只，感染后3d、5d、7d采集喉头和泄殖腔拭子接胚滴定病毒，判定排毒阳性数。利用Reed-Muench法计算病毒的CIDg1.5全病毒灭活疫苗的制备将两株病毒用灭南生理盐水以10稀释，0.1mL/胚，尿囊腔接种15枚10日龄非免疫鸡胚，24h后死

16、亡的鸡胚随时取出，72h后无菌收集尿囊液，测定其血凝价后以0.2%甲醛37°C灭活24h,灭活的尿囊液接种10日龄非免疫鸡胚，每胚O.lmL,37C培养48h测定血凝价为0证明灭活完全。然后按照灭活疫苗制备的常规程序制备油乳剂灭活疫苗。1.6实验设计将120只1日龄SPF鸡随机分成12组，每组10Ho具体免疫攻毒方案见表1。表1试验设计Table1Experimentaldesign日龄/处理/Days/Administration1.7HI抗体检测组1、组3、组5、组7、组9和组11实验鸡于免疫后7d、14d、21d翅静脉采血分离血清，采用H9N2亚型禽流感H1试验抗原根据国标方法

17、(GB1.18936-2003)检测HI抗体效价。纭1如Groups21日龄/免疫21days/Vaccinalion42日龄/攻毒42days/Chanllenge攻毒剂屋ChanllengedoseGroup1KilledCK/HuN/174/08CICHuN/174/08iocmGroup2ControlCK/HuN/174/0810CIDrGroup3KilledCK/HuN/174/08CK/HuN/174/0810*EID»Group4ControlCK/HuN/174/08106EID勤Group5KilledCK/HuN/174/08CK/HuN/174/08102C

18、ID#Group6ControlCK/HuN/174/08I02CID®Group7KilledCK/HuB/S4196/09CK/HuB/S4196/0910CIDjoGroup8ControlCK/HuB/S419&0910CID.Group9KilledCICHuB/S4196/09ClCHuB/S4196/09lEIDsGroup10ControlCK/HuB/S4196/09KTEIDx,Group11KilledCICHuB/S4196/09CK/HuB/S4196/09I01CID®Group12ControlCK/HuR/S4196/09KfCID,

19、1.8排毒检测实验组1组6试验鸡于免疫后21d通过滴鼻途径以CICHuN/174/08株攻毒，其中组1、组2攻毒剂量为10CID炉组3、组4攻毒剂量为106EID,组5、组6攻毒剂量为102CID；组7组12实验鸡于免疫后21d通过滴鼻途径以CKJHuB/S4196/09株攻毒，其中组7、组8攻毒剂量为lOCID”，组9、组10攻毒剂量为10&EID50,组11、组12攻毒剂量为102CIDsoo攻毒后连续观察14d,记录发病和死亡情况，并于攻毒后第3d、5d、7d采集咽喉和泄殖腔拭子，分别使用非免疫鸡胚进行病毒滴定，分析排毒情况。2结果2.1EIDa和CIDa测定ElDso和CIDj

20、o的测定结果见表2。EIDjo结果显示，病毒株CK/HuN/174/08比CK/HUB/S4196/09高0.57。CID”结果显示，病毒株CK/HuN/174/08比CK/HuB/S4196/09低1.5,表明H9亚型AIV,有时可能会出现一个病毒株的EIDjo高于另一个病毒株，而CID如却远低于另一个病毒株的现象C表2EIDjo和CIDso测定结果Table2ThedeterminatioiiofEID*andCIDe病毒株Virus鸡胚半数感染量EIDJO.1mL鸡半数感染量CIDx/0.1mLCK/HuN/174/0810*io”CK/HuB/S4196/09104WIO4M2.2HI

21、抗体滴度检测将组1、组3、组5、组7、组9、蛆11实验鸡于免疫后不同时间采集的血清样品进行HI抗体滴度检测。结果显示，CK/HuN/174/08和CK/HuB/S4196/09株疫苗免疫后7d抗体水平分别为4.2log2和2.4log2;14d抗体水平分别为10.5Iog2和9.6log2；21d抗体水平分别为10.8log2和10.2log2(图1),表明这两株灭活病毒均具有较强的免疫原性，而且免疫后14d即可诱导机体产生高水平的抗体。图1免疫鸡的HI抗体滴度检测Fig.1HIantibodytitenintiieimmimiredchickens2.3排毒检测试验本研究采用的攻毒剂量分别以

22、病毒株的EIDjo和C1D#为依据。按106ElDtt的剂量攻毒，CK/HuN/174/08株和CK/HuB/S4196/09株病毒的稀释倍数分别为10让和1。2气对于相同批次的这两株病毒鸡胚液，以10ClDso剂量攻毒，稀释倍数分别为。龄和10心，以102CIDjo剂量攻毒，稀释倍数分别为IO88和10*。结果显示：106EIDjo.IOCIDjo和102CID攻毒剂量下的对照组全部排毒，表明对照鸡对病毒攻击均无保护力。以106EIDjo剂量攻毒，CK/HuN/174/08株和CK/HuB/S4196/09株疫苗对亲本病毒攻击的保护率分别为100%和0;以10CIDjo剂量攻毒，CICHuN

23、/174/08株和CK/HuB/S4196/09株疫苗对亲本病毒攻击的保护率分别为100%和80%;以0CIDjo剂量攻毒CK/HuN/174/08株和CK/HuB/S4196/09株疫苗对亲本病毒攻击的保护率分别是60%和0。对于CICHuN/174/08株疫苗，依据EID”和CID”进行攻毒，均可以得出该疫苗对亲本病毒攻击具有良好免疫保护效果的结论；攻毒，得出的结论则大相径庭（表3）。而CK/HuB/S4196/09株疫苗依据EIDso和CID进行表3病毒排毒结果Table3Virussheddingresult疫苗Vaccine攻毒株Virus攻毒剂量Challengedose攻毒后排毒

24、情况(排毒数，总数)(loglOEIDx,)Vimsisolationpostchallenged(Positive/Tota!)(loglOEID撮3喉Throatd泄殖腔Cloacal5d排毒数/总数Positive/total喉Throat泄殖腔CloacalCK/HuN/174/08CK/HuN/174/0810*EID«0/100/100/100/100/10ControlCK/HuN/174/0810。EID«10/10(2.4±0.4)7/10(1.5)9/10(2.5±0.6)8/10(1.4±0.1)10/10CK/HuB/S

25、4196/09CK/HuB/S4196/0910。EIDw9/10(3.6±0.8)7/10(1.9±1.2)9/10(2.4±0.9)9/10(2.8土0.4)10/10ControlCK/HuB/S4196/09I06EIDn9/10(3.l±0.8)5/10(1.4±0.1)9/10(3.1±0.6)4/10(l.2±0.1)10/10CICHuN/174/08CK/HuN/174/0810CIDjo0/100/100/100/100/10ControlCK/HuN/174/0810CIDx,10/10(4.3

26、7;0.8)0/1010/10(3.5±0.2)1/10(2.5)10/10CK/HuB/S4196/09CK/HuB/S4196/0910CIDW2/10(3.5)0/100/100/102/10ControlCK/IIuB/S4196/0910CID»9/10(3.8±0.4)0/1010/10(3.8±0.3)2/10(3.5)10/10CK/IiuN/174/08ClCHuN/174/08102CIDjo4/10(3±0.6)0/103/10(2.4±0.5)0/104/10ControlCK/HuN/174/08102CID

27、w10/10(4.2±0.4)1/10(1.5)10/10(3.2±0.8)0/1010/10CK/HuB/S4196/09CK/HuB/S4196/09102CIDW10/10(2.4±0.5)3/10(1.5)8/10(2.3±0.2)0/1010/10ControlCK/HuB/S4196/09102CID®10/10(4.5)0/1010/10(4.3±0.4)0/1010/103讨论H9N2亚型AIV呈世界性分布，疫苗可以预防该病的发生，但科学的评价方法是确定疫苗是否有效的前提和基础。检测疫苗免疫抗体和攻毒保护情况是常见的评

28、价疫苗免疫效果的方法。本研究中CK/HuN/174/08和CK/HuB/S4196/09株疫苗免疫后21d,平均HI抗体均达101og2以上，远高于一般H9亚型禽流感疫苗的规程标准，表明两株病毒均具有良好的免疫原性，疫苗具有良好的免疫效果。家禽免疫疫苗后，用病毒攻击是最有说服力的评价疫苗保护效果的方法。H9亚型AIV等低致病性病毒，在实验室中感染鸡一般无明显的临床症状，更不出现死亡情况，因此常根据对免疫鸡和对照鸡攻毒后的排毒情况来评价疫苗的保护效果。攻毒剂量是评价疫苗保护效果的关键，疫苗免疫鸡所能承受的攻毒剂量是有一定的限制的，攻毒剂量过大则会表现出免疫鸡不能获得有效保护的现象，而且用可能远高

29、于环境中存在的病毒量来攻毒也不具有实际指导意义；攻毒剂量过小，则对照鸡不出现排毒或发病等现象，从而无法体现免疫和非免疫禽攻毒后的差别。攻毒时，需要将病毒液适当稀释，一般来讲，具体稀释倍数可依据测得的鸡半数致死量（CLXM、EIDjo或ClDso,对于低致病性H9亚型AIV来讲，只能选择后两者作为稀释病毒的参考依据。EIDso测起来简单，本实验室曾主要参照EID”测定结果稀释病毒，用106EID知的剂量攻毒，大部分病毒株疫苗免疫组排毒率较高表现为疫苗不能有效保护，然而将攻毒剂址降为10'EID对后又出现部分病毒株对照组不完全排毒的情况，因此有必要探究EID”是否是最合适的攻毒剂量参考依据

30、。本研究室测定了7株H9N2亚型AIV的EID”和Cid并进行了比较，结果表明EID”为ICT03/。mLWk/O.ImL,而CID”为10'388/0.1mLlOWO.lmL（数据未发表）；即以EIDs为依据，攻毒剂量最大差不到10倍，而以相同的CID知为依据，攻密剂量最大相差1000倍。本研究中CK/HuN/174/08株疫苗用亲本病毒攻击，以EIDso和CIDjo为依据攻毒后，对于疫苗的有效性评价是一致的；而对CK/HuB/S4196/09株疫苗免疫效果的评价却得出截然不同的结论。分析原因，EID”体现的是病毒在鸡胚内的复制和感染能力，而CIDso体现的是病毒在鸡体内的复制和感染

31、能力，对于某些H9病毒来讲，在鸡胚和在鸡体内的复制能力并不一致，因而出现了EID.高而CID”却低的现象。免疫疫苗的目的是为了使免疫鸡能够有效抵抗病毒感染，进而阻止或减少病毒的复制和排泄，因此与EIDso相比，CID”是更适合免疫效果评价时攻毒剂量的参考依据。本研究比较了以10CIDjo和KFCIDjo剂量攻毒时疫苗的免疫效果，表明攻毒剂量越大，免疫效果越不好。考虑到自然界可能存在的病毒数量以及空白对照鸡攻毒后的排毒情况等多种因素，认为10CID5O是H9亚型AIV免疫效果评估最佳参考剂量。本研究阐明，EIDjo和CID”均可以作为H9亚型禽流感疫苗攻毒剂量:的参考依据，但以CID”作为依据更

32、可靠，更能准确评价疫苗的免疫效果，10CID#是最佳的攻毒剂量。本研究为科学评价H9亚型禽流感疫苗的攻毒保护效果提供了依据.对于研制疫苗时选择种毒株以及临床上选用有效疫苗均具有指导意义。参考文献：1 TaubcnbcrgerJK,KashJC.Influenzavirusevolution,hostadaptation,andpandemicformationJ.CellHostMicrobe,20J0,7(6):440-451.2 MurtiKG,WebsterRG.Distributionofhemagglutininandneuraminidaseoninfluenzavirionsas

33、revealedbyimmunodec-tronmicroscopyJ.Virology,1986,149(1):36-43.3 BiswasPK,ChristensenJP,AhmedSS,etal.Avianinfluenzaoutbreaksinchickens,BangladeshJ.EmergInfectDis,2008,14(12):1909-1912.4 GuanY,ShortridgeKF,KraussS,etal.H9N2influenzavirusespossessingH5Nl-likeinternalgenomescontinuetocirculateinpoultry

34、insoutheasternChinaJ.JVirol,2000,74(20):9372-9380.5 LiCheng-jun,YuKang-zhcn,TianGuo-bin,etal.EvolutionofH9N2influenzavirusesfromdomesticpoultryinMainlandChinaJJ.Virology,2005,340(1):70-83.6 钟功勋，李雁冰.平继辉，等.H9N2亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因的遗传分析J.中国预防兽医学报，2007,29(12)：946-949.7 PuJ,WangS,YinY,elal.EvolutionoftheH9N2influenzagenotypethatfacilitatedthegenesisofthenovelH7N9virusJ.PNASUSA,2015,112(2):548-553.8 ChenHai-ying,YuanHui,GaoRong-bao,etal.ClinicalandepidemiologicalcharacteristicsofafatalcaseofavianinfluenzaAH10N8virusinfection:adescriptives