乙型脑炎病毒及其疫苗的研究进展.docx

1、文章编号：1009-0002(2008)05-0750-04乙型脑炎病毒及其疫苗的研究进展徐清华综述，陈鸣审校第三军医大学大坪医院检验科，重庆400042摘要流行性乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的、经蚊虫传播的严重危害中枢神经系统的人畜共患急性传染病，其重症病死率高，易造成永久性的神经系统后遗症，严重威胁着人类的健康。目前尚无特效的治疗流行性乙型脑炎的方法，控制蚊虫传播和免疫接种是当前的主要防御手段。简要综述了乙型脑炎病毒的基因组结构、结构蛋白与非结构蛋白功能、基因分型，以及流行性乙型脑炎疫苗的研究进展。关鲤词乙型脑炎病毒；乙脑疫苗中图分类号R373.31文献标识码AProgressofJapa

2、neseEncephalitisVirusandVaccineXUQing-HujCHENMingDepartmentofClinicallaboratories,DapingHospital,HiirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,ChinaAbstractJapaneseencephalitis(JE)isazoonosiswhichoffendscentralnervoussystemseverelyandistransmittedbymosquitoes.Itisstillamajorpublichealthproblembecau

3、seofhighmortalityandpermanentneurologicalsequelae.AtpresentthereisnospeciallyeffectiveantiviraltreatmentforJE.Therefore,vaccinationandvectorcontrolconstitutemajormeasures.ThisreviewfocusedonJapaneseencephalitisvinjs(JEV)ongenomicstructure,structureproteins,nonslructuralproteinsandtheirfunction,genot

4、ypingandvaccine.KeywordsJapaneseencephalitisvirus;Japaneseencephalitisvaccine5，m7Gppp196477cPrM/MENS1NS5978247831039210976流行性乙型脑炎(epidemicencephalitisB,乙脑)又称日本脑炎(Japaneseencephalitis,JE),是由乙型脑炎病毒(JapaneseencephalitisvirusJEV,乙脑病毒)引起、经蚊虫传播的急性传染病。该病严重侵犯中枢神经系统，致死率高达30%左右，另有50%的患者会留下永久性的神经系统后遗症叫世界卫生组织(W

5、HO)已将其列为重点防控疾病。乙脑主要在亚洲流行，但近年来随着全球气候的变暖，该病流行区域也在不断扩大，澳大利亚本土和关岛地区也出现乙脑病例。目前尚无特效的治疗乙脑的方法，控制蚊虫传播和免疫接种是现阶段的主要防御手段。我们对乙脑病毒的基因组结构、结构蛋白与非结构蛋白功能、基因分型和及流行性乙型脑炎疫苗研发进展综述如下。I乙型脑炎病毒的基因组结构乙型脑炎病毒属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属,1935年在日本被分离。与其他黄病毒一样，乙脑病毒颗粒为球形有包膜，大小约50nm相对分子质量为4.2x106,具有感染性。乙型脑炎病毒是单股正链RNA病毒，RNA长约11妙。从5,端第96位开

6、始至3,端10392位终止是一个开放式阅读框，约10.3kb,能转录和翻译出一个多聚蛋白前体叫这种多聚蛋白再通过病毒和宿主细胞蛋白酶的作用而分裂形成多种蛋白，主要包括3个结构蛋白(衣壳蛋白、膜蛋白和包膜糖蛋白)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。5,端1/4编码病毒的3个结构蛋白，3,端3/4编码7个非结构蛋白。基因组5,端和3端均有一段非编码区(noncodingregion,NCR)o5NCR由95个核昔酸组成，有一个I型帽子结构(m7Gppp),具有保护5,端免受核酸前或磷酸酶降解，促进起始翻译的作用。3-NCR长约582个核皆酸，缺乏Po

7、ly(A)结构，但有一个十分保守的核昔酸序列，是形成3,端二级结构的一部分，可能对RNA的复制和核壳化非常重要。JEV基因顺序为：5-C-PreM-M-E-NSl-NS2A-、S2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3(如下图)。2乙型脑炎病毒的结构蛋白与功能乙脑病毒结构蛋白有衣壳蛋白(capsidprotein,C)、前膜蛋白(precursorformembraneproteinM,PrM)、包膜糖蛋白(envelopeglycoprotein,E)oC蛋白是最基本的蛋白，由125个氨基酸残基组成，富含带正电荷的Lys和Arg残基(约20%),其3954位序列在黄病毒中具有保守性叫C蛋

8、白与RNA结合在一起，形成衣壳蛋白，保护RNA免受核酸酶等的破坏，参与病毒的组装，并与病收稿日期12007-12-23基金项目国家商技术研究发展计划(2007AA02Z416)：国家自然科学基金(30400107)作者简介徐清华(1972-)，女，硕士研究生，现单位为白求恩国际和平医院遗传医学科通信作者陈鸣,(E-mail)chenming!971毒复制有关叫C蛋白之后为PrM蛋白，是M蛋白的前体。M蛋白是毒粒包膜中含75个氨基酸残基的非糖基化膜蛋白。在感染细胞中，M蛋白以糖基化的前体即PrM的形式存在，PrM蛋白是未成熟病毒体的一部分，在病毒感染后期，它被定位在分泌途径中的细胞蛋白酶水解为M

9、蛋白后发育为成熟的病毒体PrM区整体结构相对稳定且高度保守，推测与病毒保持自身生物学特性和复制有关。PrM/M主要停顿在内质网，在病毒出芽过程中发挥关键作用，并与E蛋白及C蛋白共同组成感染性病毒核心明因此PrM蛋白在病毒感染方面有其重要作用。E蛋白是JEV的主要结构蛋白，相对分子质量为53x103,为疏水性糖蛋白，富含Gly和Ala残基，其编码基因大小为1500bpE蛋白包括500个氨基酸残基，其上相关位点如E138、E176、E315和E439突变对乙脑病毒神经毒力及神经侵袭力有举足轻重的影响圈,尤其是E138位点由Glu变为Lys,有很强的减毒决定作用叫由E蛋白形成的表面抗原决定簇具有血凝

10、活性和中和活性，能和血凝抑制抗体结合，刺激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒攻击网。该蛋白与病毒毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合、保护性免疫、血凝反应和血清特异性有关叫。由于具有许多重要的生物学功能，历来的研究重点多放在E蛋白上，近年来对该蛋白的高级结构研究也取得了一些进展。Kolaska)等对E蛋白活性结构域氨墓酸的分析表明，E蛋白序列有由12个半胱敏酸残基组成的保守区，在特定的地方形成6个二硫键。呈高度伸展状态的E蛋白含有3个抗原域:域I(中心域)，由151、137196和293311位的128个氨基酸残基祖成，含2个二硫键(CysCys30和Cys-Cys297)。该域带有血清学及生物活

11、性的抗原表位和E蛋白仅有的一个糖基化位点(Asn-X-Ser),该糖基化位点在多数黄病毒中具有保守性。域U,由52136和197292位的171个氨基酸残基和3个二硫键(CysCys,2Cys74-Cys105和Cys-Cys116)组成。该域被称做二聚体化功能域，含有一个疏水区，具有中和活性和血凝活性抗原表位；98111区段是黄病毒高度保守区，有一个。发夹结构。域in,由310411位的100个氨基酸残基组成，仅含1个一硫键(Cys3l4-CysM6)0域HI独立地在病毒表面折叠成免疫球蛋白样的结构，许多抗原中和表位都集中于这一结构域。Wu等凹利用噬菌体呈现技术，从肽库中筛选对病毒单抗高亲和

12、力的肽段，确定病毒在结构域皿中的中和位点主要集中在337345、377382和397403这3个区域内，在这些区域发生的变异会导致抗原性的改变，甚至影响抗原与中和抗体的结合反应，而中和抗体在预防乙脑中起主导作用。因此，分析乙脑病毒E蛋白的遗传学特性，对研究乙脑活疫苗病毒基因的稳定性有重要意义。3乙型脑炎病毒的非结构蛋白与功能乙脑病毒的非结构蛋白有7种，即NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A.NS4B和NS5。用存在于NS3N端的一种类似胰酶的蛋白酶进行34次切割可将这些蛋白分开，也可能还需要信号肽酶进行另外2次切割。它们是酶或调节蛋白，与病毒复制和生物合成密切相关。NS1由352个敏基

13、酸残基组成，相对分子质鱼为42x103,具有可溶性补体结合活性，因为它不组成毒粒，所以无中和活性和血凝活性。NS1是第一个被翻译的二聚体糖基化蛋白，它除了对病毒成分加工起一定作用外，还有对机体有利的一面，即在感染细胞表面表达、以溶解或与胞膜成分相连的形式分泌到胞外，这种分泌形式只限于NS1的二聚体。胞外的NS1作为可溶性补体固定抗原与胞内的NS1具有相同的抗原性，后者刺激机体的防御系统，通过补体和细胞介导的细胞溶解效应破坏被感染的细胞而获得中和病毒的能力用NS1蛋白免疫动物能抵抗病毒的攻击，但比E蛋白诱导的保护力低。NS2A/B是低分子疏水性蛋白，NS2B与其他蛋白的加工成熟有关，且NS3蛋白

14、的蛋白酶水解活性必需NS2B冏。NS2蛋白可能与膜功能有关，在所有黄病毒中NS2蛋白的同源性最低，NS3蛋白具有蛋白酶和ATP酶/螺旋酶活性，其性质高度保守四。最近的研究证实，NS3是酪氨酸磷酸化的蛋白质的。NS3蛋白在病毒感染细胞中对病毒RNA的复制具有十分重要的功能。NS4A/B是小分子疏水蛋白，功能不清。NS5是黄病毒科最大的保守蛋白，相对分子质量为105x103,为碱性蛋白。对NS5蛋白的基基酸序列与其他病毒的RNA多聚愉的比较发现，乙脑病毒NS5蛋白存在RNA多聚酶的一些功能基团，这些功能基团主要位于其C端2/3区域，提示该蛋白就是乙脑病毒的RNA多聚酶网。NS5具有依赖于RNA的R

15、NA聚合酶活性，与病毒的复制有关，任何一部分的改变都可能导致复制过程的忠实性。4乙型脑炎病毒的基因分型和毒力分类根据乙脑病毒基因的同源性及变异性,Chen等将乙脑病毒基因分型的cut-off值定为12%的差异度，从而得到进化关系上较为明显的4个型：泰国北部及柬埔寨地区的毒株属于基因型I,来自泰国南部、马来西亚、印尼的毒株形成基因型II,来自印度、中国及日本的毒株属于基因型皿，部分印尼的毒株独自形成了自己的基因型即N型。研究发现，同一基因型的毒株在地域上有更为紧密的联系，即有明显的地域性。在同一地区分离的毒株，即使年代相差很远也属于同一基因型四。20世纪40年代即发现不同乙脑病毒对成年鼠皮下致死

16、力有所不同，并以此作为衡量病毒毒力的指标，将乙脑病毒分为强毒株和弱毒株。强毒株可引起严重的脑炎，甚至可致人死亡，而弱毒株一般不引起脑炎或脑炎程度较轻。在此后对乙脑病毒的研究过程中发现影响其毒力的相关因素很多，如病毒与细胞受体结合的能力、病毒与细胞融合的速率、病毒RNA合成酶的合成速率等，都会不同程度地影响该病毒的成力研究显示，E蛋白在乙脑病毒毒力中占有极重要的位置，但决定病毒毒力的因素不仅限于E蛋白编码基因，即使在结构基因中发生变异也会使病毒毒力有所减弱。5乙脑疫苗研究进展E蛋白与乙脑病毒的致病性密切相关，且包含有众多的保护性抗原位点，是目前乙脑疫苗研究的主要对象，而PrM对于E蛋白的成熟是必

17、需的。因此，表达PrM-E基因是研究乙脑重组疫苗的一种较为理想的策略。目前国内外广泛应用的疫苗有鼠脑纯化灭活疫苗、地鼠肾细胞灭活疫苗和地鼠肾细胞减毒活疫苗。鼠脑灭活疫苗主要应用于国外，后2种在国内应用。5.1鼠脑灭活疫苗过去，鼠脑灭活疫苗是应用最广的乙脑疫苗，韩国、泰国、马来西亚部分地区、斯里兰卡、越南已将其纳入常规免疫。该疫苗有液体和冻干两种剂型，冻干疫苗在4Y可稳定维持1年以上。WHO对鼠脑灭活疫苗不仅在生产技术上制定了要求，而且在疫苗免疫原性上也有标准化规定，须经反复提纯，髓磷脂蛋白含量非常低(2ng/mL)o鼠脑灭活疫苗很安全，对免疫功能缺陷的人群，包括HIV感染者，接种后也很安全。缺

18、点是须多剂接种，局部反应如局部敏感、红、肿发生率较高，约为20%刖;制备过程复杂，费用较为昂贵。疫苗的惟一禁忌证为以前接种时发生过敏反应。孕妇一般不接种，只有有较大感染风险时才接种。5.2地鼠肾细胞灭活疫苗口-切本疫苗仅在中国生产和使用，毒株为北京P3株，对各型乙脑病毒均可产生保护，在地鼠肾细胞培养时产毒星很高。由于此类疫苗未经纯化和浓缩，导致杂蛋白较多且抗原含量较低，所以需要多次加强才能维持一定的免疫水平，而多次接种又容易产生过敏反应。最近中国又注册了Vero细胞培养的灭活疫苗，对婴儿基础免疫后可达到85%的保护水平，但抗体水平很快下降。此疫苗主要用于流行季节前的突击接种，局部反应发生率为4

19、%,轻度系统性反应1%,过敏反应为1/15000,未发现疫苗引起的脑炎。此疫苗逐步被细胞培养的减毒活疫苗取代。53地鼠肾细胞戒毒活疫苗1988年我国研制成功乙脑减毒活疫苗SA14-14-2,是惟一用于人类的乙脑减毒活疫苗网，小所试制时曾在乙脑非流行区进行过人体观察，注射1针后中和抗体阳转率为92.3%100%四;在乙脑流行区对抗体阴性儿童的抗体阳转率为94.74%。目前在我国累积接种人数超过1亿人，其安全性和预防效果己得到充分证实。最新数据显示，该疫苗具有良好的免疫原性，不良反应发生率极低且症状较轻，免疫持续时间长，费用低廉，但孕妇和免疫缺陷者不宜接种减毒活疫苗。由于我国的乙脑减毒活疫苗株SA

20、14-14-2是将强毒株SA14通过地鼠肾(PHK)单层细胞长期传代获得的稳定弱毒株，存在PHK细胞基质认证、批准等问题，因此尚未在国际上使用(韩国除外)。但目前WHO己推荐在全球使用该疫苗，并己讨论通过其规程。5.4 亚单位疫苗亚单位疫苗的研究也是疫苗学领域的热点内容，具体包括以痘病毒或腺病毒为载体的重组疫苗，以RNA病毒为载体的重组疫苗，以及以真核表达质粒构建合成病毒抗原性蛋白的病毒样颗粒等网。尽管有一些用于疫苗方面的研究报道，但尚未得到肯定的结果。5.5 基因工程疫苗基因工程疫苗是随着分子生物学和生物技术的发展而产生的新一代疫苗，包括DNA疫苗网、复制子疫苗阿、嵌合体疫苗等，以嵌合体疫苗

21、为代表的基因工程疫苗是乙脑疫苗新的发展方向。如用病毒SA14-14-2株PrM和E蛋白基因去替换黄热病毒17D株cDNA的相应位置，而核心蛋白、非结构蛋白基因与病毒复制有关的部分则保留黄热病毒17D株的基因序列，构成了黄热乙脑嵌合病毒(ChimeriVaxE-JE)叫目前已在部分志愿者中进行了一期试验，接种1次血清抗体阳转率97%,显示了其安全性和免疫原性四,在成人和儿童中的二期临床试验证明其有高的耐受水平网。但基因工程疫苗仍在研究阶段，应用到人体还有一定LETTERSINBIOTECHNOLOGYVol.19No.5Sep.,2008的距离需要跨越，因此短期内还很难代替传统疫苗。6结语目前对

22、乙脑尚无特效的治疗方法，WHO将研究和发展乙脑疫苗作为主要目标。乙脑疫苗研发正处于一个更新换代的时期，新的疫苗真正能得到应用之前，还有许多细致的工作要做。相信随着分子免疫学、分子生物学的迅猛发展和生物技术的进步，以及人们认识的逐步深入，将会研究出一种安全、有效、经济、实用的乙脑疫苗为人类服务。参考文献SolomonT,DungNM,KneenR,etal.JapaneseencephalitisJ|.NeuroNeurosurgPsychiatry,2000,68:405-415.1 SolomonT,NiH,BeasleyDWC,etal.OriginandevolutionofJapane

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