产肠毒素大肠杆菌菌毛的DNA疫苗研究进展.docx

1、产肠毒素大肠杆菌菌毛的DNA疫苗研究进展王劫（广东省农业科学院畜牧研究所，广东广州510640）摘要：肠毒素大肠杆菌是导致婴幼儿及旅游者急性腹泻，仔猪腹泻和水肿的主要病原菌之一.菌毛定居因子是该病原菌主要的致病因素.DNA疫苗既能激发机体的细胞免疫，也能诱导特异性的体液免疫。目前用于预防ETEC腹泻的DNA疫苗的研究已取得一定进展.作者从重组质粒的构建、免疫应答、疫苗的接种系统以及基因佐剂4个方面简单的概述了产肠毒素大肠杆曲曲毛的DNA疫苗的研究现状。关键词：肠毒素大肠杆菌；菌毛，DNA疫苗中图分类号:3852.5文献标识码：A肠毒素大肠杆菌<enterotoxigenicEscheri

2、chiacMLETEC）是引起世界上发展中国家婴幼儿及旅游者急性腹泻的常见病因（Natar。等，1998）；也是猪最主要的病原体之一，可引起仔猪腹泻和水肿（Beatriz等，2000）。ETEC致病因子主要包括肠毒素（enterotoxins）和菌毛（fimbriae）。当病原菌感染宿主后，ETEC首先通过菌毛黏附到小肠黏膜上皮细胞刷状缘受体上，抵抗肠道蠕动与肠内分泌物清洗，从而使ETEC在肠道内定殖，然后释放出一种或两种肠毒素，与小肠细胞膜上的特异受体结合，引发细胞内水、电解质失衡，造成细胞吸收障碍，产生水样、脱水性腹泻（Nataro等，1998）。菌毛与小肠黏膜的黏附是ETEC致腹泻不可或

3、缺的必要条件。针对ETEC菌毛的疫苗发展已有20多年，从早期的亚单位疫苗、灭活菌苗、减毒活菌苗到当前的载体疫苗，尽管已研制出多种疫苗，但是在保护力、免疫持久性、生产成本、运输保存等方面仍有许多待改进之处。20世纪90年代，基因免疫的研究及核酸疫苗的诞生，为疫苗的发展打开了新的局面。DNA疫苗，又称核酸疫苗或基因疫苗.其本质是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA,将此重组质粒转入机体内，使编码基因借助宿主的转录和翻译机制我得表达，被提呈的表达产物与主要组织相容性复合物（majorhistocompatibiltycom-plex,MHC）结合，刺激机体产生相应的抗体和细胞毒性T淋巴细胞（

4、cytotoxicTlymphocyte?CTL）,分别介导体液免疫和细胞免疫应答（江国托，2005）。与传统的疫苗相比，DNA疫苗拥有许多优点：收稿日期:2010-0729作者简介：王劫（1980），女，湖北人，博士，助理研究员，研究方向：动物遗传育种与营养调控.文章编号：1671-7236（2011）02-0178-03它能诱导针对多个抗原表位的免疫保护作用，可能对某种病原体的不同变异体都有免疫反应（Alves等，1998a）;可在个体内存在较长的时间，并持续表达抗原蛋白，因此能够较长时间的持续诱导免疫效应（Davis等,1996；Deck等,1997；Turnes等，1999；Alves

5、等，2001）；将DNA疫苗导入黏膜表面，诱发黏膜免疫，对肠黏膜感染性疾病预防更直接有效（郑继平等，2003）；而且生产成本低廉且易于保存。目前，ETECDNA免疫的研究目前还仅局限于人源ETEC的CFA/I萌毛（由cfaB编码），以及猪源ETECK88菌毛的主要蛋白亚单位FaeG。作者将从重组质粒的构建、免疫应答、疫苗的接种系统及基因佐剂4个方面，对近20年来针对产肠毒素大肠杆菌菌毛的DNA疫苗研究作一简要的概述。1ETECDNA疫苗的构建核酸疫苗由保护性抗原基因和载体典粒两部分蛆成。抗原基因可以是单个基因或具有协同保护功能的-组基因，也可以是编码抗原决定簇的一段核昔酸序列（张以芳，2000

6、）。载体质粒一般为真核表达载体。选择合适的启动子/增强子系统对DNA介导免疫蛋白表达水平是至关重要的。目前较常用的有RSV.CMV及SV403种启动子系统，其中以CMV最强。不同的质粒载体其表达的抗原在细胞的定位不同，而质粒在细胞内的不同定位对免疫应答起着重要作用。Alves等（1999）曾以定居因子CFA/I的编码基因cfaB为目的片段，插入到pRE4（RSV启动子）、pkCMVintPoly（CMV启动子）和pkCM-VintBIXCMV启动子）3种载体质粒中分别构建了重组质粒pRECFA、pPolyCFA和pBLCFA,肌内注射BALB/c小鼠，结果表达的抗原分别定位在细胞的质膜、胞质和

7、周质区，并都产生了抗CFA/I的特异免疫应答，三者中以pBLCFA引起的免疫应答水平最高,可见分泌表达型重组质粒能更好的引起机体的体液免疫和细胞免疫。此外，Alves等（1999）还发现，不同质粒载体表达的抗原蛋白介导的主要免疫反应类型（体液免疫反应或细胞免疫反应）并不一样。2免疫应答DNA疫苗不仅可以诱导体液免疫反应产生相应抗体，而且还能激活细胞毒性T淋巴细胞，诱导细胞免疫（Ulmer等，1993；Anderson等.1996；Alves等,1998a；Lasaro等,2004）o小鼠用表达CFA/I菌毛的DNA进行单次接种，可以获得血清IgG,然而该抗体无法凝集细菌细胞或抑制含CFA/I菌

8、毛的ETEC产生的血凝作用（Alves等，1998a）。CFA/IDNA免疫所诱导的血清学反应以IgG2a同种型占优势，相比之下用纯化的CFI/A蛋白亚单位免疫后，所诱导的却是IgGl占优势的免疫反应（Alves等,1998b）0核酸免疫能够较长时间的持续诱导免疫效应。Alves等（2001）对pBLCFA核酸免疫研究发现，该质粒可以诱导持续近1年的免疫反应，产生的特异性抗休能有效阻断CFA/I的黏附。Cho等（2004）构建表达ETECK88亚单位蛋白FacG的重组质粒PUM86,用其免疫蛋鸡发现，与FaeG亚单位苗相比，pUM86诱导的免疫应答出现的时间较晚，但是免疫应答时间较K，这是由于

9、DNA质粒体内表达址较低，需要持续表达一段时间才能有效刺激免疫应答产生；而DNA质粒在体内的长期表达，致使免疫应答能持续较长的时间。核酸疫苗能诱导针对多个抗原表位的免疫保护作用，可能对某种病原体的不同变异种都有免疫反应。Alves等（1998a）将编码人源ETECCFA/I菌毛蛋白的CM基因插入到pRE4直核表达载体中，构建了重组质粒pRECFA,用该重组质粒直接免疫BALB/c小鼠，发现该质粒诱导的抗体不仅可以与CFA/I发生反应.还可以与CFA/I的同源蛋白发生反应，如CS1、CS4和PCFO166。3疫苗的接种系统目前大多数DNA免疫的研究通常采用注射器将质粒直接注射肌肉，或用基因枪将包

10、襄质粒的金微粒注射到皮下组织。基因枪直接向免疫活性组织递送少量的基因表达载体，能使包裹DNA的粒子直接通过原生质膜进入细胞质中，由于这种方法递送的DNA很少被降解，因而用量极少（江国托，2005。相比之下接注射DNA到细胞间隙，细胞夕卜DNA易被降解，因而用扯也较大。Verfaillie等（2004）构建了含猪源ETECK88ac菌毛基因的重组质粒pcDNAl/fae（；19,分别用肌肉注射（600Mg）和基因枪法（10乂g）两种方式对4周龄的断奶仔猪进行免疫，结果肌注免疫能更快的诱导机体产生抗K88特异性血清抗体，且产生的IgG抗体水平高于基因枪免疫；然而，用基因枪组免疫抗原特异性淋巴细胞的

11、增殖水平高于肌注组。免疫程序是影响DNA免疫效果的另一重要因素。Turnes等（1999）分别采用不同剂量:和不同免疫次数，对小鼠免疫含有faeG基因（编码ETECK88ab菌毛蛋白）重组质粒pCBOl,结果发现50pg分3次递增免疫产生的抗体浓度高于100或200邱分2次免疫的。可见，多次递增小剂量的免疫效果优于一次大剂量的免疫效果°此外，分别用200、400.1100昭的总剂址分2次免疫母猪，最后仅高剂量（1100的核酸免疫产生了特异性抗体。免疫效果与免疫剂ht之间是否存在直接的关系还有待进一步的研究。Alves等（2001）在pBLCFA核酸免疫研究中发现，初次一加强免疫策略可

12、以增强免疫效果。在有关ETEC菌毛的DNA疫苗的研究中，大多数采用的是这种策略，此外，DNA初次一蛋白加强免疫策略同样可以提高免疫水平。Vcrfaillie等（2004）采用pcDNA/faeG19重组质粒首免3次,此后用提纯的菌毛蛋白加强免疫1次，结果诱导产生了较高水平的特异性抗体。与其他抗原共同免疫也能加强DNA免疫效果。Melkebcck等（2007）研究发现将编码猪源ETEC菌毛亚基基因凡eG的DNA重组质粒与编码同源ETEC肠毒素LTA和B亚单位基因的重组质粒共同免疫仔猪，可以显著提高仔猪体内IgG的水平，并延长高抗体水平的持久性。Luiz等（2008）研究也发现含有人源ETEC菌毛

13、亚基基因cfaB的重组质粒pRECFA与此质粒转化枯草芽抱杆菌所分泌的重蛆蛋白或抱子共同免疫DBA/2小鼠，可以显著提高小鼠血液中IgG与slgA浓度，免疫效果明显优于单独免疫pRECFA。4基因佐剂在DNA疫苗的研发过程中面临的一个主要困难是，DNA免疫很难在大型动物中诱导有效的免疫反应（Babiuk等，1999；Kim等，2000）。因为尽管使用了高剂量的免疫原进行免疫，但仅有微量的抗原能在体内有效的诱导免疫反应（Scheerlinck,2001）o基因佐剂为解决这项难题提供了一条有效的途径。基因佐剂是由编码细胞因子、趋化因子、可溶性的细胞配体、黏附蛋白或其他免疫分子等的表达我体构成，这些

14、表达载体通过转染后迁移入核，配合DNA疫苗产生相应的佐剂效应(HiIdegund,2005)o在有关ETEC菌毛的DNA疫苗研究中，目前仅Cho等(2004)报道了鸡源IL-6作为基因佐剂的作用效果，研究者将1L-6编码基因与faeG(编码ETECK88ac菌毛蛋白)融合，构建重组质粒PUM86,免疫蛋鸡，结果发现该质粒尽管刺激动物血清中细胞因子浓度的上升，但IL-6作为基因佐剂并没有促进抗体水平的提高。因此.是否所有细胞因子基因佐剂均能有效增强免疫效果还有待进一步考证。尽管有关重组质粒的构成.携带质粒的运载物、对免疫系统的影响、疫苗的接种系统、动物模型、动物试签等方面均有报道，并初步显示出D

15、NA疫苗的种种优势，然而这些报道不足以确证产肠毒素大肠杆菌菌毛DNA疫苗的有效性，仍需要:大域试验来证实其免疫效果。此外，DNA疫苗仍然存在许多未知领域，等待人们探索。参考文献1江国托.核敝疫苗研究进展口.中国禽业导刊，2005.22：3739.2师福山.赵德明.禽大肠杆蔺的分离与16SrRA的鉴定口.中国奄牧SK.2009,36(2):111-113.3张以芳.核酸疫苗的构成及主要特点J.上海畜牧曾医通讯.2OOO,2：H.4郑继平.张兆山.肠毒素大肠杆菌疫苗研究进展J.微生物学免疫学进展，2003,31：5154.5 HildegundC.ErtlJ.DNA疫苗M.李埼涵.等译.北京：化学

16、工业出版社,2005.6 AlvesAMB,lq'saroM0,AlmeidaI)F.etal.DNAimmunisationagainsttheCFAIfimbriaeofenterotoxigenicEscherichiacolt(ETEC)J,Vaccine,2001,19:788-795.7 AlvesAMB,I'$aroMO»PyrrhoAS.etal.AntibodyresponseinmiceimmunizedwithaplasmidDNAencodingthecolonizationfactorantigenIofenterotoxigenicEsch

17、erichiaro/ifjj.ImmunologyandMedicalMicrobiology,1999,23-321-330.8 AlvesAM.EpitopespecificityofantibodiesraisedagainstenterotoxigenicEscherichiacoliCFA/lfimbriaeinmiceimmunizedwithnakedDNAJ.Vaccine.1998a,16(1)：915.9 AlvesAMImmunoglobulinGsubclassresponsesinmiceimmunizedwithplasmidDNAencodingtheCFA/lf

18、imbriaofenterotoxigenicEscherichiaImmunol1998b,62(3):145149.10 AndersonR.GoaXM,PapakonstantinopoulouA,eral.ImmuneresponseinmicefollowingimmunizationwithDNAencodingfragmentCoftetanustoxinCJ.InfectIrnmun.1996,64：31683173.BabiukLA.etal.Immunizationofanimals：fromDNAtothedinnerplatej.VetImmunolImmunopath

19、ol.1999,72,189202.BeatrizE,CabilioG.EnterotoxigenicEscherichiacolianover-viewJ.MemInstOswaldoCruzRiodeJaneiro,2000,95(Suppl1),95-97.ChoSH,IxicwenPC,MarquardtRR.AplasmidDNAencodingchickenintcrleukin-6andEscherichiacoliK88fimbrialproteinFaeGstimulatestheproductionofanti-K88fimbria!antibodiesinchickens

20、J.PoultryScience.2004,83：19731978.DavisHL,ManciniM.MichelML,ctal.DNA-mediatedimmunizationtohepatitisBsurfaceantigen：longevityofprimaryresponseandeffectofboostJ.Vaccine,1996.14：910915.DeckRR.DcWinCA4,DonnellyJJ.etal.CharacterizationofhumoralimmuneresponsesinducedbyaninfluenzahemagglutininDNAvaccincJl

21、.Vaccine,1997,15：7178.KimJJ,YanJS,VanCottTC»etal,Modulationofantigen-specifichumoralresponsesinrhesusmacaquesbyusingcytokinecDNAasDNAvaccineadjuvants。.JVirol,2000,74：34273429.LasaroM().l.uizWB.SbrogioAlmeidaME,cth】.CombinedvaccineregimenbasedonparenteralprimingwithaDNAvaccineandadministrationof

22、anoralboosterconsistingofarecombinantSalmonellaentericaserovarTyphimuriumvaccinestrainforimmunizationagainstinfectionwithhuman-derivedenterotoxigenicEicherichiacolistrains.InfectImmun,2OO4,72(11)：64806491.LuizWB,CavalcanieR,PaccezJD,etal.Boostingsystemicandsecretedantibodyresponsesinmiceorallyimmuni

23、zedwithrecombinantHacillusfubtilisstrainsfollowingparenteralprimingwithaDMAvaccineencodingtheenterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC)CEA/1fimbriaeBsubunitJ.Vaccine,2008,26(32L39984005.MelkebeekV,VerdonckF,GoddeerisBM,etal.ComparisonofimmuneresponsesinparenteralFaeGDNAprimedpigsboostedorallywithF、4protei

24、norreimmunizedwiththeDNAvaccine"J.VeterinaryImmunology.2007.116:199214.NataroJP,KaperJB.DiarrheagenicEscherichiacoliJJ.ClinMicrobioRev,1998.11(1):142201.ScheerlinckJY.GeneticadjuvantsforDNAvaccinesJ.Vaccine,2001,9,2647-2656.TurnesCG.AleixoJAG.MonteiroAV,ctal.DNAinoculationwithaplasmidvectorcarr

25、yingthefaeGadhesingeneofEschc-richiacoliK88abinducedimmuneresponsesinmiceandpigsJJ.Vaccine,1999.17：2089-2095.TurnesCG.ConceiqaoFR.DellagostinOA.ProductionofPC1J01，aplasmidforDNAimmunizationagainsttheadhesionofEscherichiacoliK88abJ.BrazilianJournalofMicrobiology.200】，32：225228.11121314151617181920212

26、22324UlmerJB.DonnellyJJ,ParkerSE,etal.HeterologousprotectionagainstinfluenzabyinjectionofDNAencodingaviralpro-teinLJj.Science,1993.259,17451749.采用内置金属支撑物联合钢丝治疗犬胫骨开放性骨折吴越I,高雪），邢明伟2,王冠博I,翟承光】，郭凤鸣'，蔺东启。范宏刚I（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030；2.东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江哈尔滨150036）中图分类号：S857.126文献标识码：A当犬胫骨部发生闭合性骨折时

27、，若骨折断端借位不明显，可选择外固定的方法进行整复。当外固定整复无效或整复后出现移位变形时，需进行内固定治疗。胫骨部发生开放性骨折，特别是断端锐利的斜骨折且有一定活动性时，为防止软组织损伤，必须选择手术内固定。目前胫骨部骨折常用的内固定方法有接骨板法和贯穿膝关节髓内针联合钢丝:法。近来，东北农业大学动物医院收治了1例胫骨开放性骨折的病例，笔者采用内置金属支撑物联合钢丝内固定的方法对其进行治疗，取得了理想疗效，现将诊疗过程报告如下。1发病情况收稿日期；2010-07-29作者简介：吴越（1987-）,男，黑龙江人，本科生，从事宠物诊疗技术的研究.通信作者：范宏刚.E-mail:fanhongga

28、ng2002基金项目：全国兽医专业学位委员会教育教学研究项目一兽医临床病案和案例分析；东北农业大学动物医学学院本科生实习基金。文章编号：1671-7236（2011）02-0181032010年2月11日，哈尔滨市南岗区曹女士带1只咨乐蒂犬，前来医院就诊。主述：患犬10d前因与1只成年德牧犬争斗，导致右后肢内侧被咬伤。随后在附近宠物医院治诊，诊断为胫骨开放性骨折。选用硬纸壳和弹性绷带实施外固定，伤口部实行开窗。其后4d,伤口暗红色，骨折处肿胀严重，且断端外露，有暗红色黏稠液休流出，并散发恶臭气味。患犬呼吸较急促，精神沉郁，主人感觉情况严重，遂前来就诊。2临床检查2.1临床症状患犬为12月龄黄白花色喜乐蒂犬，雄性，营养状况艮好，精神较为沉郁，患犬右后肢悬跛，不敢着地，伤口位于右后肢内侧胫骨中部，按压有暗红色脓汁流出，散发恶臭气味，远心侧骨折断端已明显外露，且十分锐利。该犬体重1