人3型副流感病毒及其疫苗的研究进展.docx

1、综述.人3型副流感病毒及其疫苗的研究进展火文综述；白慕群审校兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，兰州730046摘要：人3型副流感病毒(血numParainfluenzaVinwtype3,HP【V-3)是引起婴幼儿严审细支气管炎及肺炎等下呼吸道疾病的主要病原体,其在发达国家和发展中国家都造成了沉重的疾病负担。迄今，对HPIV-3感染的预防和治疗都还没有有效的疫苗和药物，因此WHO将HP1V-3疫苗列为未来重点研发的疫苗。近年来,随着重组技术和反向遗传学的发展.HPIV-3疫苗的研制取得了重要进展，部分疫苗已进入临床评价阶段。就HPIV-3的生物学特性如病毒结构特征、复制

2、过程、流行病学特征,以及近年来传统冷适应减毒活疫苗、亚单位疫苗、以反向遗传学为基础的新型减毒活疫苗的研制成果及临床试验进展作简要综述C关键词:人3型副流感病毒;疫苗;临床试验;病毒载体中图分类号：R373.P3文献标志码：A文章编号：1005.5673(2015)04-0061-08DOI：10.13309/ki.pmi.2015.04.013Progressofhumanparainfluenzavirustype3andthevaccinesHUOWen,BAIMu-qunLanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.Ltd,CenterforGansuPr

3、ovincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor-BAIMu-qun,E-mail:baimuqunAbstract:Humanparainfluenzavirustype3(HPIV-3)asacauseofbronchiolitisandpneumoniainchildrenlessthan6monthsold,andresultingaheavyburdenofdiseaseindevelopingcountriesaswellasindevelopedcount

4、ries.Inrecentyearsofresearch,especiallywiththedevelopmentofrecombinanttechnologyandreversegenetics,manyimportantprogresseshavebeenmadeinthedevelopmentofHPIV-3vaccinesbutthereisstillnoeffectiveantiviraltherapyandlicensedvaccineexistforHPIV-3infection,therefore,WHOhaslistedHPIV-3vaccineasthepriorityde

5、velopmentofvaccinesinthefuture.Inthispaper,thebiologicalcharacteristics,suchasvirusstructuralfeatures,thereplicationprocess,andtheepidemiologicalcharacteristicsofHPIV-3andrecentdevelopmentofvariousformsofHPIV-3vaccinesandprogressinclinicaltrialsforHPIV-3vaccinesarereviewed.Keyword:HPIV-3；Vaccines；Cl

6、inicaltrials；Viralvector人3型副流感病毒(HumanParainfluenzaVirustype3,HP1V.3)是Chanock等人于1957年从华盛顿一名患有急性呼吸道疾病的2岁患儿的咽拭子中分离出的，早期的研究发现其许多流行病学和传播特征与流感病毒相似,但进一步的病毒学研究发现，它是一种与流感病毒完全不同的呼吸道病毒，故将其划分到副粘病毒科(Paramyg诚奴)"。大量研究证明，HPIV-3是仅次于呼吸道合胞病毒(Respirawysyncyticalvirus,RSV)的可引起婴幼儿、老年人及免作者简介：火文，硕士研究生，主要从事人3型副流感疫苗的研发

7、工作。通讯作者:白慕群,E-maii:baimuqun疫力低下患者严重下呼吸道疾病的病原体。据估计,在发达国家每年由于HPIV-3感染导致的住院人数最高可以达到数万人，造成了很大的疾病负担；在发展中国家，由HPIV-3导致的下呼吸道感染疾病是引起婴幼儿死亡的重要原因。对于HP1V-3感染的预防和治疗，目前还没有特效的疫苗和药物，因此,WHO将HP1V-3疫苗列为未来重点研发的疫苗。目前，对HPIV-3的流行病学、结构特征和致病机制等基础性研究已较为成熟，但对HPIV-3的感染仍缺乏有效的治疗药物和预防性疫苗，而研发新型抗病毒药物和安全有效的HPIV-3疫苗成为现今学术界的研究热点。本文就HPI

8、V-3的病毒学基础、流行病学特点、致病特征及近年来预防性疫苗研究进展等方面进行综述。1HPIV-3的生物学特性1.1HP1V-3的结构特征HP1V-3属于副粘病毒科，呼吸道病毒属。其生物学特性与副粘病毒相似，具有副粘病毒典型的结构特征。它是一种有包膜的单负链RNA病毒，在电镜下呈以球形为主的多形性，其病毒颗粒直径一般为120180nm,核衣壳呈螺旋对称形。HPIV-3基因组全K约15400bp,依次编码6种蛋白：核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素.神经氨酸酶（HN）和大分子蛋白（L）。这6种蛋白以3'-NPP-MFHNL-5,的顺序排列在其负链RN

9、A的基因组中。病毒包膜由脂质和糖蛋白组成。包膜外表面存在两种主要与病毒毒力相关的糖蛋白：血凝素-神经氨酸酮（HN）和融合蛋白（F）。其中HN蛋白属于II型膜融合糖蛋白（N端在胞内,C端在胞外），具有红细胞凝集活性、神经氨酸前活性、受体识别活性以及促细胞融合作用。Takimoto等对HN蛋白介导细胞融合机制的研究发现，HN蛋白头部及躯干区域的完整性对其神经氨酸酶活性及受体识别活性有很大影响;褚福禄等的研究发现,HN蛋白的慵基化及其N-糖链的完整性对HN蛋白的折叠、生物学活性有重要作用。另一种包膜糖蛋白是F蛋白，属于I型糖蛋白（C端在胞内，N端在胞外），具有促进细胞融合和溶血的作用。对F蛋白裂解位

10、点的研究发现，裂解位点中碱性氨基酸残基的比例与病毒的裂解能力及毒力成正相关3。这两种蛋白都与病毒感染密切相关,它们相互作用，在病毒吸附靶细胞表面和侵入靶细胞的过程中起决定性作用。因此所有基因型的人副流感病毒（肌如。ParainfluenzaVirus,HPIV）的致病性和免疫原性等重要生物学特性，都取决于其HN和F蛋白的结构和功能。同时针对这两种蛋白的抗体对病毒具有中和作用，因此HN和F蛋白是疫苗研究的主要靶蛋白。目前，对HP1V-3的这两种蛋白分子的研究已相当深入，这对HPIV-3反向遗传学疫苗及亚单位疫苗的开发奠定了坚实的理论基础。病毒包膜内表面还存在非糖基化的内膜基质蛋白（M）,与病毒的

11、装配和释放有关，在保护病毒内膜的完整性中起到关键作用。另外三种蛋白NP、P和L是与病毒基因组RNA（vRNA）有关的非结构蛋白。这3种蛋白质"与vRNA结合形成病毒核糖核蛋白复合体,参与病毒RNA的转录和复制（9NP蛋白可绑定在vRNA上，为L和P蛋白的转录提供模板。除了表达这6种必需的蛋白质外，每个基因型的HPIV都可从P基因的开放性阅读框中至少表达出另外一种具有一定功能的其他蛋白质。例如，HPIV-3及HPIV-1可编码一种短的C蛋白，该蛋白可增强病毒抗I型干扰素反应的能力，使得病毒在机体内有效复制，同时对病毒在机体内的免疫逃逸作用有一定影响;而HPIV-2可编码另一种V蛋白，其

12、C末端包含一个富含半胱基酸残基的保守区域©,近期研究发现,V蛋白可与NP蛋白结合，在病毒复制中起调节作用，同时V蛋白也可通过延长细胞凋亡周期使病毒大址复制。12HP1V-3的复制过程HPIV-3感染宿主细胞的第一步是将病毒粒子上的HN蛋白绑定在宿主细胞膜蛋白的唾液酸受体上，接若F蛋白介导病毒包膜与宿主细胞膜融合，促使病毒进入宿主细胞但揪合过程也受到以下两方面的限制，二者缺一不可:F蛋白必须在同源HN蛋白的协助下才能激发其:融合活性,才能进一步完成融合过程;同时，在F与同源HN相互作用的过程中,F蛋白必须经过宿主细胞水解酶作用，使其裂解为由两个二硫键连接的亚单位Fl、F2后,F蛋白才具

13、有融合活性，如果宿主细胞中缺乏这种水解酶，就会产生非感染型病毒,使病毒难以复制。膜融合过程释放出核衣壳，使病毒基因组进一步复制。由于HPIV-3中的负链RNA不能直接行使mRNA的功能，因此该负链RNA需经病毒待异性RNA依赖的RNA聚合酶在起始基因和终止基因信号的指导F,先合成一个单独的mRNA链，再以其为模板合成新的负链RNA,病毒基因组则以此种方式循环复制。同时细胞内的核糖体可翻译病毒mRNA合成相关蛋白。复制出的子代RNA由NP蛋白紧密包裹形成核衣壳后,再聚集、组装成病毒颗粒,从在宿主细胞膜上通过出芽方式释放到细胞外。感染过程中形成的子代HPIV-3病毒，通常可由有纤毛的呼吸道细胞表面

14、释放到呼吸道内腔中，这种定向芽生作用通常也将HPIV-3的感染仅局限于呼吸道中。但对于免疫功能低下的患者JIPIV-3感染通常会引起严重的全身性感染o1.3HP1V-3的流行病学特征HP1V是常见的社区获得性呼吸道感染的病原体,它的流行不受种族、社会经济条件、性别、年龄和地理位置的限制，呈全球性分布。其可引起多种临床综合征，如反复发作的轻微上呼吸道感染或更严重的下呼吸道感染。HPIV根据抗原性及血清型不同，可分为4个血清型及2个血清亚型（HPIV-l、2、3、4、4a和4b）。虽然各型别的结构和生物学特征相似，但其最适感染人群、流行病学特征和所引发的临床疾病等都有很大差异HPIV-I和HPIV

15、-2±要引起交替出现的流行性感染.在小儿的喉炎病例中，由它们引起的感染占30%50%oHPIV-3常在春夏两季暴发，通常引起婴幼儿的下呼吸道感染，是仅次于RSV的引起6个月以下婴幼儿细支气管炎和肺炎的第二大病原体。据估计，在住院治疗的下呼吸道感染的婴幼儿中，约12%由HPIV-3病毒感染引起。HPIV-4是最不常见的血清型，通常感染年龄较大的儿童及老年人。在HPIV的4个血清型中,HPIV-3是可引起婴幼儿下呼吸道严重疾病的病原体，在全球范围内造成沉重的疾病负担和死亡。它主要引起1岁以内婴幼儿的肺炎和支气管炎，是引起婴幼儿死亡的重要原因；HPIV-3还是学致老年人、慢性病患者和免疫力

16、低下的成年人（例如器官移植、HIV患者等）下呼吸道疾病的重要病原体，尤其是实质性器官移植或造血干细胞移植的病人，经常伴有严重的HPIV-3感染性疾病,其中约55%可发展为肺炎，病死率达到27%（,2o在美国，每1000个儿童中就有约8人因HPIV感染进行住院治疗，其中2岁以下的罂幼儿占到了约75%°项来自NewVaccineSurveillanceNetwork（NVSN）历时近4年（2000年10月一2004年9月）的调查结果显示"幻，在因发热和急性呼吸道疾病而住院治疗的W5岁的儿童（近2800人）中，约190人由HPIV感染所引起，占到了近7%,其中因HP1V-3感染的

17、儿童占到50%。张鹏等*对中国20092011年的HPIV-3型的流行病学做了调查，甘肃省和陕西省的719例患有急性呼吸道感染疾病的儿童中共检测出67份HPIV阳性标本，其中HPIV-3感染儿童50人,占到了HPIV感染者的约75%,与其他呼吸道病毒发生共同感染的HP1V-3阳性标本30份，在HPIV-3引起的呼吸道感染中,7岁以下的患者占感染总人数的40%。刁娟蛆等:对国内济南、沈阳及南京地区2009年4月一20】1年1月的973例小儿急性上呼吸道感染疾病，患者做了调查，结果显示这些患儿中有5.65%感染了HPIV。机体对HPIV-3的感染不能产生持久、有效的免疫保护，因此此病毒感染可终生发

18、生；而HP1V-3所引起的临床症状与流感相似，不能使所有该病毒感染者都得到明确的病毒学检查，这也成为了HPIV-3流行病学调查的首要限制因素。1.4HPIV-3感染的免疫应答机制机体预防HPIV-3的感染通常涉及体液免疫和细胞免疫【。机体自然感染HPIV-3后产生的黏膜分泌型IgA可中和病密，在阻断子代病毒由上皮细胞表面到呼吸道腔内的定向芽生的过程中起到一定作用，因此可保护上、下呼吸道免受感染;血清中产生的针对两种病毒表面糖蛋白HN、F的IgG抗体对HPIV-3具有中和活性，高滴度的血清抗体在长期保护机体免受HPIV-3的感染中发挥重要作用。机体对病毒编码的其他蛋白，如P蛋白,所产生的抗体也具

19、有保护机体免受HPIV感染的特性"5。因此，黏膜和鼻腔细胞中产生的局部抗体及血清中的全身性抗体都对机体的保护性应答具有重要作用。在疫苗的实验室研究中，黏膜抗体也已成为评价疫苗免疫效力的一项重要指标，因此有效的HPIV-3疫苗必须能在机体内引发全身或局部黏膜的中和抗体应答。HPIV-3的HN、P和NP蛋白中均存在T细胞表位，其介导的细胞毒性T淋巴细胞的免疫应答在清除下呼吸道病原体、保护机体免受再次感染的过程中起到主要作用。在受HP1V感染的患者的肺部都可检测到白细胞介素-2（IL-2）、IL-6、IL-10、y-干扰素（IFN-y）和肿瘤坏死因子-a（TNF-a）等炎性因子的分泌。在机

20、体的细胞免疫应答过程中，细胞毒性CD4*T细胞和CD8*T细胞起到关键作用。HPIV-3感染所激发的CD4*T细胞可通过分泌细胞因亍，对适应性免疫应答进行间接调控，包括B细胞分化的应答修饰、巨噬细胞活化、CD"记忆性T细胞应答以及在病原体清除后下调应答反应的过程中都起到重要作用；也可通过分化为具有分泌不同细胞因子功能的子细胞系从而抵御不同的病原体感染HPIV-3感染使得CD*T细胞通过激活树突状细胞、活化受感染的宿主细胞的杀伤性来清除病原体。在HPIV-3感染过程中，机体也可通过精密的细胞免疫调节机制，最大程度降低病毒所引起的病理损伤：例如在机体感染HPLV-3后，诱导CD4+T细胞

21、分泌的各种炎性因子可阻断HP1V-3病毒的转录过程；而由HPIV-3感染所激发的T细胞可同时分泌IL-10,抑制II型主要组织相容性复合体抗原（MHC-II）在抗原提呈细胞中的表达,从而下调T细胞的增殖性反应，保护T细胞免受由病毒感染引起的细胞凋亡C可见,有效的HPIV-3疫苗除能在体内引发中和抗体外，也要能诱导产生可分泌IL-2、TNF-Q和IFN-y的多能CD4+T细胞2HPIV-3疫苗的研究在HPIV的4个血清型中，HPIV-3感染最为常见，因此更多学者致力于HPIV-3疫苗的研制工作。婴幼儿是HPIV-3感染的主要易感人群，且感染常发生在出生后的前几个月。由于婴幼儿免疫系统发育不完善，

22、抗体应答能力较弱、持续时间较短，因此易发生反复感染。这就要求一个好的HPIV-3疫苗不仅可以在婴幼儿体内引发有效的黏膜及血清抗体保护性免疫应答，而且还必须在幼儿体内具有良好的安全性。在几十年的不懈努力下，对HPIV-3减毒活疫苗的研究已逐渐成熟，许多候选疫苗进入了全面临床评估阶段，为后续进一步的临床试验积累了大量数据。近年来，随着分子生物学及反向遗传学技术的发展，国内外研究人员在先前疫苗研究的基础上，尝试开展了一系列HPIV-3新型疫苗的研制工作，也取得了可喜的进展。21减毒活疫苗最初采用传统的福尔马林灭活的方法研制了HPIV-3灭活疫苗，该灭活疫苗与RSV灭活疫苗相似，由于其在棉鼠体内并不能

23、诱发有效的免疫应答保护，反而伴有疾病增强作用，因而宣告失败狈。此后，科学家们主要致力于HPIV-3减毒活疫苗的研制工作。2.1.1牛3型副流感病毒Parainfluenza忧-ru5t）pe39BPIV-3）减毒活疫苗BPIV-3和HPIV-3在基因构成上有很多相似之处,两种病毒具有25%的中和抗原相似性，因此BPIV-3诱导的免疫应答对HP1V-3有交叉保护作用由于宿主范围限制作用,相比于HPIV-3,BPIV-3在恒河猴呼吸道内的复制能力降低了近9/10倍。因此，科学工作者首先仿照牛痘预防天花的策略，将从患病动物体内分离出的BP】V-3（Kansas株）作为一种减毒活疫苗用于预防HP1V-

24、3的感染。Karron等在26月龄及6-36月龄的婴幼儿中对该疫苗进行了I期临床评估，结果显示，该疫苗在两个年龄段的儿童中都具有良好的适应性;相比于26月龄的婴幼儿，该疫苗在636月龄的婴幼儿中诱发的抗体应答水平更高;且在26月龄的婴幼儿中，如其母源性抗体较低反而可诱发更高的抗体应答反应。这可能是由于年龄较大的儿童胸腺发育较为成熟，细胞免疫在促进机体内体液免疫应答的过程中起到一定作用。虽然母源性抗体可保护26月龄的婴幼儿免受HPIV-3感染，但也对BPIV-3减毒活疫苗中活病毒的复制起到一定的抑制作用。该项研究证明,BPIV-3对6个月以下的婴儿具有良好的保护其免受HPIV-3感染的作用，但对

25、可诱发更高免疫应答的免疫程序还需做进一步研究。Greenberg等对BPIV-3在2月龄的婴幼儿中所做的II期临床试验更进一步证明，其可在该年龄段的婴幼儿体内稳定复制，同时免疫原性良好，但其安全性还需要进一步的临床研究。2.1.2冷适应减毒活疫苗为了得到HPIV-3减毒株,Belshe等尝试对分离自患有下呼吸道疾病儿童的HPIV-3野毒株进行冷传代培养，得到了冷适应株HPIV3cp45o在HPIV-3野毒株冷适应连续传代的过程中，其温度敏感性日益增加、毒性逐步降低。同时发现,所有具有温度敏感性突变的毒株都同时具有冷适应特性，但具布冷适应特性的毒株不都具有温度敏感性表型。这提示，冷适应株的温度敏

26、感性表型可能由于某些基因突变引起1241o（据文献25报道,这可能是由于L蛋白中三个氨基酸突变引起），且这种基因水平的突变具有遗传稳定性。因此这种既具有减毒表型又具有温度敏感性的冷适应株HPIV3cp45为HPIV-3减毒活疫苗的发展奠定了基础。HPIV3cp45候选疫苗I期和II期临床试验结果表明，其在婴幼儿中具有良好的免疫原性和安全性。Belshe等8对cp45疫苗做了II期临床试验，在226个HPIV-3血清学抗体阴性的618月龄的儿童中，114人接种HPIV3cp45疫苗、112人接种安慰剂，接种疫苗后的血清抗体检测结果显示，疫苗组接种者中84%有4倍抗体滴度升高，同时无不良反应。HP

27、IV3cp45疫苗在婴儿体内可诱发有效的免疫保护应答,是较有希望的HPIV-3疫苗。目前，该疫苗的HI期临床试验正在进行中。尽管HPIV3cp45目前在体内、体外试验中都具有很好的减毒表型，但存在随样本量扩大而不稳定的可能。2.1.3反向遗传学技术制备的减毒活疫苗反向遗传学技术利用RNA病毒基因组或反义基因组的cDNA,拯救出具有感染性的病毒，该技术是目前产生毒力减弱突变以获得减毒活疫苗的重要工具。以HPIV-3基因组为骨架的反向遗传学减毒活疫苗利用反向遗传学技术，对HPIV3cp45所有已知的突变位点进行定点突变，得到了对温度更加敏感,同时进一步减毒的重组减毒活疫苗rHPIV3cp45oEn

28、glund等m对rHPIV3cp45疫苗在HPIV-3血清抗体阴性儿童中的免疫效果做了评价。在这项研究中,40名6-36月龄的HPIV-3血清抗体阴性的儿童被随机分为2组（约2：1）,27名受试者接种两剂IO,TCID剂量的rHPIV3cp45、其余受试者接种安慰剂。结果显示，疫苗组在接种一剂疫苗后，rHPIV3cp45可在约96%的婴幼儿体内进行病毒复制;在6个月后的第二剂疫苗接种后，病毒只可在35%的婴幼儿体内复制。且一剂接种后血清中的抗体滴度明显高于第二剂接种后的抗体滴度，同时不良反应无明显差异。该结果显示，rHPIV3cp45叮在血清学阴性的儿童中诱导抗体应答且减毒充分，同时其具有良好

29、的复制能力、免疫原性和适应性，两剂接种可显著提高机体保护性免疫应答U。!。在进一步的临床试验中应优化免疫程序，延长两剂接种的时间间隔，以期激发更高水平的保护性免疫应答。Karron等家的研究进一步显示,rHPIV3cp45与生物源性的HPIV3cp45具有相似的生物性质。同时rHPIV3cp45也可作为疫苗载体，在HPIV-1疫苗研制中得到了良好的应用。Madhi等用野生型HPIV-1的HN和F基因代替rHPIV3cp45毒株HN和F基因的阅读框，构建了一种重组的嵌合病毒疫苗。该疫苗不但可保护仓鼠免受HPIV-1感染,且由于基因框架替换.相比于rHPIV3cp45,其毒性进一步减弱。这项研究也

30、为新型人用HPIV-1疫苗的发展指明了Q好的前景。利用反向遗传学技术以BPIV-3具有感染性的cDNA为骨架，拯救得到了含有电组病毒株r-BPIV3的减毒活疫苗。r-BPIV3在体外显示出温度敏感表型，在动物的体内实验中显示出减毒特性。进一步用HPIV-3的HN及F基因替换BPIV-3HN及F基因的阅读框架，利用反向遗传学技术构建出的嵌合重组病毒rB/HPIV-3在体外也具有温度敏感表型。虽然rB/HPIV-3在动物中的减毒程度没有r-BPIV3强烈,但这两种疫苗都可保护小动物免受野生型HPIV-3的感染。rB/HPIV3与rHPIV3cp45有相似的减毒特性及复制能力，目前，它在636月龄婴

31、幼儿中的临床试验正在进一步研究中刈。上述数据同时证明r-BPIV3因具有宿主范围限制及减毒特性,可将其作为一个病毒载体来表达外源基因，从而研发出更多新型的减毒活疫苗O2.2亚单位疫苗亚单位疫苗是指由纯化的一种或几种致病病原体的保护性抗原组分组成的不含核酸的非复制型组分疫苗.其含有的保护性抗原成分能诱发良好的免疫应答。亚单位疫苗的主要组分为蛋白质，是一种T细胞依赖抗原，但由于婴幼儿的免疫系统发育不完全，其对婴幼儿的保护效力一直受到争议。HPIV-3的HN及F蛋白与病毒感染密切相关，并旦这两种蛋白含有有效的中和抗原表位,针对这两种蛋白产生的抗体对该病毒具有中和作用，因此HN和F蛋白是HPIV-3疫

32、苗研究的主要靶蛋白。为了对疫苗的主要组分有更深入的认识,Haller等首先将HPIV-3的HN及F基因分别插入删除了HN及F蛋白阅读框的cDNA克隆中，构建得到可分别表达HN及F糖蛋白的重组病毒。这两种审:组病毒疫苗都对棉鼠具有良好的保护作用。相比之下，表达HN蛋白的重组病毒疫苗可比表达F蛋白的重组病毒疫苗在棉鼠体内诱发更强的免疫保护。Brideau等_将HPIV-3HN蛋白的N端及F蛋白的C端截去（截去胞内区，保留胞外区），将两种蛋白的胞外区融合成一个嵌合糖蛋白（FHN）免疫小鼠,结果显示,100ng剂械的FHN就可对棉鼠起到完全保护;FHN上的T细胞识别表位可在小鼠体内诱发直接针对HN及F

33、蛋白的细胞免疫应答，且引发的免疫应答保护效果强于由两种糖蛋白（HN或F）单个免疫或将两种单个糖蛋白混合后再免疫所产生的保护效果。这可能是由于两个蛋白嵌合后的相对分子质量变大，提高了蛋白的免疫原性与抗原提呈能力;也可能是由于FHN嵌合蛋白可折叠成一个结构更正确的构象，使该蛋白正确裂解成两个亚单位（这在RSV的嵌合糖蛋白FG中也得到了证实）。尽管亚单位疫苗在动物试验中取得了良好进展，但其都还处于实验室研究阶段，没有进入临床试验，其在人体特别是婴幼儿中的免疫效力还需要进一步的临床研究来证明。在亚单位疫苗的研制过程中,将保护性抗原成分与新型有效的疫苗佐剂联用，得到可同时激发保护性体液免疫及细胞免疫的新

34、型疫苗，在今后也将是一个-更要的研制方向。3HPIV-3疫苗与RSV疫苗的结合由于IIP1V-3与RSV具有相同的易感人群，旦两种病毒诱发的疾病也十分相似，因此研发同时针对这两种病毒的疫苗成为一个重要的研究方向。3.1同时抗两种病毒的亚单位疫苗Homa等以RSV的F蛋白（1488个氨基酸）及HPIV-3的HN蛋白（87-572个氨基酸）为主要抗原，构建了一种嵌合糖蛋白FrHNp，作为一个新型的亚单位疫苗，可同时抵抗两种病毒的感染。该研究发现，在棉鼠中50ng的FrHNp就可引发同时针对这两种病毒的特异性中和抗体，且对病毒在动物肺中的复制水平有显著抑制作用（W10,倍）;200ng可对棉鼠起到完

35、全的保护。Brideau等用真核表达系统表达了两种分别由RSVF和G糖蛋白的胞外区（FG）和HPIV-3HN和F糖蛋白的胞外区（FHN）组成的嵌合糖蛋白，山这种嵌合蛋白制成的亚单位疫苗在动物试验中可对这两种病毒产生良好的免疫反应，且大部分中和抗体由RSV的F糖蛋白和HPIV-3的HN糖蛋白诱导产生。该研究不仅证明亚单位疫苗具有良好的保护效力，更为后续RSV及HPIV-3亚单位疫苗组分的研制工作指明了方向。3.2抗两种病毒的重组减毒活疫苗利用BPIV-3的cDNA为载体，插入HPIV-3的HN和F基因，得到可表达HPIV-3HN和F蛋白的且具有良好免疫原性的rB/HPIV3；再向其中插入RSV的

36、F基因，构建出重组嵌合减毒活疫苗rB/HPlV3-RSVF（MEDI-534）oMEDI-534同时具备rB/HPlV3的宿主范围限制及减毒特性，又含有RSV的保护性抗原，是第一个作为RSV疫苗在RSV抗体血清学阴性的儿童中进行临床评估的疫苗。近年对MEDI-534的临床前及临床研究有了很大进展。Tang等叫首先对其在非洲绿猴中的保护效力进行了评价，结果显示该疫苗在非洲绿猴中可同时引发抗HPIV-3及RSVF蛋白特异性血清IgG抗体应答，对RSV的感染具有一定保护作用。近年对该疫苗的临床评价也陆续展开。Bernstein等以6-24月龄的儿童为对象，对该疫苗进行了I期临床试验。结果显示,疫苗组

37、与安慰剂组所引发的不EL反应无明显差异，且在第一剂免疫后的710天就可有病毒复制，接种后在体内均可检测到对RSV及HPIV-3的体液免疫。该结果与Gomez等36及Yang等对该疫苗所做的I期临床试验结果相似，证明了MEDI-534在儿童中应用的安全性，也为该疫苗在儿童中的进一步试验奖定了基础。同时，利用相同方法也构建出了可同时表达RSVG和F蛋白的嵌合减毒活疫苗（rB/HPIV3-RSVF+G）,但其尚未进入临床试验°。Liang等的研究显示，将RSV的F蛋白插入到rB/HPIV3基因组的不同位置构建的疫苗在儿童中的免疫原性及基因稳定性也不同C4HPIV-3作为病毒载体的应用利用R

38、NA病毒为载体制成的减毒活疫苗可表达外源基因，近年来受到研究者的广泛关注。相比于DNA病毒载体,RNA病毒载体具有很多优势:在病毒复制的整个过程中没有DNA存在的阶段，可大大降低将其基因组整合到人类基因组DNA的风险;目前没有研究显示负链RNA病毒可异源重组,其具有基因稳定性;负链RNA病毒在基因蛆末端3959处具有阻断转录倾向性,这可使病毒蛋白含量在转录及表达过程中逐渐降低，因此可以借助其基因组的这种特性对所插入的外源基因的表达虽进行调控;在病毒基因组中插入异源序列后，对原病毒本身就具有减毒作用，这在另一方面又增加了负链RNA病毒作为载体在疫苗中应用的安全性。现今已有许多RNA病毒作为载体用

39、于表达外源蛋白，例如仙台病毒、流感病毒、麻疹病毒，该技术已十分成熟且都已进入规模化生产而HPIV-3也具有许多作为载体的优良特性，可用作疫苗载体来表达外源基因。将外源基因插入到HPIV-3具感染性的cDNA中,构建一个可表达外源基因的更组病毒载体，目前这项技术已在多种蛋白表达及疫苗研制中得到了广泛应用。Roth等将绿色荧光蛋白（EGFP）基因插入到HPIV-3的cDNA中，拯救出一个可高效表达EGFP、同时具有抗原性和感染性的重组病毒rH-PIV-3-EGFP。研究显示，将EGFP基因插入到rll-PIV.3中后，使病毒基因组变大，且插入的特异性的外源基因使得病毒本身的下游基因组的复制及mRN

40、A转录活性受到限制，从而使rHPIV-3-EGFP具有减毒特征。前文已对HPIV-3.BPIV-3及rB/HPIV-3作为病毒载体在相应疫苗研制中的应用作了介绍，除此之外，在麻疹病毒疫苗研发中，利用重组的HPIV-3表达麻疹病毒的主要保护性抗原血凝素蛋门，构建出二价HPIV3-measles疫苗，经滴鼻免疫接种后对麻疹病毒也具有良好的免疫保护效果OBukreyev等“”利用反向遗传学技术，用埃博拉病毒（EROV）的糖蛋白基因（GP）替换HP1V-3载体的相应部分（HN及F搪蛋白），得到了一种减毒的抗原嵌合病毒疫苗一用致病性病毒的目的基因,替代载体本身的主要保护性抗原表位而制成的疫苗，HPIV3

41、/DeltaF-HN/EboGP。相比于传统的埃博拉病毒疫苗.该疫苗在动物模型中诱导产生的抗体应答水平更高。相信随着反向遗传学技术更深入的研究和应用,HPIV-3作为病毒载体在高效表达外源性蛋白及其他病毒的免疫靶蛋白而制备嵌合病毒疫苗的应用中都具有广阔的前景。5展望近年来，反向遗传学技术的发展为从cDNA构建出新型的病毒疫苗奠定了理论基础，同时HPIV-3疫苗也在此项技术发展的基础上得到了很多可喜的结果。其中BPIV-3、HP1V3cp45及rHPlV3cp45等减毒活疫苗已有了1/H期临床试验评估数据，这为更多具有良好免疫原性、可用于婴幼儿的HPIV-3疫苗进入III期临床试验积累了大量经验

42、。但在对以上疫苗进一步的研究中，怎样的免疫程序可激发最高的保护性免疫应答仍然需要大量临床试验数据。在亚单位疫苗的发展中，需将保护性抗原成分与新型有效的疫苗佐剂相结合的方向上进行一系列探索。未来研发同时针对HPIV-3及RSV两种病毒的疫苗也将成为一个重要的研究方向。HPIV-3作为新型病毒载体，也为其他型别的HPIV疫苗乃至更多异源疫苗的研制开辟了新的途径。相信随着生命科学的不断发展及更多研究人员的共同努力，一定会研发出安全有效的HPIV-3疫苗。参考文献1雷小英.彭东红.人副流感病毒的研究进展J.儿科药学杂志,2012,18(11)：54-59.2：HenricksonKJ.Parainfl

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