以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗研究进展.docx

1、ingeneexpressionpatternsinhumancancercelllinesfj.NatGenet,2000.24(3)：227-235.3SimpsonRJ,BernhardOK»GreeningDW,etal.Proteomicsdrivencancerbiomarkerdiscovery：lookinglothefuturclJ.CurrOpinChemBioL2008»12(l)：72-77.4RabilloudT.Two-dinicnsionalgelelectrophoresisinproteomics：old,oldfashioned,buti

2、tstillclimbsupthemountains.Proteomics,2002»2(1)：3-10.5jMoritzRLJiH,SchutzF,etal.Aproteomcstrategyforfractionatingproteinsandpeptidesusingcontinuousfreeflowelectrophoresiscoupledoff-linetoreversed-phasehigh-performanceliquidchromatographyJ.AnalChem*2004,76(16):4811-4824.i 6BjorhallK«Milioti

3、sT,DavidssonP.Comparisonofdiffer-entdepletionstrategiesforimprovedresolutioninpro-tcomicanalysisofhumanscrumsarnplvs)J.Proteomics,2005.5,307-317.7GongY.LiX,YangB,etal.DifferentimmunoaffinityfractionationstrategiestocharacterizethehumanplasmaproteomeCJj.JProteomcRes,2006,5(6)：1379-1387.81ZhangH,YiEC.

4、LiXJ*etal.HighthroughputquantitativeanalysisofserumproteinsusingglycopeptidecaptureandliquidchromatographymassspectrometryJJ.MolCellProteomic3t2005»4：144-155.9 BernhardOKKappLA,SimpsonRJ.Enhancedanalysisof(hemouseplasmaproteorneusingcysteine-containingtryp(icglycopepiidcsJJ.JProteomcRes.2007,6:

5、987-995.10 XuG.XiangCQ.LuY.etal.ApplicationofSELD1-TOF-MStoidentifyserumbiomarkersforrenalcellcarcinomaCJJ.Cancer1,31.2009,282(2)：2O5-2】3.11 AhnSM.SimpsonRJ.lk)dyfluidproteomics：prospectsforbiomarkerdiscoveryCJ.Proteomics-CiinApp【，2OO7,1.1004-1015.12|HuSJ-ooJA.Wongl)T.Humanbodyfluidproteomea-nalysis

6、)Jj.Proteomics,2006,6:63266353.13 ChenR,PanS,CookeK,etal.Comparisonofpancreaticjuiceproteinsfromcancerversuspancreatitisusingquantitativeproteomicanalysis。.Pancreas,2007,34：70-79.14 SilekB,LuttgesJ,MarcusK,etal.Applicationoffluorcsccnccdifferencegelelectrophoresissaturationlabellingfortheanalysisofm

7、icrodissectcdprecursorlesionsofpancreaticductaladenocarcinomaJ.Proteomics.2005,5:2665-2679.15 SardanaG«MarshallJ.DiamandisEP.Discoveryofcandidatetumormarkersforprostatecancerviaproteomica-nalysisofcellculture-conditionedmcdiumJ.ClinChem,2007,53:429-437.16 VolmerMW,StuhlerK,ZapatkaM,etal.Differe

8、ntialproteomeanalysisofconditionedmediatodetectSmad4regulatedsecretedbioniarkersincoloncancerJ.Pro-leomics,2005,5：2587-2601.17 ChevalletM.DiemerH.VanDorsscalcrA,c(al.Towardabetteranalysisofsecretedproteins：theexampleofthemyeloidcellssecretome|JJ.Proteomics.20077:1757-1770.18 KimSW,ChconK«KimCH&

9、gt;ctal.Proteomics-basedidentificationofproteinssecrciedinapicalsurfacefluidofsquamousmetaplastichumantracheobronchialepithelialcellsculturedbythreedimensionalorganotypicairliquidinterfacernethodLJl.CancerRes,2007.67：6565-6573.I19JKulasingamV,DiamandisEP.Proteomicanalysisofconditionedmediafromthreeb

10、reastcancercelllines：amineforbiomarkersandtherapeutictargetsJ2.MolCellProteomics2007,6:1997-2011.(收稿日期,200912-30)以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗研究进展王冠宇'，梁立敏'综述，夏民杰z审校（1.解放军第四五四医院检验科，南京210002；2. 南京医科大学基础医学院210000）【关键词】伤寒沙门菌；或体；口服疲苗中图分类号：R969.4文献标志码：A文章编号：1672-9455（2010）09-0871-04据估计，人类传染痢的90%起始于黏膜表面.病原体通过黏

11、膜入侵人体。黏膜是人体因有性免疫系统中很重要的防止病貌微生物人侵的生理屏障，除了黏膜本身特性所形成的物理屏障外，黏膜的免疫系统发挥r极其重要的作用。为了防止感染，诱导券膜表面产生sigA是非常重要的，而大多数皮下或肌肉给药方式的疫苗通常无法诱导黏膜sigA抗体的产生.口服活菌疫苗.可刺激黏膜淋巴细胞分泌sigA,形成一道屏障，能有效地防止经黏膜感染的微生物在黏膜表面定居和对宿主细胞的侵袭。伤寒是由伤寒杆圆引起的急性肠道传染病.主要经粪-口途径传播，水和食物污染是爆发流行的主要原因.1892年首次从鼠身上分离出鼠伤寒沙门弟（SD.1893年证实St可引起人食物中推，明确St诃使人、鼠共同致病之后

12、研究者发现,减毒沙门的，尤其是减毒St,可用作携带异源抗原经口侵入宿主免疫系统的载体.有效激发宿主抗诙种异源抗说局部和全身性的免疫应答，并已应用于细曲、病诲、寄生虫等疫苗的研制“近年来，应用各种基因工程方法构建沙门萌成莎株、研究毒力基因的功能和表达调控、利用减毒&作为活栽体表达外源抗原以及研制口眼多价疫苗等已成为该领域的研究热点。I减者St活载体口服疫苗的优点门服疫苗与传统的注射接种疫苗相比其有许多优点：模仿自然感染途径，保证大部分孙膜表面区域接触疫苗,开发了由sigA介学的第一道防线；高效,既能引起黏膜免疫反应.也能引起系统免疫反应避免注射引起的疼痛和不适.也可避免使用针头和针筒，减

13、少了污染的可能性；可覆盅大量人群，特别诂合年长者和婴儿，因为黏膜免疫不受与年龄相关的机能障碍的影响，而婴儿黏膜免疫系统的发育耍早于全身免疫；另外口服疫苗还有可能用于防治自身免疫反应和过敏反应,使用更方便。活细菌载体疫苗是目前疫苗研制的重要方向，活菌栽体疫苗向机体递送疫苗抗原.使抗原物质对黏膜的免疫剌激作用更接近于病原体的自然感染途径.不仅可有效地剌激肠道产生局部免疫应答，而旦可诱导机体产生特异性系统免疫反应，使机体获得全面的保护力.St作为疫苗载体只有以下优点：（1可以口服，易于大规模免疫接种；（2）因侵入淋巴系统，能更有效地激发宿主的体液和细胞免疫；（3）具有免疫佐剂的作用；（4）免疫具有持

14、续性，能够定居在宿主小肠和肠相关淋巴组织，不致羯，并且能稳定表达外源基因；（5）单次接种即可诱导机体产生全面的细胞免疫、体液免疫和愁膜免投应答；（6）所表达的靶抗原不需纯化，4直接用于免疫保护试验，免去r蛋白质后姓理的复杂工序；（7）价格低廉；（8）易于生产、储存和运输.2 Si菌株的特征及免疫机制St菌株的特征St是一种细胞内寄生曲，主要寄生于抗原提呈细胞中.革兰阴性，两端饨圆，大小宽为0.6-2.0Fm.长1.04.0m,有菌毛。通常具有周身靴毛.-般无英膜.能运动.兼性厌氧.最适培芥温度为37-C.营养要求不高，在普通琼脂培养基fl诃生长.在SS选择鉴别培养基上形成中等大小、无色半透明的

15、S型菌落。2.1 St的入侵机制St主要通过以下方式在机体内侵染和扩散毒素依赖型沙门前可分泌一种蛋白毒索.使分散在肠上皮细胞的M细胞的细胞膜和骨架变形.沙门痢得以经M细胞穿过上皮细胞屏障进入集合淋巴结小结中，被分布在此的抗原提呈细胞（APC）捕获携带至周围淋巴组织；（2）非毒索依赖型沙门菌能被肠黏膜中表达CD18的吞噬细胞吸收.经血流进入脾脏，诱发机体的系统免疫应答；（3）树突状细胞（DC）可以破坏肠上皮细胞屏障，以树状突起捕获作毒素依赖型沙门曲，使其穿过肠上皮细胞.携带沙门带的DC可以从肠内皮细胞迁至肠系膜淋巴结。小鼠模型研究证实，小鼠口服减毒沙门菌后.数分钟内即可在血液中检出带有减毒沙门萌

16、的单核-巨噬细胞.在淋巴结、脾脏和集合淋巴结小结内都可检出沙门菌的存在.2.2 St的免疫应答St通过M细胞进入黏膜下淋巴组织后可激活Th2细胞产生大届的白细胞介索艾，它能活化B细胞，并使之分化为浆细胞，在产生Ig的过程中发生向IgA的类型转换。肠黏膜上皮细胞还能产生分泌小体与双体【gA分子结合，形成分泌型IgA分泌到肠黏膜表而，slgA能抵抗肠道蚩白酣的分解作用，形成黏膜上的局部抗体在黏膜免疫中起重要作用.固有层CD4'T细胞受到细用抗原物质的激活，能产生干扰素增强单核巨噬细胞的吞咚作用，从而杀灭细胞内的寄生物，起到细胞免疫作用。一般减毒St仍有良好的侵袭力，因此它进入机体的方法与野

17、毒株相似，都是穿过M细胞进入机体.但M毒后毒力明显下降，对M细胞的细胞毒作用可能没右或很小.具有侵袭力的沙门菌m选择性地入侵派氏集合淋巴结的M细胞并破坏M细胞，然后被位于上皮下容隆区的APC捕获，之后APC再与相关免疫细胞相互作用.从而产生局部帖膜免疫、体液免疫以及细胞免疫应答。3 St减毒株的构建及其口服疫苗的应用研究RalE突变株及其疫苗应用减毒伤寒沙门lWTy21a是Germanier于1975年用化学诱变剂亚硝基弧诱变及紫外线照射诱导非定点突变Ty2株得到的.Ty21a株已有商品化生产，并已获准用于人体,Ty2】a具有galE突变，不能合成Vi英膜抗原.galE编码UDP半乳糖4异构解

18、，缺失后不能完成UDP半乳慵与IJDP箭匐糖的互换，而半乳摭残基是野生型伤寒杆馆光滑型LPS。抗原的更要成分,Ty21a在无半乳精条件下为粗槌型无免疫原性.Ty21a是一种很有用的典型活凿苗，但它免疫后仅提供中等程度的保护作用，疫苗接种后3年人群保护率可达67%,5年后疫苗的保护率为62%.旦接种者对曲茴配方及摄入剂依过于敏感.用化学诱变的方法产生突变株具有很大的有H性，除造成galE基因缺损外，还将造成其他已知的和未知的基因缺损.因而在疫苗的制备过程中，质估很难控制。Fraillcry等研究表明,Ty2U可用作外源基因表达的很好载体，在诱导抗伤寒沙门曲抗体的同时，能产生针对人乳头痛病毒16型

19、的部分保护.3.1 ar。基因缺失株及其疫苗.应用aroA基因编码5-烯隙丙闭酰莽草恢3-磷酸合成酸催化的是合成对氨基苯甲酸和2,3-二须基革的中间反应.1981年,Hioseth等用TnlO转座子随机插入法插入到aroA基因中.构建了aroA基因缺陷的减毒的StSL3261和SL3235。Ashby铲以2X10%fu重组菌SL3261表达破伤风毒素C片段（TetC）,通过流胃途径免疫新西兰兔，免疫后4周发现该萌苗能诱导免产生较高滴度的血清抗TetC抗体.研究表明.以SL3261为载体表达的外源抗原经口服免疫新西兰兔其有良好的免疫原性。虽然该突变株在哺乳动物体内几乎不能得到这些化合物，但并不影

20、响营并缺陷株的感染性，且有很好的免疫原性。然而，当aroA突变株得到野生型细菌D、A时，存在毒力回复突变的可能性。基于安全考虑，研究者们引入了2个戒3个特定突变的沙门菌疫苗株，如aroA/waaN突变株、aroA/aroD突变株（GID10KG1D105和G】D509）、aroC/aroD双缺失株（CVD906和CVD908）、htrA/aroA突变株、aroC/aroD/htrA缺失株等.Xu等以减毒StaroA缺失株SL7207为载体表达幽门螺杆H.pylori）尿素酬B亚单位.口服免疫小械，并于免疫后4周进行攻击实验.发现该疫苗叮有效保护小鼠免受H.pylori的攻击。Woo等以成毒St

21、aroA缺失株SL7207为载体表达HBsAg.以6X10%fu剂量口服免疫小鼠.研究表明，与DNA疫苗免疫相比，活前疫苗能诱导更强的CTL反应.3.2 cya/crp缺失株及其疫苗应用cya和erp是研究非常深入的沙门菌毒力调节基因.cya编码环化腺昔酸合成酬和erp编码cAMP受体蛋白在转录水平上调廿多种基因的表达，在运输双糖和氮基酸及合成纤毛、倒毛、鞭毛和至少一种外膜蛋白的过程中发挥政要作用.1987年.Curtiss和Kdly,l构建了St的cya和erp缺失的突变株"062、乂4064、乂4989及X499O等，研究证明，口服此减毒株具有高度免疫原性且高度减推。cya和er

22、p基因在染色体上相距IImin,二者同时回复突变的可能性比较小.asd基因编码天冬氨酸0半乳糖脱冬酶催化的反应是细蔺合成二氛基度二酸的中间步骤，DAP的缺失使革兰阴性菌不能形成完好的细胞壁，最终死亡如asd/cya/crp缺失突变株x4072等.徐引弟等!利用我国广泛使用的猪霍乱化学致弱毒株C500.构建了erp/asd双突变株，即宿主栽体平衡致死系统.毒力降低，但对免疫原性影响不大，可高效表达外源基因。将来源于鼠伤寒的P22转导鸡沙门菌构建erp基因缺失株.导致鸣沙门前完全减毒口服免疫10d后能完全保护野毒株的攻击，所有生化影响除毒力外可以由来自鼠伤寒携带crp基因的质粒pSDl10互补，c

23、rp缺失毒株nJ能成为针对将伤寒的候选疫苗Nayak等口"将含PspA基因的pJD4347与pYA3148重组得pYA3】93,转染St减帝株X4550,构建rSt-PspA疫苗x4550(pYA3193),将109cfu疫苗口服免疫BALB/c和CBA/N鼠2次或用10,0cfu疫苗口服免疫新西兰兔2次，末次免疫后4周用WU2有毒抹朴脉注射进行攻击，发现免疫鼠血清IgGJgM和IgA增加，阴道冲洗液】gG和IgA升高，免疫兔血清和阴道冲洗液IgG增加，HALB/c鼠用3XlOfu有毒株攻击后,66%(23/35)免疫成存活，BALB/c免疫鼠血清被动转移给CBA/N鼠，可抵抗l(T

24、cfu铮脉注射或10'cfu腹腔注射的有毒株攻击。3.3 Dam和phoP/phoQ缺失株及其疫苗应用沙门演的Dam基因编码DNA腺昔酸甲基化酰至少调节由PhoP激活的40种基因的表达，而PhoP/PhoQ基因编码转录激活因子/传感器激酶。如Dam/PhoP/PhoQ三突变株ZJ】11、伴调节基因phopc基因缺失的营养缺陷型突变株乂4632等.Heithoff等"s发现.dam基因突变的St完全能在小仗的PP和小肠荔膜定居增殖至少5d,从而引起免疫反应，同时对深层组织定居有严就缺陷，对小鼠高度减毒.1989年.Miller等'构建了PhoP/PhoQ联合突变的St液

25、毒株。PhoP突变会削弱细苗在巨噬细胞内的存活能力，它调节的是编码细菌在巨嚏细胞中存活所必需的一种分泌蛋白或包膜蛋白的基因。研究证明该减毒株安全性较好口能产生良好的免疫反应。Angelakopoulos和Hohmann'”，以StphoP/phoQ/purB缺失株ATCC14028为载体表达H.pylori麻酶抗原，并首次在志嗥者身上进行了测试。研究表明，单剂曜口服免疫58X10，cfu疫苗的具有较好的安全性，且与碱褊St相比，M毒St能诱导更强的针对外源抗原的免疫应答。3.5其他减毒株及其疫苗应用随着对越来越多的沙门菌的全基因组的认识，越来越多的基因用于沙门菌的基因工程减毒。3. 5

26、.1cIpXP和Ion缺失突变株St中ATP依赖的ClpXP蛊白酶能调控鞭毛的合成，缺失clpP基因的细菌呈现多鞭毛表型.如&ClpXP缺失突变株CS2007.Lon蛋白醒具有能降解抑制细胞分裂的SulA蛋白的能力，旦负调控具有侵袭性上皮细胞的侵袭力和侵袭基因的表达,缺失Lon基因的菌株呈现长纤毛表梨.如SiLon缺失突变林CS2022.以5X108efu剂*的CS2OO7和CS2022突变株口服接种BALB/c小鼠，免疫后4周抗LPS-IgG和sigA显著升高。攻击实验表明.CS2OO7和CS2022缺失突变株能有效保护小鼠免受有毒株计456的攻击ompR突变株ompR编码外膜蚩白R

27、.ompR操纵子调控编研主要外膜蛋白ompC和。mpF的表达。用p22转座突变StSIJ344主要外膜蛋白ompC、omp【)、ompF和ompR,ompC或ompF突变株毒力与SL1344相同，ompD突变株毒力稍微降低.ompR突变株经口服或静脉免疫小鼠后表明已减毒.LD50降低10气能很好地保护机体免受SL1344的攻击吧3.5.2 poxA突变株poxA编码丙眼酸氧化再，Kaniga首次报道了poxA突变对细菌毒力有影响.poxA突变株表现为多效应表型.SiUK21的poxA突变株口服小鼠毒力比UK21减低10,倍，静脉接种减低IO,倍，但仍能在脾、肠系膜淋巴结和派氏集合淋巴结中定居，

28、能诱导强烈的体液免疫反应.能对致死故的野毒攻击提供保护以°)pabA和pabB突变株:Zekarias等'小以液毒Stx8914为载体表达产气英膜杆薄C末端a毒素，口股免疫后，发现诙疫苗偏能诱导鸡产生抗坏死性肠炎的保护性反应。日前以诚毒St为载体的3种口眼活菌疫苗正处F临床试验阶段：Ty2株的phoP/phoQ缺失突变株Ty800减毒单剂M口服活菌疫苗经J期临床实毁表明，该疫苗能刺激机体产生强的IgA和血清。抗体反应jaroC/aroD/htrA的缺失突变株CVF>908-htrA活减谱口服疫苗已成功通过U期临床实脸，旦该菌株的V衍生萌株CVD909能持续表达Vi抗原，

29、目前已完成I期临床实教)；Ty2株的cya/erp/edt缺失突变株沼073找毒单剂充口服活菌疫苗能同时表达ETEC抗原和抵抗ETEC的感染。I期临床实验表明，该疫苗具有较好的安全性和免疫原性可。4结语歌组找毒St口服疫苗作为一种新型疫苗,具有广阔的应用前景。随着现代生物学和DNA重组技术的发展以及对沙门菌毒力遗传学的深入研究，在该病原体基因组中引入多重、限定、减毒和不能回复的突变已具备了可能性，这种突变是制备活M毒1服疫苗的遗传学基础。虽然减雁St活栽体疫苗有诸多优点，但.仍存在一些不足。制备疫苗使用的筋株尽管基减毒株.可能仍存在微弱的致病性，旦对革兰阴性菌而言还要考虑LPS的虐性效应表达产

30、物与天然蛋白存在差异，表达产物可能对疫苗有害，表达蛋白水平校低；质粒DNA与宿七基因组整合的潜在危险性。此外，为达到更好的黏膜免疫效果，使口服疫苗得到更广泛的应用，有关抗原提呈系统的改进、安全的黏膜佐剂的使用以及对体液免疫和细胞免疫的精确评价等方面仍需进行深入的研究相信随君这些问题的阐明，以减毒St为载体的口眼疫苗的应用将日益广泛.参考文献1JVazquezTA.FangFC.Cellularroutesofinvasionbyen-teropathogensfj.CurrentOpinion,2000.3(1)：54-59.2 RedcignoM,UrbanoM,VaJzasinaB,eta

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