免疫增强剂对禽流感疫苗免疫持续期、安全性和鸡淋巴细胞转化的影响.docx

1、江苏农业学报(J如盼UJ.ofAgr.Sci.),2014,30(4)：82l825http：/唐应华.陆吉虎,吴培培，等.免疫增强剂对禽流感疫苗免疫持续期、安全性和鸡淋巴细胞转化的影响J.江苏农业学报,2014,30(4):821-825.doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2014.04.021免疫增强剂对禽流感疫苗免疫持续期、安全性和鸡淋巴细胞转化的影响唐应华撰七陆吉虎"，吴培培I,查国飞平，刘振兴陈辉'侯继波'(1.江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏南京210014；2.南京农业大

2、学动物医学院，江苏南京210095；3.南京天邦生物科技有限公司，江苏南京211102；4.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036)摘要：在配制H9亚型禽流感疫苗过程中添加免疫增强剂VA5制成VA5-H9疫苗免疫鸡，或将VA5制备成油乳剂以疫苗伴侣形式与商品化H5亚型禽流感疫苗混合(VA5-H5)后免疫鸡，监测鸡的抗体持续期、疫苗安全性和鸡淋巴细胞的转化情况。抗体检测结果表明，VA5与H5或H9亚型禽流感疫苗混用能有效延长抗体持续期4周,H5抗体提前1周达到71g20安全性研究表明，以VA5-H9疫苗经一次单剂量、一次2倍剂量和单剂量间隔2周重复免疫这3种方式免疫鸡后，含VA5的疫苗与

3、常规疫苗的吸收类似，说明VA5不影响鸡体对疫苗的吸收。淋巴细胞转化试验结果显示,VA5能提高免疫鸡淋巴细胞转化效率。可知，获得的VA5免疫增强剂能有效延长抗体持续期，且不影响疫苗的安全性，并提高免疫鸡的淋巴细胞转化活性。关键词：免疫增强剂；禽流感疫苗；抗体；安全性；淋巴细胞转化中图分类号：S858.315.3文献标识码：A文章编号：10004440(2014)042821V5Influenceofimmunopotentiatoronantibodypersistenceperiod,avianinfluenzavaccinesafetyandchickenlymphocytetransfor

4、mationefficiencyTANGYing-hua1-2*3,LUJi-hu1*3,WUPei-pei1,ZHAGuo-fei14,LIUZhen-xing'*2,CHENHui1,HOUJi-bo1(1.NationalResearchCenterofEngineeringandTechnologyforVeterinaryBiologicals,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofEngineeringandTechnologyforVeterinaryBiolcgicids,MinisiryofAgricu

5、lture,Nanjing210014,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China；3.NanjingTianbangBio-industryCo.,Ltd.,Nanjing211102,China；4.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUnii'frsity,Hefei230036,China)收稿日期:2013-11-19基金项目：国家自然科学基金项目(31201904)；科技部国家高

6、技术研究发展计划“863”课(2011AA10A213)；农业部公益性行业(农业)科研专项经费项目(201303046);江苏省农业科技自主创新基金项目CX(12)3077作者简介:唐应华(】981)，男，湖南东安人，博士，副研究员，主要从事动物病毒性疾病致病机理和防控研究。(Tel)O25-84392068；(E-mail)tyinghuayahoo,com通讯作者:侯继波，(Tel(E-mail)houjibo©Abstract:TheimmunopotentiatorVA5wasaddedtotheH9subtypeavianinfluenza(Al

7、)vaccineduringitspreparationprocesses,andtheH5subtypeAlvaccinewasmixedwithchaperonformofVA5preparedasoilemulsion.ChickenswereinoculatedwiththeVA5-containedor-freevaccinesforimmunization,andthehemagglutinininhibition(HI)titersofchickenseraagainstcorrespondingantigenweremeasured.Threedifferentregimeso

8、fvaccinewereadministeredforVA5safetytest,includingsingleinjectionwithsingledose,singleinjectionwithdoubledosesorre-peatedsingle-doseinjectionat2-weekinterval.TheroleofVA5inchickenlymphocytestransformationwasalsoinvestigated.Theantibodypersistence|）eri<xofchickensineither115orH9VA5-containedvaccin

9、egroupwereprolongedby4weeksthanthatinVA5-freevaccinegroup,andtheantibodytileragainstH5antigenwas1weekearliertoreach71g2inchickensimmunizedwithVA5-containedvaccine.ThesimilarahsorpticnbehavoirsofthevaccinesadministeredinthreedifferentregimesbychickensrevealedthattheabsorptionisindependentofVA5.Stimul

10、ationindexindicatedthatVA5improvedtheefTiciencyoflymphocytetransformationinvaccinatedchicken.Insum,theVA5iminunopotentiatoriseffectiveinprolongingtheantibodypersistenceperiodwithoutcompromisethesafetyofvaccineandimprovinglymphocytetransformation.Keywords:immuno（x）tentiator;avianinfluenzavaccine；anti

11、body；safety;lymphocytetransformationH5和H9亚型禽流感灭活油乳剂疫苗在中国禽流感防控中发挥r重大作用，但现有疫苗质量有待进一步提高，如加速抗体产生、延长免疫持续期等。在临床生产中，种禽或蛋禽的生产周期内，需要多次免疫,每增加一次免疫均对动物带来较大应激，影响生产性能，同时也增加人力成本,临床生产中亟需一种佐剂能有效延K疫苗免疫持续期。免疫增强剂与疫苗共同使用，具有较好的协同效应，可以提高疫苗抗原的免疫效力，延缓抗原的释放等。人用流感疫苗免疫增强剂MF59已经在欧洲应用多年"，美国FDA也已批准。葛兰素史克公司的人流感疫苗使用AS03佐剂3;Int

12、ervel的猪圆环病毒疫苗和繁殖与呼吸综合征病毒疫苗均使用DiluvacForte佐剂4'5；Boehringer的猪圆环病毒疫苗使用IngelvacCircoFLEX佐剂们;Pfizer的猪圆环病毒疫苗使用Suvaxyn佐剂；猪支原体疫苗、伪狂犬疫苗和细小病毒疫苗等使用Amphigcn佐剂；Seppic公司的口蹄疫疫苗使用1SA206佐剂，新城疫疫苗使用1SA70佐剂9,01o本研究中，我们将筛选的免疫增强剂以不同形式添加至疫苗中，评价免疫增强剂对疫苗免疫持续期和安全性以及对免疫鸡淋巴细胞转化的影响。1材料和方法1.1病毒、疫苗和检测抗原H5亚型禽流感商品疫苗和H5检测抗原，均购自哈

13、尔滨维科生物技术开发公司。H9亚型禽流感疫苗由本实验室制备，疫苗毒株和检测用抗原均为A/Chicken/Nanjing/02/2001（H9、2,简称NJ02）。1.2鸡1日龄商品海兰褐鸡购自海安通榆种鸡场，在普通环境饲养至使用，检测针对H5或H9亚型禽流感母源抗体，仅抗体低于21g2时用于免疫。无特定病原体（Specificpathogenfree,SPF）鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，养在负压隔离器内，直至使用。1.3含免疫增强剂疫苗的配制含VA5免疫增强剂疫苗的配制详见专利（申请号201210235427.0）。增强剂的使用形式有2种，一种以疫苗伴侣形式使用:将免疫增强剂配制

14、成油乳剂疫苗伴侣，使用时将该疫苗伴侣与H5常规疫苗按体积比为1：9混合，即为含VA5免疫增强剂的伴侣疫苗（VA5-H5）；另一种是免疫增强剂与H9疫苗抗原共同混匀形式使用:将免疫增强剂直接添加至抗原溶液中混匀后，制备水相，再与事先制备的油相混匀，制备含免疫增强剂的H9疫苗（VA5-H9）。1.4免疫持续期选择10日龄海兰褐蛋鸡，共设4个免疫组，包括VA5-H5伴侣疫苗免疫组和H5常规疫苗免疫组（H5）；VA5-H9共混疫苗免疫组和H9常规疫苗免疫组。海兰褐蛋鸡均经颈背部皮卜免疫，每只鸡注射0.3ml。另设空白对照组。免疫和空白组每组各20只鸡。在免疫后第2周、第3周、第4周以及后续每隔2周采血

15、，其中VA5-H5和H5疫苗免疫组检测至免疫后26周，而VA5-H9和H9疫苗免疫组检测至免疫后30周。分离血清检测血凝抑制抗体效价（/）。根据H5疫苗制造规程，设定用高于或等于71以为合格抗体效价，低于71g2为不合格抗体效价。对于H9疫苗,设定/高于或等于61g2为合格抗体效价，低于6】g2为不合格抗体效价1.5含免疫增强剂疫苗的安全性检测1.5.1单剂量接种安全性2批次含免疫增强剂的疫苗（VA5-H9）和常规疫苗（H9）单剂量各免10只鸡，共3组，每只鸡经颈部皮F注射疫苗0.3ml。另设不免疫的空白对照组10只鸡。1.5.2双倍剂量接种安全性2批次含免疫增强剂的疫苗（VA5-H9）和常规

16、疫苗（H9）双倍剂量各免10只鸿，共3组，每只鸡经颈部皮下分两点注射疫苗0.6ml。另设不免疫空白对照组10只鸡。1.5.3单剂量重复接种安全性2批次含免疫增强剂的疫苗（VA5-H9）和常规疫苗（H9）单剂量各免10只鸡，共3组，每只鸡经颈部皮下注射疫苗0.3ml。第1次接种后2周,按第一次接种方法再次接种，每只鸡颈部皮下注射0.3ml。另设不免疫空白对照组10只鸡。上述接种鸡在最后一次注射疫苗后，均观察14d,详细记录采食饮水等情况。观察期结束后,扑杀5只，观察注射部位的疫苗吸收情况。再过14d后将剩下的5只扑杀，观察疫苗吸收情况。1.6鸡淋巴细胞转化VA5-H9疫苗和H9疫苗分别免疫14日

17、龄无特定病原体SPF鸡，另设空白对照，每组10只SPF鸡。在免疫后第1d、3d、5d、7d、10d放血处死各组2只鸡，无菌分离免疫鸡的脾脏淋巴细胞，于96孔板每孔加100jil1mlIxlO6的淋巴细胞，每个样品设置3个重复，于37丁孵育4h后，加入25jig/ml的PHA刺激培养68h后，每孔加入15jii浓度为5mg/ml的MTT,孵育68h后加入50口1DMS0,于分光光度计上读数，检测。久70值。按每3个重复样品的平均值计算刺激指数，即疫苗免疫组。仇如均值/空白对照组。久70均值。刺激指数与免疫效力呈正相关性，即刺激指数值越高表示免疫效力越好。2结果与分析2.1添加VA5免疫增强剂的H

18、9疫苗的免疫持续期将免疫增强剂VA5与H9抗原共同混匀后，制备疫苗免疫鸡，持续监测抗体效价。含免疫增强剂疫苗免疫后至第6周一直处于抗体上升期，直至第30周抗体效价下降至61g2以下，常规H9疫苗免疫组抗体类似于含免疫增强剂组,抗体上升至第6周达到高峰.抗体效价在第22周低于61g2o对照组母源抗体-直低于21g2o含免疫增强剂H9免疫组抗体水平一直高于常规H9疫苗免疫组，且在18周之前一直高于1.81g2以上（图1）。以疫苗规程要求的61g2作为合格抗体界限，添加免疫增强剂的H9疫苗比常规H9疫苗能延长抗体持续期4周。2.2添加VA5免疫增强剂的H5疫苗的免疫持续期将免疫增强剂VA5制备成油乳

19、剂疫苗伴侣，再与H5商品疫苗共同混匀后免疫鸡，持续监测抗体效价。含免疫增强剂疫苗免疫后，第2周抗体达到71以,在第3周达到高峰,一直维持至第12周，之后逐渐下降，在第24周抗体效价低于71g2；常规疫苗在免疫后第2周抗体仅为4.251g2，在第3周至第10周维持较高抗体水平，之后逐渐下降，在第20周抗体效价低于71g2；空白对照组一直未检测出抗体（图2）。与常规H5疫苗相比，含免疫增强剂VA5-H5疫苗免疫后，合格抗体产生提前1周，即缩短窗口保护期1周;在免疫后14周前,VA5-H5组抗体效价高于常规H5疫苗21g2以上;常规疫苗在免疫后第20周降至71g2以下，而VA5-H5疫苗免疫组至第2

20、4周降至71g2以下，即VA5-H5延长抗体持续期4周。添加VA5免疫增强剂的H9疫苗;常规H9疫苗；一空白对照图1H9疫苗免疫后抗体持续期Fig.1DurationofimmunityprovidedbyH9vaccine添加VA5免疫增强剂的H5疫苗;常规H5疫苗；空白对照图2H5疫苗免疫后抗体持续期Fig.2DurationofimmunityprovidedbyH5vaccine2.3添加免疫增强剂的疫苗安全性2批次含免疫增强剂疫苗经单剂量接种鸡，或两倍超剂量接种鸡，或经间隔2周单剂量重复接种鸡,在最后一次接种后扑杀，肉眼观察疫苗吸收情况。2.3.1单剂量免疫试验在免疫后第14d,各组

21、扑杀5只鸡,检查疫苗吸收情况。其中VA5-H9疫苗第一批次、第二批次组和常规H9疫苗组均有2只鸡在颈部皮下免疫处有淡黄色类脂肪粒，常规疫苗组另有1只有乳白色颗粒和弥散性淡黄色类脂肪粒。各组其余剖检鸡均正常。在第28d剖检时，VA5-H9疫苗第一批次免疫组有1只鸡、第二批次免疫组有3只鸡,常规疫苗组有2只鸡有淡黄色类脂肪粒，各组其余剖检鸡均正常。非免疫的空白对照组在第14d和第28d均正常。3组鸡在免疫后的观察期内均健康，饮食正常。2.3.2超剂量免疫试验在免疫后第】4d,VA5-H9疫苗第一批次组和常规疫苗组5只鸡均在颈部皮F免疫处有淡黄色类脂肪粒；VA5-H9疫苗第二批次组2只鸡在颈部皮下免

22、疫处有淡黄色类脂肪粒，另3只鸡均正常°在第28d剖检时,VA5-H9疫苗第一批次和第二批免疫组均有2只鸡以及常规疫苗组5只鸡均有淡黄色类脂肪粒，其余剖检鸡均正常。非免疫的空白对照组在第14d和第28d均正常。3组鸡在免疫后的观察期内均健康，饮食正常。2.3.3单剂量重复免疫试验在二免后第14d,VA5-H9疫苗第一批次免疫组3只鸡有乳白色颗粒,2只鸡有乳白色颗粒和黄色类脂肪混合颗粒。VA5-H9疫苗第二批次免疫组中1只鸡有乳白色颗粒,4只鸡有淡黄色类脂肪颗粒。常规疫苗组的2只鸡有乳白色颗粒,3只鸡有乳白色和淡黄色类脂肪混合颗粒。在二免后第28d,VA5-H9疫苗第一批次免疫组和常规疫

23、苗组，均有2只鸡在免疫部位有淡黄色类脂肪样颗粒，另3只正常。而VA5-H9疫苗第二批次免疫蛆，1只鸡有白色颗粒状未吸收完全的疫苗，另1只有淡黄色脂肪样颗粒，剩余3只鸡均正常。不免疫的空白对照组均正常。3组鸡在免疫后的观察期内均健康，饮食正常。根据各组在免疫后不同时期的疫苗吸收情况比较可以得知,含免疫增强剂的2批次疫苗，与常规疫苗的吸收情况较类似，无明显延后。该结果提示，将免疫增强剂添加至疫苗中，并不影响机体对疫苗的吸收。2.4VA5免疫增强剂对免疫鸡淋巴细胞转化效率的影响各疫苗免疫组鸡的淋巴细胞在免疫后，剌激指数逐渐升高，即淋转活性逐渐上升，且含VA5免疫增强剂剂的灭活疫苗组的淋巴细胞转化活性

24、高于常规疫苗组，特别在第5d以后更加明显（图3）。根据刺激指数与免疫效力的正相关性可以得知，免疫增强剂提高免疫鸡的淋巴细胞转化活性，即含免疫增强剂疫苗能提高机体对疫苗的免疫应答。这与抗体检测结果中含免疫增强剂的疫苗抗体效价高一致。添加VA5免疫增强剂的H9疫苗：常规H9疫苗图3添加VA5免疫增强剂的疫苗免疫鸡后的淋巴细胞转化Fig.3ThelymphocytetransformationofchickeninoculatedwithVAScontainedvaccine综上所述，本研究获得的免疫增强剂，无论以添加至抗原中混合使用的形式或以疫苗伴侣的形式使用，均能有效提高鸡对禽流感疫苗的抗体效价

25、和免疫持续期。安全性研究表明，该免疫增强剂不影响鸡体对疫苗的吸收。参考文献：1KHURANAS,CHEARWAEW,CASTELLINOF,rtal.VaccineswithMF59adjuvantexpandtheantibodyrepertoiretotargetprotectivesitesofpandemicavianH5N1influenzavirusJ：.SciTranslMed,2010,2(15)：15.2 REYNALESH,ASTUD】LLOP,DEVAIUERES,clal.AprospectiveobservationalsafetystudyonMF59®a

26、djuvantedcellculture-derivedvaccine,Celtura®duringtheA/HlN1(2009)influenzapandemicJ.Vaccine,2012,30(45):6436-6443.3 PULESTONR,BUGGG,HOSCHLERK,elal.Muhi-centreobservationalstudyoftransplacentaltransmissionofinfluenzaantibodiesfollowingvaccinationwithAS03(A)-adjuvantedHlN12009vaccineJ.PLoSOne,201

27、3,8(1)：<47448.4 BROERSP,VISSERN,EGGERW.FieldstudyforreduclionofspreadofAujcszky'sdiseasevirusinfini4)ingpigswithdifferentvaccinationregimesJ.ActaVetHung,1994,42(2-3):397-403.5 MARTELLlP,FERRARIL,MORGANTIM,elal.Onedoseofaporcinecircovirus2subunitvaccineinduceshumoralandcell-mediatedimmunityandprotectsagainstporcinecircovirus-as«oci-ateddiseaseunderfieldconditionsJ.