免疫增强剂对新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗抗体水平影响.docx

1、免疫增强剂对新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗抗体水平影响袁野七李守湖I,李浩鹏2,邢小勇I,温峰琴1,包世俊I,胡永浩”(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070；2.中牧股份(乾元浩生物股份有限公司)，河南郑州450000)摘要：本研究旨在通过将不同种免疫增强剂与正常杭原含量及减量抗原含量的新城疫(LaSota株)，禽流感(H5N1亚型Rc-6株、Re-7株)5倍浓缩抗原按一定比例混合，制备成新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗，分别免疫SPF鸡。同时用不加免疫增强剂的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗免疫SPF鸡作为对照组。结果表明，通过监测鸡免疫后不同夭数的血清抗体水平，经方差分析得知相比于

2、对照组的抗体水平，其中添加有盘素多肽、黄斐多糖、灰树花多襦的疫苗免疫鸡后产生的抗体水平均呈显著提高，而香苑多楝与猪苓多柿则与时照组无显著性差异。结果提示，在抗原含量正常或戒量的情况下，去素多肽、黄黄多概、灰树花多糖能起到抗体增强的效果，使其达到既能增强抗体又能降低成本的实用效果。关键词：免疫增强剂；新城疫-禽流感；二联三价灭活疫苗；抗体滴度中图分类号：S858.31文献标识码：B文章编号：1672-9692(2015)12-0001-06Studyonimmunostimulantsonnewcastlediseaseandavianinfluenzaaffectedtrivalentinac

3、tivatedvaccineantibodylevelsYuanYe1-2,LiShouhu1,LiHaopeng2,XingXiaoyong1,WenFengqin1,BaoShijun1,HuYonghao1*(1.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,GansuLanzhou730070;2.ChinaAnimalHusbandryIndustryCO.,LTD/QYHBiotechCompanyLimited),HenanZhengzhou450000)Abstract:Thestudywasdesignedby

4、thedifferenttypesofimmuneenhancerandnorma)antigencontentandthereductionoftheantigencontentofNewcastle(LaSotastrain),avianinfluenzaA(H5N1Re-6strainandRe-7strain)fivetimesconcentratedantigenmixedincertainproportionspreparedNewcastleandavianinfluenzatrivalentinactivatedvaccine,SPFchickenswereimmunized.

5、Atthesametime,asacontrolgroupwithNewcastlediseasewithoutimmuneenhancerandavianinfluenzatrivalentinactivatedvaccineSPFchickens.Theresultsshowedthatthescrumantibodylevelsbydifferentdaysafterimmunizatingmonitoringchicken.Analysisofvariancethatcomparingtotheantibodylevelsbetweenthecontrolgroup,theantibo

6、dylevelsofproducedwithvaccineaddBursinpolypeptides,APSandgrifolanshowedasignificantincrease.However,thegroupwithLent!nanandPUPSwasnosignificantdifferencebetweenthecontrolgroup.TheresultssuggeststhatimmunopotentiatorwithBursinpolypeptides,APSandgrifolancanplayanenhancedeffectoftheantibodyinthecaseofr

7、eductionornormalontheantigencontent,itisalsoenhanceantibodybuttoreducethecostofeconomiceffect.Keywords：Immunostimulants;Newcastleandavianinfluenza;Duplextrivalentinactivatedvaccine;Titerofantibody收日期：2015-11-23作者简介：袁野(1983-),男，河南郑州人，博士研究生，主要从事生物制品、药品的研发与生产.通讯作者:胡永浩(1962-),男，教授，博士生导师，主要从事动物传染病学及病原分子生

8、物学的研究.新城疫（Newcastledisease,D）和禽流感（Avianinfluenza）是危害禽类的重大疾病，其病原分别是新城疫病毒和禽流感病毒，都属于高度接触性传染病，给世界养禽业造成了巨大的经济损失“七目前，新城疫和禽流感的预防主要是接种疫敝顽,鸡新城疫疫苗主要有弱毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程苗（山，而弱毒疫苗为目前市场上最常见的疫苗。禽流感现阶段常见的疫苗为全病推灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、重组活载体疫苗2。虽然使用常规疫苗免疫接种可以防制新城疫、禽流感，但在实际情况下常规单苗存在免疫繁琐、免疫效果不尽理想、成本高等缺点，针对市场的需求，进而研制出既廿约成本乂增强

9、免疫效果的免疫增强剂。免疫增强剂即广义上的佐剂，都是通过调动免疫系统的功能，提高机体的病原微生物的特异性反应米发挥其作用，是治疗和预防疾病的重要物质，特别是对疫苗发挥保护性作用起独特的效果，能有效影响免疫反应的质量（型的控制、财部免疫以及细胞类型的控制），稳定、便宜而旦容易生产和保/fl,0,lo本研究所用到的多种免疫增强剂，涉及小分子多耻类、多糖类等免疫增强剂能显著提高机体免疫系统功能，增戏疫苗的免疫效果，减少疾病发生七探讨各种免疫增强剂对鸡体感染新城疫，禽流感的免疫调节作用，为应对新城疫、禽流感能够认到更加理想的免疫预防奠定了理论依据。1材料与方法1.1抗原及试验动物抗原由乾元浩生物股份有

10、限公司郑州生物药厂提供,包括新城疫（LaSota株）5倍浓缩抗原HA为11log2,禽流感R7株5倍浓缩抗原HA为10log2,禽流感Re6株5倍浓缩抗原HA为10log。125只SPF鸡（28日龄）均由乾元浩生物股份曲限公司郑州生.物药厂动物房SPF种蛋孵化。1.2主要试剂及仪器囊素三肽购自上海洵普生物科技有限公刊。黄茂多糖、香菇多糖、猪苓多糖、灰树花多糖均购自浙江方格药业有限公司。注射用II油山法国MARC0L52注射白油提供。硬脂酸铝购白上海远航试剂广。司本-80和吐温-80均购自广东省拳庆山超能实业有限公司。无菌检验培养基由乾元浩牛物股份有限公.（郑州生物药厂提供。台式微型剪切机TT8

11、型购自德国1KA公。LS900激光颗粒粒度分析仪购自青岛欧美克公司。八道移液器购自德国艾本德公司。1.3水相的制备将1组事先配制好的囊素三肽溶液加入事先配置好的水相中：使浓度达到每1000mL疫苗中含囊素三肽10mg,囊素三肽含量达到1%。将2组黄茂多糖、3组灰树花多糖、4纽香菇多糖、5组猪苓多糖原粉按一定比例溶于注射用水中制成相对应的黄茂多糖、灰树花多糖、香菇多糖、猪苓多糖溶液加入事先配置好的水相中，使其浓度达到疫苗总量的3%。1.4油相的制备将注射用白油、司苯-80、硬脂酸铝按一定比例经高压灭菌混匀制成油相。1.5乳化将配制好的油相先与含有囊素三肽的水相用德国IKAT18型高速剪切机先进行

12、预乳化，待将水相加入完全后，按一定转速、时间乳化结束，分装于100mL瓶中备用动物试验。分别将预先配置好的含有黄度多糖的水相、灰树花多糖水相、猪苓多糖水相、香姑多糖水相溶液经高压火菌后按一缶比例加入5倍浓缩火活抗原充分混匀后，缓缓加入油相，用德国IKAT18型高速剪切机预乳，待将水相加入后，按-定转速，时间乳化结束，分装于100mL瓶中备用动物试验。1.6剂型取1清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状不扩散。1.7稳定性取lOmL疫苗于离心管中，经3500r/min15min,应不出现分层现象；疫苗在37C左右条件，放置21d不应有破乳现象。1.8黏度用下口内径为1.2mm、上口内径为2

13、.7mni的1mL移液吸管在25C左右的条件下吸取疫苗1mL,令其垂直流出，记荥流出0.4mL所需的时间。1.9颗粒度取5uL疫苗混匀于10mL白油中，置于LS900激光粒度分析仪中检测。1.10无菌检验疫苗抽样，分别取硫乙醇酸盐培养基2支，琼脂培养基2支，匍萄糖培养基1支，每支接种疫苗0.2mL分别放置于37C、25C培养箱中做无菌检验。1.11效力检验28日龄SPF鸡125只分为12组，每组10只；第15组免疫添加含免疫增强剂及含有正常抗原含量的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗0.3mL；第6组免疫添加不含免疫增强剂及含有正常抗原含量的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗0.3mL；第711组免疫

14、添加含免疫增强剂及含有1/5正常抗原含量的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗0.3mL；第12组免疫添加不含免疫增强剂及含有1/5正常抗原含量的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗0.3mL；另取5只作为空白对照。分别在免疫后的第14、21、28天采血收集血清，检测抗体，经spss对各个数据的方差分析统计。2结果2.1检验结果2.1.1疫苗物理性状及无菌检检2.1.2抗体检测结果见表1。1疫苗物理性状及无菌检验结果TablelsterilitytestresultsandphysicalpropertiesofVaccine样品剂型颜色粘稠度离心37C放28C放25C放颗粒度无曲(25C)结果置结果置结

15、果置结果(D50,Mm)结果囊素多肽W/0乳白色1.78不分层不破乳不破乳不破乳1.53无偏黄芷多糖W/0黄福色1.88少量沉淀不破乳不破乳不破乳1.54无偶灰树花多糖W/0灰黑色1.98少财沉淀不破乳不破乳不破乳1.78无萌香莅多糖W/0红掠色1.51少量沉淀不破乳不破乳不破乳1.01无函猪苓多糖W/0红棕色1.87少量沉淀不破乳不破乳不破乳1.64无两对照组W/0乳白色1.84不分层不破乳不破乳不破乳1.69无的囊素多肽W/0乳白色1.99不分层不破乳不破乳不破乳1.94无菌黄筷多鞘W/0黄渴色1.45少蛰沉淀不破乳不破乳不破乳1.21无慵灰树花多精W/0灰黑色1.79少最沉淀不破乳不破乳

16、不破乳2.01无慎香姑多精W/0红棕色1.81少堂沉淀不破乳不破乳不破乳【.99无曲猪冬多糖W/0红棕色1.85少量沉淀不破乳不破乳不破乳2.23无筋对照组W/0乳白色1.42不分层不破乳不破乳不破乳0.98无曲2.2数据分析2.2.1抗原正常含量的情况下（Re-6株）在14d、21d时相比于对照组的抗体水平，黄芷多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，囊素多肽组显著提高，而香姥多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在28d时相比于对照组的抗体水平，囊素多肽组、灰树花多糖组均极显著提高，黄茂多糖组显著提高，香菇多糖组、猪苓多糖组均与对照组无显著性差异。2.2.2抗原含量为正常含量1/5的精况下（

17、Re-6株）在14d时相比于对照组的抗体水平，囊素多肽组，黄茂多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组姻与对照组无显著性差异。在21d、28d时相比于对照组的抗体水平，黄芷多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，囊素多肽组显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显Table2Analysisc表2免疫后各组的Re-6HI抗体水平方差分析表varianceonRe-6HIantibodycaseofeachgroupafterimmunizating14d21d28d组别Re-6l/5Re-6Re-6l/5Re-6Re-6l/5Re-6K素多肽5.8+1.75*4.82.44”

18、7.91.IO*6.41.78*9.21.148.50.97-黄茂多精6.40.97-5.02.548.20.79-6.5+1.35-8.31.348.l0.99灰树花多糖6.40.84“5.32.26-8.20.79”7.21.40”9.00.82-8.21.87-香菇多糖4.6+1.072.62.127.Oil.255.4土1.968.00.94-7.91.97猪冬多精4.61.072.22.397.11.455.31.957.61.077.92.88对照组4.81.811.21.997.01.495.4+1.967.71.497.7+1.25注：显著性水平a=0.05,*表示差异显著(P

19、V0.05),*表示差异极显著(PV0.01).表3免疫后各组的Re-7HI抗体水平方菱分析表Table3AnalysisofvarianceonRe-7HIantibodycaseofeachgroupafterimmunizating组别14d21d28dRe-7l/5Re-7Re-7l/5Re-7Re-7l/5Re-7真素多肽5.71.954.7+1.57-8.0l.05-6.51.27-8.80.82”8.61.17-黄花多糖6.30.95-4.72.16-8.40.70“6.40.70”9.30.92-8.70.79-灰树花多糖6.21.03w5.41.54”8.00.94,7.00

20、.67”9.00.67-8.00.82.香姑多械4.30.822.61.846.91.205.2土1.408.00.497.4+1.07猪琴多糖4.61.072.51.817.i0.745.11.217.70.737.41.96对照组4.8+0.922.51.647.00.675.3+1.067.90.887.51.65注：显著性水平。=0.05,*表示差异显著(PV0.05),*表示差异极显著(PV0.0D.著性差异。2.23在抗原正常含量的情况下(Re-7株)在14d时相比于对照组的抗体水平，黄茂多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，囊素多肽组显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著

21、性差异。在21d时相比于对照组的抗体水平，黄茂多糖极显著提高，囊素多肽组与灰树花多糖组均显著提高,而香菇多糖与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在28d时相比于对照组的抗体水平，囊素多肽组、黄佐多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，而衰4免疫后各组的LaSotaHI抗体情况水平方差分析Table4AnalysisofvarianceonLaSotaHIantibodycaseofeachgroupafterimmunizating组别14d21d28dLaSota1/5LaSotaLaSota1/5LaSotaLaSota1/5LaSota囊素多肢5.90.574.31.64“8.l0.99-6.

22、30.82“9.50.97-7.50.85黄芷多精6.20.79-4.21.75-8.l0.996.20.79-9.l0.887.70.67灰树花多精6.30.67-4.7+1.70-8.30.95-6.70.67-9.20.63-7.51.35香菇多糖4.2+0.632.62.017.11.104.81.757.90.746.91.29猪苓多糖4.41.172.12.027.31.065.01.417.90.747.32.26对照组4.7+1.421.4L587.3i.165.01.058.21.407.41.20注：显著性水平a=0.05,*表示差异显著（PV0.05）,*表示差异极虫著（

23、P0.01）.香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。2.2.4在抗原含量为正常含量1/5的情况下（Re-7株）在14d、21d时相比于对照组的抗体水平，黄茂多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，囊素多肽组显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在28d时相比于对照组的抗体水平，囊素多肽组与黄芷多糖组均显著提高，灰树花多糖组显著提高，香菇多糖组与猪苓多糖均无显著提机2.2.5在抗原正常含量的情况下（LaSota株）在14d时相比于对照组的抗体水平，囊素多肽组、黄黄多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，而香菇多糖与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在21d时相比于对照组的抗体水平

24、，灰树花多糖组极显著提高，囊素多肽组与黄茂多糖组显著提高，香菇多糖组与猪苓多糖组均无显著提高；在28d时囊素多肽组、黄黄多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。2.2.6在抗原含量为正常含量1/5的情况下（LaSota株）在14d、21d时相比于对照组的抗体水平，囊素多肽组、黄茂多糖组与灰树花多糖组均极显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在28d时囊素多肽组、黄茂多糖组、灰树花多糖组、香菇多糖组与猪苓多糖组均无显著提高。3讨论疫苗物理性状方面，囊素三肽组疫苗的颜色无改变，呈乳白色，无分层现象，黏度、颗粒度也和普通疫苗无明显差异，但

25、黄茂多糖、灰树花多糖、香菇多糖、猪苓多糖组疫苗颜色均有不同程度的改变，黏度、颗粒度也有不同程度的增加，并且在高速离心后稳定性不理想，并且伴有沉淀析出。相比于对照组的抗体水平，在抗原含量正常情况下，其中，添加有囊素多肽、黄黄多糖、灰树花多糖的疫苗免疫鸡后产生的抗体水平均呈显著提高，而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。且在抗原含量减最的情况下其中添加有囊素多肽、黄茂多糖、灰树花多糖的疫苗免疫鸡后产生的抗体水平相比于添加香菇多糖、猪苓多糖及未添加免疫增强剂的抗体水平呈显著提高，使其达到既能增强抗体又能降低成本的实用效果。综合以上疫苗物理性状与抗体水平的分析结果来看，囊素三肽比较适合做新城

26、疫-禽流感二联三价灭活疫苗的免疫增强剂。参考文献ALEXANDERDJ,ALDOUSEW,FULLERCM.Thelongview:aselectivereviewof40yearsofNewcastlediseaseresearchJ.AvianPathol,2012,41(4):329-335.1 ALEXANDERDJ.NewcastlediseaseintheEuropeanUnion2000to2009J.AvianPathol,2011,40(6):547-558.2 GuoYJ,WangM,KawaokaY,etal.Characterizationofanewavianlike

27、influenzaAvirusfromhorsesinChinaJ.Virology,1992,188(1):245-255.4王贺民，秦素琴，魏涛，等.鸡新城疫疫苗研究进展J.中国家禽,2006,28(18):48-51.5雷彩霞，夏业才，李俊平.中国禽流感诊断技术和疫苗的研究进展J.中国怦药杂志,2006,40(1):3239.6J武发菊，刘学荣，尚勇良，等.新城疫疫苗的研究进展JJ.中国畜牧兽医,2011,38(10):145-148.7 SpradbrowPB.NewcastlediseaseinvillagechickenscontrolwiththermostableoralvaccineJ.VirusRes,1994(32):373-379.8 HaroIdoToro,De-chuC,Tang,et