菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定

1、菠萝蛋白酶的提取、初步分别纯化及活性测定14食安（1）班 杨泽杰摘要：本文结合考马斯亮蓝G250染色法，争辩了不同纯化方法，包括硫酸铵沉淀法、透析法，对菠萝蛋白酶活性的影响。试验结果表明，两种纯化方法都能有效纯化菠萝蛋白酶，但是会对菠萝蛋白酶的活性造成肯定的损失。关键词：菠萝蛋白酶 沉淀法 透析法 纯化 酶活性前 言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC 3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，它广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎。菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的简单复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧

2、化而使其酶活下降。菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000，等电点 9.55，最适pH在7.1左右，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活。菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是5565。金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而爱护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，它能挂念快速结痂，对正常组织无害，不影响

3、植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。1 试验材料与仪器1.1 试验材料与试剂1.1.1 试验材料 新颖菠萝（3个），透析袋1.1.2 试验试剂（1）盐析粗提液0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4 000mL），0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4 000mL）（2）酶活力测定试剂1酪蛋白（进口分装）（配100mL），激活剂含20mmo1L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠) ，10三氯乙酸(TCA) 1.2 试验仪器和用品1.2.1 试验仪器HJ-6多头磁力搅拌器：常州国华电器有限公司MC-H18S012多功

4、能红外炉：广东美的生活电器制造有限公司DS-1高速组织捣碎机：上海标本模型厂GKC110R2可控硅恒温水浴锅：赏花锦屏仪器仪表有限公司TD5M低速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司TDL-60B台式离心机：上海安亭科学仪器厂722型可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司UV5100B型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司PL1502-S电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司BCD-539WT冰箱：青岛海尔股份有限公司1.2.2 试验用品（1）以组为单位的用品 大试管18mm×200 mm（10支）、试管架（2个）、烧杯（50

5、mL×1，100mL×2， 200mL×1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5mL×1，1mL×2，0.1mL×1，0.2 mL×1）、漏斗（3个）、量筒 （100mL×1）、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。（2）全班共用的用品试剂瓶（1000mL×7，250mL×3，60mL×20）、烧杯（1000mL×4）、塑料烧杯（2000mL×2）、量筒 （500mL×2，1000mL×2）、广泛pH试纸、剪刀、电炉和

6、锅、蒸馏水容器、透析袋（截留相对分子质量8 00014 000）。2 试验方法2.1 菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持续搅拌1015min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C 3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性1。2.2 盐析依据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，渐渐小量分

7、次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4°C 4000rpm离心10min，收集沉淀， 加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性2。2.3 透析 将溶解液装入2.5 cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于 500mL 烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水34次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加23滴透析外液至试管中，若消灭白色沉

8、淀，表示SO42- 未除净，若无沉淀消灭，表示透析完全）。若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性3。2.4 酶活性测定方法取2支试管，设置一支为试验对比，三支为平行样品。取0.1mL酶液，加入0.9mL激活剂，加入37预热的1%酪蛋白溶液1mL，精确反应10min，加入10%三氯乙酸3mL反应终止酶反应。对比管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。离心（3000r/min，5min）或过滤，清液于280nm波长下测定光吸取值。酶活单位定义：在上述条件下 ，每10min增加0.001个光吸取值为1个酶单位（U）。试验步骤依据表格中完成。试剂

9、(ml)对比组平行样品1平行样品2平行样品3TCA3酶液0.10.10.10.1激活剂0.90.90.90.9酪蛋白111137°C精确反应10minTCA333A280nm OD值2.5 蛋白质含量测定方法2.5.1 标准曲线的绘制01000g/mL标准曲线的绘制：另取6支试管编号，按下表加入试剂。管号1234 5 6 1000g/mL牛血清白蛋白（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（g/mL）01.000. 20. 82000. 40. 64000. 6 0. 8 1.00. 4 0. 2 0 600 800 1000得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、6

10、00、800、1000g/mL，精确吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min，测定595nm吸光值，绘制0-1000g/mL标准曲线。2.5.2 样品的测定精确吸取样品溶液0.1mL放入具塞刻度试管中，与步骤 2.5.1 操作相同，测得样品的光吸取值A595nm。3 试验结果与分析3.1 蛋白质含量计算由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（mg/mL），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。样品蛋白含量(g/g鲜重)=查出的蛋白提取液浓度（g/mL）×定容体积(mL)样品重量(g)3.2 酶活力计算最终酶活结果取3次重复试验的平均值。酶液活力（U/mL）=A280n

11、m0.001×0.1×稀释倍数3.3 酶比活的计算酶比活（U/mg·蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量3.4 酶纯化过程中回收率计算回收率（%）=（纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100= （纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）×1003.5 酶纯化倍数的计算纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力3.6 试验结果3.6.1 蛋白质含量3.6.1.1 绘制标准曲线依据标准曲线测量数据管号1234 5 6 1000g/mL牛血清白蛋白（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（g/mL）吸光度/A01.0000. 20. 82000.2

12、030. 40. 64000.3160. 6 0. 8 1.00. 4 0. 2 0 600 800 1000 0.491 0.631 0.633绘制标准曲线如下：3.6.1.2 蛋白质含量组别粗酶盐析透析吸光度/A0.3610.2860.228蛋白质浓度mg/mL0.4400.3520.272总体积/mL36.0017.0017.00蛋白质含量/mg 15.8405.9844.624样品蛋白含量=15.840mg20.00g=0.792mg/g(鲜重)3.6.2 酶活力组别对比组平行样品1平行样品2平行样品3均值A280mm OD值粗酶00.4570.5870.6190.554A280mm

13、OD值盐析00.8460.4880.5030.612A280mm OD值透析00.4610.4590.4730.464透析酶液活力(U/mL)=A280mm0.001×0.1×稀释倍数=4640U/mL粗酶酶液活力(U/mL)=A280mm0.001×0.1×稀释倍数=5540U/mL盐析酶液活力(U/mL)=A280mm0.001×0.1×稀释倍数=6120U/mL3.6.3 酶活比透析酶活比（U/mg·蛋白）=酶活力酶蛋白质含量=46400.2295=20217.86(U/mg·蛋白)粗酶酶活比（U/mg

14、83;蛋白）=酶活力酶蛋白质含量=55400.792=6994.95(U/mg·蛋白)盐析酶活比（U/mg·蛋白）=酶活力酶蛋白质含量=61200.2975=20571.43(U/mg·蛋白)3.6.4 酶纯化回收率盐析回收率（%）=（盐析纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100= （盐析纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）×100=（6120×17）/（5540×36）×100= 52.17%透析回收率（%）=（透析纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100= （透析纯化酶活力&

15、#215;纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）×100=（4640×17）/（5540×36）×100= 39.55%3.6.5 酶纯化倍数盐析纯化倍数=盐析纯化酶比活力/粗酶比活力=20571.43÷6994.95=2.94透析纯化倍数=透析纯化酶比活力/粗酶比活力=20217.86÷6994.95=2.89菠萝蛋白酶分别纯化表步骤总体积（mL）总蛋白质含量（mg）总活力（U）比活力（U/mg· 蛋白）回收率（%）纯化倍数粗提取36.0015.8401994406994.95-盐析17.005.98478880

16、20571.4352.172.94透析17.004.62410404020217.8639.552.893.7 试验结果与争辩理论上，在蛋白质浓度中，粗酶的蛋白质浓度应当要比透析、盐析的蛋白质浓度低，但是结果是粗酶蛋白质的浓度最高，缘由可能是后面盐析以及透析时操作不当导致菠萝蛋白酶损失严峻，导致整体浓度降低和蛋白质含量削减。盐析时，盐析出来的沉淀不能完全溶解也可能导致溶液中蛋白质含量降低。盐析以及透析后的酶活力比粗酶的高。Fe3+、Fe2+、Cu2+存在对浸提液中菠萝蛋白酶活性的影响较大,可能是与它们具有氧化还原性性有关4，在未盐析透析之前，菠萝蛋白酶受金属离子影响，导致粗酶的酶活力和酶比活较

17、盐析和透析低。盐析回收率不高，可能是由于加入的固体硫酸铵并没有完全溶解，或者提取液中，部分区域的硫酸铵浓度过高导致菠萝蛋白酶失活，从而导致回收率低5。盐析纯化倍数比透析纯化倍数高，这是由于盐析后酶的浓度比透析的要高，所以盐析的酶比活比透析的高，盐析的单位酶活力比透析的高。因此，盐析的纯化倍数会更高。思考题：1. 如何防止酶在分别纯化过程中发生变性失活。答：酶变性失活主要由于金属离子、高温、有机溶剂等不行逆因素的影响所以在纯化的时候要做到：1.不使用自来水做透析液；2.不靠近红外电炉；3.不使用不洁净的仪器。2. 常见的酶活性表示方法有那些（如：U/mL酶液；U/mg蛋白质; U/g干重或鲜重；

18、U/g 酶粉 等）？它们各有什么含义，适用哪些场合？答：U/mL酶液：表示每单位体积样液中酶活力的状况，适用于表示液体酶中的酶活大小。U/mg蛋白质：表示每单位质量样品中酶活力的状况，适用于含一种或多种蛋白质的样品中的酶活大小。U/g鲜重或干重：表示每g原始样品中的酶活力的状况，适用于原始样品的酶活力表示。U/g酶粉：表示每g酶粉中的酶活力状况，适用于酶制剂的酶活力测定或者酶制剂的相应浓度配制。3. 蛋白质的沉淀作用还有哪些方法？哪些变性了？哪些没有变性？ 答：变性：重金属法，有机溶剂法，生物碱法6未变性：盐析法4. 试验中硫酸铵盐析为什么要选择0%30%饱和度？答：依据易元龙7的文献，可以知道，在0-40%的饱和度范围之内，菠萝蛋白酶的酶活回收率随着饱和度的增大而增大，当饱和度大于40%时，菠萝蛋白酶的酶活回收率随着饱和度的增大而削减。因此，选择了该饱和度进行试验。参 考 文 献1 李建武，萧能，余瑞元等，生物化学试验原理和方法，北京，北京高校出版社，19942 余冰宾生物化学试验指导北京：清华高校出版社，20033 赵亚华，高向阳生物化学与分子生物学试验技术教程北京：高等教育出版社，20054 易元龙,李媚,谢涛,蓝丽红,廖安平,广西民族高校学报,2008,12，Vol