大规模培养细胞技术

1、欢迎下载大规模培育细胞技术摘要： 细胞培育工作始于20世纪初，现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为细胞与组织争辩的重要技术之一。近年来，随着基因工程和细胞工程技术的不断进展，动物细胞培育已成为大规模生产一系列有商品价值的生物制品的重要宿主，当前人们已经能够生产多种单克隆抗体、激素、细胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等。但是，试验室接受的细胞培育技术获得的细胞量有限，不能满足生产的需求，必修改用超产培育技术方法方可获得大量细胞，目前这种技术种类繁多，归纳起来有三大类：贴壁培育法；悬浮培育法；固定化培育法。细胞体外培育技术的不断进展和完善，为组织和器官培育以及现代生物技术前沿的转基因动

2、物技术、克隆技术、干细胞定向分化、体外受精、性别把握等一系列技术的进展奠定了基础。关键词：细胞培育；贴壁；悬浮；固定化前言动物细胞培育开头于本世纪初1962年，动物细胞培育规模开头扩大，进展至今已成为生物、医学争辩和应用中广泛接受的技术方法，利用动物细胞培育生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，动物细胞培育已成为医药生物高技术产业的重要部分。利用动物细胞培育技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。动物细胞大规模培育技术是生物技术制药中格外重要的环节。本文对细胞的培育工艺做一综述。1.细胞培育的定义细胞培育是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度

3、和肯定养分条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培育技术。细胞培育的培育物为单个细胞或细胞群。在医学遗传学争辩中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤成纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培育具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培育细胞株可在培育过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无限制制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。2.动物细胞培育的工艺2.1贴壁培育法贴壁培育是指细胞贴附在肯定的固相表

4、面进行单层培育。贴壁依靠性细胞在培育时要贴附于培育容器的壁上，细胞一经贴壁就快速铺展，然后开头有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培育表面，并形成致密的细胞单层。贴壁培育系统主要有滚瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等，其中尤以滚瓶培育和微载体生物反应器培育更为多见。2.1.1滚瓶培育系统培育贴壁依靠性细胞最初接受滚瓶系统培育。滚瓶培育的优势在于能增加供细胞贴壁的表面积，同时温存的滚动有利于细胞生长。细胞接种在滚动的圆筒形滚瓶中，培育过程中滚瓶不断滚动，在培育瓶滚动时，细胞有一段时间离开培育基，使细胞交替接触培育液和空气，增加了气体的交换，有利于细胞生长。滚瓶培育具有结构简洁，投资少

5、，技术成熟，重复性好，放大只需要简洁的增加滚瓶数量等优点。但滚瓶培育也有其缺点，劳动强度大，占地空间大，单位体积供应细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培育时监测和把握环境条件受到限制等。2.1.2微载体培育系统微载体培育技术于1967年被用于动物细胞大规模培育1。经过30余年的进展，该技术目前已日趋完善和成熟，并广泛应用于生产病毒疫苗和重要蛋白质产品等。微载体培育原理是将对细胞无害的微载体颗粒加入到培育容器的培育液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依靠性细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，但动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，所以无法靠提高搅

6、拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是在贴壁期接受低搅拌转速，时搅时停，数小时后，待细胞附着于微载体表面后，维持低转速（最大速度75r/min），进入培育阶段。我国从20世纪80年月后期开头了细胞培育专用介质的争辩工作，成功地开发了CT-1、CT-2和CT-3等适合于不同细胞系培育的微载体2,3。微载体法培育动物细胞有很多好处1：可在反应器中供应大的比表面积；兼有悬浮培育和贴壁培育的优点；可接受均匀悬浮培育；可用一般显微镜观看细胞在微载体上的生长状况；放大简洁；适用于多种贴壁依靠性细胞培育；细胞收获简洁；劳动强度小，占地面积小。微载体系统也有它的缺陷：细胞生长在微载体表面，易受到剪切损伤；微载

7、体价格比较贵；需要较高的接种细胞量。近年来，已经开发了很多新的多孔性微载体和新的反应器系统，以弥补微载体系统的不足。张孝兵等4,5以明胶为原料，用悬浮成球、甲苯制孔的方法制备了大孔明胶微载体。目前国外相继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培育的生物反应器系统和培育模式，如搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统和灌注式生物反应器培育模式等。（1）搅拌式生物反应器系统 该系统已有较长的历史，具备简洁、有用及价格低廉等特点。Werner等6成功地在该系统内进行了肝细胞大规模扩增的争辩。（2）旋转生物反应器（RCCS） RCCS既可以用于微载体大规模细胞培育，又能在其中培育细胞与支架形成的三维空间

8、复合体。至今，近百种的组织细胞均在该系统内进行了大规模扩增7。 （3）灌注式生物反应器培育模式 其特点是在细胞培育生物反应器系统中安装细胞/微载体截流装置，培育中不断加入新颖培育基以及不断地抽走含细胞代谢废物的培育基，使细胞得以在一个相对稳定的生长环境内增殖，既省时省力，又削减了细胞发生污染的机会，可以提高细胞密度在10倍以上8。在生物反应器中用微载体大规模培育贴壁细胞时，细胞经消化进行传代，操作很简单。现在已有不经消化直接进行微载体间细胞转移的成功报道，通常称为“球转球”。张立等9用球转球方法，以5LCelliGen细胞培育用生物反应器作法，在国产50LCellCul-50A细胞培育反应器中

9、培育Vero细胞，通过换液和灌注的方法，培育8天，细胞密度达1.2×107个/ml，然后接种狂犬病毒，连续培育10天，病毒滴度超过国家标准。另外，用这种球转球方法，放大培育鸡胚细胞生产法氏囊病毒液获得了成功10。2.1.3巨载体培育巨载体培育，是相对微载体和细胞而言的。在这种培育方式中，细胞虽然也像微载体一样贴附于固定的表面生长，但巨载体在生物反应器中是固定的，不由于搅拌而跟随培育液一起运动。2.2悬浮培育细胞悬浮培育是指在反应器中自有悬浮生长的过程。悬浮培育系统主要用于非贴壁依靠性细胞的培育。杂交瘤细胞的悬浮培育是争辩得最广泛和透彻的动物细胞培育过程，培育规模最大，操作最成熟。近年

10、来，随着无血清培育技术的进展，越来越多的贴壁依靠性细胞被驯化适合于无血清悬浮培育，例如重组CHO细胞和BHK细胞的大规模悬浮培育都获得了成功11。2.3固定化培育固定化培育是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培育的方法。细胞固定化的制备方法很多包括吸附法、共价贴附法、离子/共价交联法、包埋法、微载体法、自絮凝发等。（1）吸附法 用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法。（2）共价贴附法 利用共价键将动物细胞与固相载体结合的固定化方法。（3）离子/共价交联法 双功能试剂处理细胞悬浮液，在细胞间形成桥而絮结产生交联作用的方法。（4）包埋法 将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方

11、法。（5）微载体法12 用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及养分物质可自由出入半透膜的方法。（6）自絮凝发13 很多哺乳动物细胞系，特殊是在无血清培育下，具有相互聚集、形成细胞团的倾向。利用细胞的这一特性，可以接受沉降或过滤的手段，是细胞团截流在搅拌培育系统中，起到类似于微载体和多孔微载体的作用，结合细胞培育过程的检测成，提高机体对矿物质和微量元素的利用率 产生消化酶提高养分物质的利用率。和把握，实现细胞高密度长期培育和产物高效生产的方法。3.进展前景现利用细胞培育技术已经可以产出多种生物制品，如：狂犬病、小儿麻痹症等病毒疫苗，表皮生长因子等生长因子，激素、

12、干扰素、白细胞介素等生物调整剂，单克隆抗体及酶制剂等。细胞的大规模培育已成为必定趋势，大规模生产细胞技术将的到广泛应用。参考文献1 李雨田,陈因良,丁健椿.细胞培育专用微载体M.北京:化学工业出版社,1993:12202 张书元,徐殿胜,王国政.用于培育动物细胞微载体的制备J.华东化工学院学报,1989,15:143 陈因良,李雨田,张书元,等.小牛皮提取的胶原-微载体用于动物细胞大规模培育J.生物工程学报,1992,8:1571634 赵孝兵,张元兴,李雨田.大孔明胶微载体的制备J.华东理工高校学报,1997,23:412416,4215 赵孝兵,张元兴.用大孔明胶微载体培育Vero细胞J.

13、 华东理工高校学报,1997,23:4174216 Werner A,Duvar S,Muthing J.Cultivation of immortalized human hepatocytes HepZ on macroporous CultiSpher GmicrocarriersJ.Biotechnol Bioeng,2000,68:59707 Mitteregger R,Vogt G,Rossmanith E,et al.Rotary cell culture system(RCCS):a new method for cultivating hepatocytes on micro

14、carriersJ.Int J Artif Organs,1992,22:8168228 Oh D J,Choi S K,Chang H N.High-density continuous cultures of hybridoma cells in a depth filter perfusion systemJ.Biotechnol Buoeng,1994,44:8959019 张立,严春,范卫民,等.Vero细胞的微载体培育放大过程中的接种工艺J.华东理工高校学报,1998,24:65966310 Zhang L,Zhang Y,Yan C,et al.The culture of ch

15、icken embryo fibroblast cells on microcarriers to produce infectious bursal disease virusJ.App Biochem Biotechnol,1997,62:2913011 Chu L,Oobinson DK.Industrial choices for protein by larger-scale cell cultureJ.Curr Opin Biotechnol,2001,12:18018712 吉鑫松,陈国荣,朱冬发,等.动物细胞的微囊化培育M.北京:化学工业出版社,1993:112013 刘红,刘

16、兴茂,吴本传,等.流体动力学对HEK293细胞的细胞团形成及细胞生长和代谢的影响J.生物工程学报,2006,22:101106外 文 翻 译题 目：牛痘病毒疫苗的过去、现在和将来牛痘病毒疫苗的过去、现在和将来摘要：牛痘病毒疫苗一度比其他人用疫苗更为广泛的用于人类的疫病免疫。近两个世纪以来，牛痘病毒疫苗被大量使用，为人们抵制天花的感染供应交叉爱护，直到上世纪70年月天花被人类彻底毁灭。即使天花已经被完全毁灭，但人们仍连续对牛痘病毒疫苗进行不间断的争辩，并研制出很多具有更高平安性的改良疫苗。通过在非易感宿主体内连续传代、敲除病毒的毒力基因，或者增加病毒爱护性抗原的表达等策略，疫苗的毒性已经得到进一

17、步的降低。高度减毒的第三或第四代的牛痘病毒疫苗现今仍被大量储备，以防备可能被用于生物恐怖武器的天花病毒。科研人员现在也经常将牛痘病毒的基因组作为一个有力的基因工具，用来生产多种新型的基因载体疫苗，例如一种用于野生动物狂犬病的口服疫苗，其关键的糖蛋白基因即是由重组的牛痘病毒所携带并有效表达。关键词：痘病毒；痘；天花；牛痘病毒；疫苗载体 导言 200年前，爱德华·詹纳第一次引种牛痘病毒抵挡天花病毒，这是人们历史上唯一一次格外成功的公众健康干预事例。这种方法起源于英国格洛斯特郡，在农场四周被广泛使用，最终在70年月末引起一场全球性毁灭天花的运动的发生。虽然自然感染的天花病毒已由于人们的免疫

18、接种而被毁灭，但人们对牛痘病毒以及天花病毒牛痘疫苗的爱好并没有消逝。在过去的三十年中，争辩人员通过各种试验室手段，发觉并获得一株高度减毒的、平安性能明显提高的新型病毒。与此同时，牛痘基因组因其高度的复制力量和载体功能，被病毒学家视为生产多种病原微生物疫苗的首选。1.正痘病毒抗原交叉反应和推广战略痘病毒分为8个属。其中人们最感爱好的正痘病毒属包括：天花病毒，即痘病毒的代表性病毒；牛痘病毒，即詹纳最先使用的疫苗；疫苗毒，在19世纪的某些期已取代牛痘病毒成为首选的免疫制品。由于正痘病毒属病毒蛋白结构自然具有高度的保守性，因此由VACV可为其它多种正痘病毒例如猴痘病毒的感染，供应交叉爱护。痘病毒具有大

19、型的基因组（130,000-375,000个核苷酸），因其允许插入和表达外来的大型基因，使得它们成为抱负的基因工程苗载体。痘病毒复制周期中的很多特点都将影响其作为疫苗在使用中的功效。复制起始阶段，病毒核芯进入细胞，早期基因转录的结果将产出一系列免疫调整蛋白，可封阻机体抗病毒反应程序的启动，包括IFN的作用。经过现代争辩表明，敲除或修改这些病毒基因是修改病毒疫苗毒力的一种格外有效的手段。在其后的复制周期中，具有传染性的病毒粒子即可产生具有牛痘疫苗效果的病毒蛋白，并在病毒粒子成熟后从病毒的囊膜表面释放出来。通过基因敲除技术，转变病毒囊膜表面的特定蛋白（如B5R）也可以减弱病毒疫苗的毒力。2.全球毁

20、灭天花运动前牛痘苗的进展在人类对抗天花历史上，1000年前已有人进行人痘接种(Radetsky,1999)。人们从天花病人的脓胞液中猎取天花病毒，经吹入法或划痕法给人群接种，这种方法虽会引起严峻的局部反应、周身皮疹和全身症状，但它将由感染天花而导致的人群死亡率由20-30%降至0.5-2%。尽管并发症的发生几率比较高，但人痘接种还是被普遍的应用，直至19世纪初期。由于痘病毒属成员的抗原都具有较高的同源性，所以经免疫后，人类几乎可以抵制任何痘病毒属病毒的攻击。17世纪后期，爱德华·詹纳发觉牛痘可以挂念人们预防天花。自从人们发觉牛痘接种比人痘接种要平安以后，牛痘接种很快成为了最主要的免疫

21、手段。随着时间的消逝，牛痘病毒疫苗已经取代了人痘疫苗成为免疫的主要制剂。众所周知，牛痘病毒疫苗在遗传上与人痘病毒和天花病毒皆有所不同，虽然它与马痘极其相近，但它的起源我们无从得知。詹纳的牛痘病毒是第一代痘病毒的代表。3.第一代牛痘疫苗和全球毁灭天花运动人类是唯一一个已知的天花病毒的自然宿主。正是由于这个缘由以及牛痘疫苗的精确功效，使得人们在1966年加紧了全球毁灭天花方案。这项方案的基本策略是在每个地区建立监测系统，防止暴发流行。由于这些措施的有效实施，天花的发病率逐年降低，最终一个自然感染的天花病例消灭在1977年的索马里。1980年5月，世界卫生大会发表声明，世界将不会再有自然发病的天花病

22、人（Rotz.等人,2001; Wehrle，1980）。1982年，在美国唯一一家允许生产牛痘疫苗的厂家停止生产一般用牛痘疫苗，1983年一般人群也停止了疫苗的使用。在毁灭天花病毒方案实施期间，这些疫苗的大多数是在活的绵羊、水牛及兔子的皮肤上生产的(Anon.,2002)。在毁灭天花方案过程中应用了很多病毒毒株。美洲和非洲西部用的是纽约市卫生局的毒株（NYCBH）。这个方案的相关争辩始终在惠氏公司的试验室进行，并持续到2007年8月前。Dryvax®是唯一在美国可以有限制使用的商品化牛痘苗(Rosenthal et al.,2001)。Dryvax®牛痘苗是以NYCBH为生产毒株，感