两个封闭群SPF级昆明小鼠遗传背景调查.docx

1、.论著.两个封闭群SPF级昆明小鼠遗传背景调查班建荣，胡芹宝，张新创(兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，兰州730046)摘要：目的比较两个封闭群SPF级昆明(KM)小鼠的遗传差异，调查引进的SPF级KM小鼠封闭繁殖6年后，其遗传构成是否发生变化。方法应用微卫星DNA标记方法对18个位点在两个群体中的遗传差异进行分析，主要包括观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含ffi(PIC).Shannon信息指数、遗传分化系数(乙)、遗传距离等遗传参数。结果两个封闭群SPF级KM小鼠在18个微卫星位点共发现67个等位基因

2、.Na为28个，平均3.7222个;Ne为1.9459-6.5442,平均2.7966个；Ho为0.4225-1.0000,平均0.8823；He为0.48920.8527,平均0.6162；Shannon信息指数0.6792】.9526,平均1.0598；皿为0.36800.8301,平均0.5317；七平均值为。159,表明群体间的遗传差异仅1.59%,二者间的遗传距离(DA)为0.0499。结论两个封闭群SPF级KM小鼠遗传结构相似度极高，它们与原引进群体的分化差异极小。关键词：封闭群;SPF；KM小鼠;遗传背景中图分类号：Q341文献标志码：A文章编号：1005-5673(2013)0

3、5-(X)06-()4GeneticbackgroundofSPFmicefromKunmingspeciesintwoclosedcoloniesBANJian-rong,HUQin-bao,ZHANGXin-chuang(IjanzhoufnstiliilionofBiologicalProductsCo.Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Ijanzhou7300461China)Abstract:ObjectiveComparegeneticdifferencesbetweentheSPFKMmiceintwo

4、closedcolonies(group)andinvestigatewhethertheSPFKMmiceoccursignificantchangesingenestructureaftertheir*sreproductioninacertainlongtime.MethodAnalysisofthegeneticdifferencesof18locusinthetwogroupswascarriedoutbythemethodoflabellingmicrosatelliteDNAmarkers,whichincludesobservationofnumberofalleles(Na)

5、,effectivenumberofalleles(Ne),observationheterozygosity(Ho),expectedheterozygosity(He),polymorphicinformationcontent(PIC),Shannon'sinformationindex,coeflicientofgeneticdifferentiation,geneticdistanceandsoon.ResultWefound67allellesin18rnicrosatellitelociofSPFKMmiceintwoclosedcolonies,Nawith2-8and

6、mean3.7222ateachlocus;Neis1.9459-6.5442,withanaverageof2.7966;Hois0.4225-1.0000,withanaverageof0.8823;Heis0.4892-0.8527,withanaverageof0.6162;Shannon'sinformationindexis0.6792-1.9526,average1.0598;PICis0.3680-0.8301,withanaverageof0.5317;theaverageofFSTis0.0159,indicatingthatonly1.59%geneticdiff

7、erencefromSPFKMmiceintwoclosedcolonies,(adifferenceof98.41%fromwithinpopulations;)geneticdistance(DA)betweenthetwogroupsis0.0499.ConclusionThegeneticstructureofSPFKMmiceisinaveryhighhomogenecityintwoclosedcoloniesandthevenationisextremelytinyintwoclosedcoloniesandtheoriginalpopulation.Keywords；Close

8、dcolony;SPF;KMmice;Geneticbackground昆明小鼠自1946年引入中国后，各地长期封闭饲养，导致各群体的遗传与表型分离,影响品系的标收稿日期:2013-06-20；修回日期：2013-07-02作者简介:班建荣（1975）.女，本科.医学生物学工程师，主要从事实验动物质量控制工作“E-mail：bjr426,准化以及动物实验结果的一致性与可比性。鉴于此,研究采用广泛存在于生物体基因组，具有分布广泛、多态性丰富、易于检测、呈孟德尔共显性遗传等特点的微卫星DNA标记技术对2007年兰州生物制品研究所有限责任公司（以下简称兰州公司）从中国食品药品检定研究院（以卜.简称中

9、检院）引进的SPF级KM小鼠和中检院SPF级KM小鼠的遗传背景进行调在，分析比较中检院SPF级KM小鼠与兰州公司SPF级KM小鼠的遗传差异，评估引进6年来遗传多样性及其与中检院SPF级KM小鼠群体分化情况。1材料和方法11材料两个封闭群SPF级KM小鼠39只均由兰州公司实验动物室生产许可证号:SCXK(It)2012-0001提供;PlusDNA聚合酶,G2101DNAUdderMarker均购自Fermantas；SK8252基因组小量抽提试剂盒、蛋白酶K、dNTPs、SM0271和SM037IDNAI湖I如Marker均购自上海生物工程技术服务有限公司;DR(X)4APremixTaqg购

10、自大连宝生生物工程有限公司；普通试剂及所需的仪器设备均由兰州公司实验动物室提供。1.2基因组DNA的提取截取KM小鼠0.61.0cm长鼠尾，用消毒剪刀剪成细小碎块放入1.5mL的塑料离心管中，按照分子克隆实羚指南方法提取组织DNA。1.3引物选择及筛选根据文献2和GENEBANK,选择多态性好、分布于不同染色体上的微II星位点进行实捡,根据扩增结果特异性及其重发性、稳定性,最终选取位于H条染色体上的18个微卫星位点(D4Mit9、D4MH108、D51it3l、D6Mit9、D6Mit36、D8Mii24、I)8Mit3OJ)9Mit21、DllMit35、DIIMit36、D12Mii34、

11、D12Mit35、D12Mit29、D12Mill90、D13Mit18、D14Mii50J)16Mit50J)XMitll7)进行研究，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。14PCR扩增程序25jiL反应体系：10xbuffer2.50皿,25mmol/LMgCL1.5()jlL.2.0mmol/L(INTP1.00头1,().5UTaq聚合K2.00plLJOjimol/L引物上、下游各1.00piL,50100ng/皿模板DNA0.5|ilddH2015.5|iL9反应条件为：95T顶变性5min；94Y变性30s；50-60Y退火30s,72X.延伸1min,35个循环后

12、72T延伸10min,扩增产物于4Y保存。1.5电泳及银染检测方法取68皿扩增产物，在8%聚丙烯酸胺凝胶进行电泳，160V,90-12()min。于10%的冰醋酸中固定凝胶15min,采用0.2%的硝酸银染色30min,亍2%碳酸钠显色液(含甲醛)中显色，以4%的冰醋酸中终止显影，然后拍照进行凝胶检测分析。1.6数据统计与分析以pBR322DNVBsi)RI(Haelll)分子量标记物为标准，采用SensiAnsys凝胶图像分析系统,判断微J.星位点的基因型和单因片段大小。微I!星呈共显性遗传，理论上纯合子为-条带，杂合子为两条带,确定等位基因数目应用Genus3.0软件和1叩-genel,3

13、2软件可以得出观察等位基因数、有效等位基因数、观察杂合度、期望杂合度及Shannon信息指数等遗传多样性参数以及两群体间的遗传分化系数(七K、心)和遗传距离(DA)。2结果2.1KM小鼠墓因组DNA检测1%琼脂糖凝胶电泳检测KM小鼠埃因组DNA结果见图I;用紫外分光光度汁测定DNA样品在临心处的，I值，计算烦/%的比值均在1.6-1.8之间，平均值为1.63。图1KM小鼠基因组DNA检测结果Fig.I(JenrinicDXArxtraclrdfromKMnwiusr2.22.2PCR扩增后琼脂糖检测PCR扩增后琼脂稽检测结果见图2图2中检院KM小鼠D5Mit31位点PCR扩增产物琼脂糖电泳检测

14、结果Fig.2AgaiwrgelelectrophoresisofthePCRpnxhictwith1)5Mit3llocusinKMmousefromBeijing2.3SDS-PAGE电泳结果由于琼脂糖电泳分辨率较低，特异PCR产物在检测时只是在紫外灯下睨测到一条亮带，而聚丙烯依胺凝胶电泳(PAGE)采用银染方法染色具有不易扩散、较高的分辨率且易于观察3,能够很好地展现出微卫星位点的多态性,见图3<2.4各微卫星位点在总群体上遗传变异统计18个微卫星位点在两封闭群SPF级KM小鼠群体各个体的基因型，计算各位点的观察等位基因数、有效等位基因数、观察杂合度、期杂合度、F-统计量、Shan

15、non信息指数、多态信息含量(PIC)等，结果见表1。267图3中检院KM小鼠D11MU35位点PCR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果Fig.3PAGEofthePCRwithDllMit35locusinKMmousefromBeijing表1各微卫星位点的遗传变异Tab.i(ienrticvariationofmicrosatrlliteloci位点(Locus)观察等位基因数(Na)有效等位堪因数(Ne)观察朵合度(Ho)期望杂合度(He)F-统计量Shannon信息指数多肽信息含址(PIC)七心nD4Mit98.00006.54420.88310.8527-0.0629-0.04!1

16、0.02061.95260.8301D4MillO84.00002.69480.94520.6333-0.5023-0.49740.00331.11410.5564D5Mit3l5.00003.18850.98680.6909-0.4976-0.43780.04001.30030.6299l)6Mii93.00002.47560.96200.5999-0.6556-0.61630.02370.97780.5133D6Mil366.00002.95990.93590.6664-0.4157-0.41130.00311.27000.6080D8Mit243.00002.52940.42250.60

17、890.24990.30670.07571.01090.5365l)8Mit303.00002.71980.64180.6371-0.0244-0.01170.01241.04670.55854.00003.32620.84420.7039-0.2375-0.21090.02151.29520.6509DllMit354.00003.04130.98700.6756-0.4839-0.46670.01161.19630.6078DllMil366.00002.65290.97470.6270-0.57200.56230.00621.18690.5510D12Mil343.00002.19680

18、.96200.5483-0.7660-0.76510.00050.85630.4418D12Mit352.00002.00001.00000.5032-1.0000-1.00000.00000.69310.3750DI2Mit292.00001.99970.98700.5032-0.97370.97330.00020.69310.3750)12Miil902.(XX)01.99460.94810.5019-0.9040-0.90290.00060.69180.3743DI3Mitl82.00001.94590.83330.4892-0.7216-0.71430.00420.67920.3680

19、DI4Mit504.00003.25560.83540.6973-0.2256-0.20530.01661.24690.6328DI6Mil502.00001.99700.85710.5025-0.71610.71580.00020.69240.3746DXMitH74.00002.81660.87500.6495-0.3935-0.35670.02651.17230.5876平均值3.72222.79660.88230.6162-0.4635-0.44030.01591.05980.531718个微卫星位点共发现67个等位基因，各位点表现出不同程度多态性.l)4Mit9的等位基因数最高为8个

20、；D12Mit34、D12MH35、Dl2Mitl90、D13Mitl8,D16Mit50的等位基因数最低为2个，平均为3.7222个;D4Mit9的有效等位基因数最高为6.5442,l)l3Mitl8的有效等位基因数最低为1.9459,平均为2.7966个；D12Mit35的观察杂合度最高的为l.(XX)0,D8Mit24的睨察杂合度最低为0.4225,平均为0.8823；l)4Mit9的期望杂合度最高的为0.8527,D13MH18期望杂合度最低的为0.4892,平均为0.6162；Shannon信息指数最高的D4Mit9为1.9526,最低的D13MiH8为0.6792,平均为1.059

21、8；多态信息含量最高的D4Mit9为0.8301,最低的DI3Mitl8为0.3680,平均为0.5317,具有良好的多态性。2.5两个封闭群SPF级KM小鼠间的关系从表1中可以看出：两个封闭群SPF级KM小鼠间的遗传分化系数(巳)，在0.00000.0757之间，仅在位点D8Mit24匕=0.0757,其余各位点几<0.05,平均值为0.0159,表明遗传差异仅1-59%来自群体间,98.41%的差异来自种群内。运用遗传学分析软件计算出兰州公司与中检院两封闭群SPF级KM小鼠间遗传距离为0.0499,表明两封闭群间遗传距离很小;两封闭群间遗传相似度极高，数值达0.9513,而差异度仅为

22、0.0487,可以看出两封闭群间分化程度非常微弱。说明兰州公司2007年从中检院引进的SPF级KM小鼠过6年的封闭繁殖，遗传结构并没有发生大的变异，见表2。表2两封闭群SPF级KM小鼠遗传距离Tab.2GeneticdistanceofSPFKMmicefrombothclosedcolon注：0.0499为遗传距离,0.9513为遗传相似度PopID兰州公司中检院兰州公司00.9513中检院0.049903讨论3.1遗传标记方法的选择分子遗传标记的研究一直是遗传学研究中的一个热点。在各种分子遗传标记中,微卫星DNA标记以其特异性的扩增、稳定性、重复性好、较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变

23、化等特点，被认为是理想的遗传标记方法，在动物遗传分析研究中得到广泛的应用。故研究采用微卫星DNA标记方法检测两个封闭群SPF级KM小鼠的遗传结构变异情况。3.2样本容量的确定样本容量是影响群体间遗传距离精度的一个重要因素，样本容量越大，测得的遗传距离精度就越高。因此,适当地增加样本容量可以减少取样误差，提高遗传距离的估测精度。参考闫路娜等关于样本量对各种遗传多样性度量指标的影响得出的结论:样本大小与所观测到的每位点等位基因数、平均等位基因数及基因丰富度指数均呈显著正相关，而与期望杂合度无显著相关，对大多数种群遗传和分子生态学研究而言,30-50个个体是微卫星DNA分析所需要的最小样本量。实验所选群体样本量为39,符合样本量要求,能够反映种群的整体水平。3.3遗传多样性指标KM小鼠作为封闭群动物，被广泛应用于人类遗传研究、药物筛选、毒物试验、生物制品和化学制品的检定等方面，主要是由于其具有类似于人类群体遗传异质性的遗传组成，其动物试验结果类似于人群对同一试验的反应。因此，良好的遗传多