A型肉毒毒素ELISA鉴别试验方法的建立.docx

1、论著A型肉毒毒素ELISA鉴别试验方法的建立箫在澜I,王欢，顾会2,杨雨生I,赵建荣2,徐永浩I,张华捷21.兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州730046；2.中国食品药品检定研究院.北京100050摘要：目的建立鉴定A型肉毒毒素的EUSA鉴别试验方法以替代传统的动物试验法。方法采用现代免疫学技术，制备马源性和兔源性抗A型肉毒毒素多克隆抗体，建立了双抗体夹心EUSA,并就此初步进行方法学验证。结果所建立的ELISA具有良好的特异性、灵敏度、精密度和耐用性，具有替代动物试验方法的良好前景。结论在进一步验证和确认之后，该方法有望正式成为可用于鉴定A型肉毒毒素的试验

2、方法以替代动物试验法。关1词：注射用A型肉毒毒素;鉴别试验;酶联免疫吸附分析;替代;动物试验法中图分类号：R378.8.3文献标志码：A文章编号：1005-5673(2015)04-0031-03DOI：10.13309/ki.pmi.2015.04.005EstablishmentofanELISAidentificationforbotulinumtoxintypeAXIAOZai-lan*,WANGYuan,GULei,YANGYu-sheng,ZHAOJian-nin,XUYong-hao,ZHANGHua-jie,LanzhouInstituteofBiologicalProduct

3、sCo.,Ltd.,CenterfarGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou7300461GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor:ZHANGHua-jie,E-mail：zhjh21979Abstract:ObjectiveToestablishanewidentificationmethodforbotulinumtoxintypeA(botA)toreplacethetraditionalanimaltest.MethodsAdoubleantibodysandwichELISAwasesta

4、blishedbasedonthemodemimmunologicaltechnology,byusingpreparedtwokindsofanti-botApolyclonalantibodiesderivedfromequineandrabbitorigin,andapreliminaryveriGcationtestwasperformed.ResultsTheestablishedidentificationEUSAcouldbeapotentialalternativemethodinreplacementofanimaltest,itisofgoodspecificity,sen

5、sitivity,precisionandrobustness.ConclusionTheestablishedmethodwillbeexpectedtobeapprovedfortheidentificationtestofbotulinumtoxintypeAasthereplacementmethodfortraditionalanimaltestbyafurtherverificationandvalidation.Keywords:BotulinumtoxintypeAforinjection;Identificationtest；ELISA;Replacement;Traditi

6、onalanimalteat注射用A型肉毒毒素是一种以A型肉毒毒素为有效成分的注射剂，主要用于治疗和缓解肌肉痉挛性疾病，如眼睑痉挛、斜视等，也可用于除皱等医学美容领域。由于肉毒毒素有A、B、C、D、E、F、G、H8种血清型，因此在对注射用A型肉毒毒素的质量控制中，鉴别试验尤为重要。现行A型肉毒毒素鉴别试验采用动物中和试验法，通过将待检品与不同型别的肉毒抗毒素中和后注射小鼠，根据动物发病和死亡情况来推断待检品所含的肉毒毒素型别。该方法经多年运用，结果稳定可靠，但操作复杂，试验周期长，需使用大量作者简介:萧在调，医学生物学工程师,主要从事生物制品质量控制与质最管理工作。通讯作者：张华捷，E-mai

7、l：zhjhz!979实验动物，已不符合当前对实验动物“3R”原则的要求。英国动物学家William和Rex曾于1959年提出“3R”原则，即对于动物试验的替代(Replacement)、减少(Reduction)和优化(Refinement)的原则。随着社会经济的发展和人们对动物福利认识的不断提高，开发动物替代试验方法以减少实验动物的使用已成为当今实验室检测技术发展的一大趋势。在此背景下，研究拟通过建立可用于快速鉴别A型肉毒毒素的ELISA法，并评估其替代动物试验的可行性。1材料和方法11材料注射用A型肉毒毒素“衡力”(批号:20140103.20140104和20140409)由兰州生物制

8、品研究所有限责任公司(简称兰州公司)毒素室提供;14批疑似注射用A型肉毒毒素样品由中国食品药品检定研究院提供;各型肉毒类毒素、马抗A型肉毒毒素IgC和兔抗A型肉毒毒素IgG均由兰州公司血清室提供;辣根过氧化物酶（HRP）标记马抗A型肉毒毒素IgG由中国食品药品检定研究院提供；四甲基联苯胺（TMB）显色剂购自美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。1.2 建立双抗体夹心ELISA用10jig/mL的兔抗A型肉毒毒素IgG包被96孔酶标板，每孔100pl,28T放置过夜；用洗液（含0.05%Tween-20的PBS缓冲液）洗板3次，每孔加入200pl，封闭液（含1%BSA的PBS缓冲液），37七孵

9、育1h,洗板3次;每孔加入待检样品,37T孵育1h,洗板6次;每孔加入100jiL1：5000稀释的HRP标记马抗A型肉毒毒素IgG,37丁孵育1h,洗板6次；每孔加入100jiLTMB显色剂，显色510min；每孔加入50皿终止液（2mol/LH2SO4）,在酶标仪4伽波长读板。以PBS缓冲液为阴性对照，阴性对照孔的吸光度值的2.1倍为Cut-off值,如待检品孔吸光度值超过Cut-off值，则判定A型肉毒毒素阳性。1.3 双抗体夹心ELISA方法的验证1.3.1特异性以A型肉毒类毒素为阳性对照，其他型肉毒类毒素（B、C、D、E、F）、破伤风类毒素和金黄色菊萄球菌肠毒素C2为阴性对照，对所建

10、立ELISA法的特异性进行验证，上述各型类毒素和毒素的质量浓度均为1|ig/mLo1.3.2灵敏度（检出限）将20140103批“衡力”用PBS稀释至100、50、25、12.5和6.25U/mL,进行ELISA检测,对方法的灵敏度进行验证.1.3.3精密度将3批“衡力”用PBS稀释至100U/mL,每批平行检测8次,分别计算批内、批间和总变异系数（CV），对方法的精密度进行验证。1.3.4耐用性将3批“衡力”用PBS稀释至100U/mL,在不同日期分别用ELISA法测定，共测定5次,对方法的耐用性进行验证。13.5ELISA法与动物中和法的比较对获自中国食品药品检定研究院的14批疑似注射用A

11、型肉毒毒素样品包括3批动物试验结果为阴性的样品，用ELISA与动物中和试验法进行比较。2结果2.1双抗体夹心EUSA方法的特异性验证如表1所列，阳性对照呈强阳性反应，而其他各型阴性对照均无交叉反应。表1ELISA方法的特异性验证Tab.1TheverificationforspecificityoftheELISA样品450Cut-off值A型肉毒类毒素2.5580.194B型肉毒类毒素0.1720.194C型肉毒类毒素0.0700.194D型肉毒类毒素0.0650.194E型肉毒类毒素0.0740.194F型肉毒类毒素0.1320.194破伤风类毒素0.0730.194金葡菌肠毒素C20.0

12、750.194PBS（阴性对照）0.0920.194双抗体夹心ELISA方法的灵敏度验证如表2所列,建立的ELISA法，对'衡力”中A型肉毒毒素的检出限可达12.5U/mL,完全能够满足对于市场上100U/瓶和50U/瓶两种规格产品进行检测的需要O表2ELISA方法的灵敏度脸证Tab.2TheverificationforsensitivityoftheELISA浓度（U/mL）*450Cut-off值100.001.1280.19450.000.5640.19425.000.3330.19412.500.2020.1946.250.1350.194双抗体夹心ELISA方法的炳密度验证

13、如表3所列,6批样品的批内CV值均低于10%,进一步计算3批样品的批间CV值为7.53%,总CV值为7.76%,可见所有样品的批内、批间和总CV值均低于10%，表明该方法精密度良好。表3ELISA方法的精密度验证Tab.3TheverificationforprecisionoftheELISA次数样品1样品2样品310.7640.6730.68020.7020.6530.64130.6960.5860.60640.7170.6500.64950.7340.6180.63560.7310.6210.61770.7300.6000.62980.7540.6950.709CV(%)3.2205.8

14、405.2402.2 双抗体夹心ELISA方法的耐用性验证如表4所列，在不同时间段的检测结果较为接近，所有样品的检测结果均高于Cut-off值，且CV值均小于10%，表明该方法有较好的耐用性。表4EUSA方法的耐用性验证Tab.4TheverificationforrobustnessoftheELISA次数样品1样品2样品3Cut-off值10.7640.6730.6800.17920.7530.7010.7040.18130.7560.6780.6910.17440.7780.6540.6780.19550.8090.7430.7490.210CV(%)2.9604.9504.150/双抗

15、体夹心ELISA的适用性验证对14批疑似注射用A型肉毒毒素样品包括3批动物试验结果为阴性的样品，用ELISA与动物中和试验法的检验结果完全一致，如表5所列，表明建立的ELISA具有较好的适用性。表5EUSA方法的适用性验证Tab.5TheverificationforapplicabilityoftheELISA样品上50Cut-off值动物试验结果一致性10.6400.109阳性符合20.8680.109阳性符合30.7010.109阳性符合40.0310.109阴性符合50.5340.109阳性符合60.1770.109阳性符合70.0810.109阴性符合80.3560.109阳性符合9

16、0.3120.109阳性符合100.2420.109阳性符合110.0400.109阴性符合120.6180.109阳性符合130.2720.109阳性符合140.3530.109阳性符合3讨论近年来，注射用A型肉毒毒素在医学美容等领域的应用日益增加。目前在中国已上市的注射用A型肉毒毒素只有爱尔兰Allergan公司生产的“Botox”和兰州公司生产的“衡力”两种产品。无论是中国药典还是进口药品注册标准，对这两种A型肉毒毒素制剂的鉴别试验均采用动物中和试验法，而动物法由于实验周期长，操作复杂等原因，给产品的质量控制带来了诸多不便，建立简便有效的替代方法,不仅能够节约实验成本,减少对动物的使用，

17、而且能更好的对产品的质量进行控制。欧洲药典规定可以采用免疫化学分析方法对注射用A型肉毒毒素中的肉毒毒素成分进行鉴别试验。ELISA是一种常见的免疫分析方法，应用已十分成熟。用兰州公司制备的两种动物源性特异性多克隆抗体.建立了针对A型肉毒毒素的双抗夹心ELISA方法，并经过初步的方法学验证，确认了该方法的可靠性和稳定性。采用本实验方法对进口的“Botox”及市场上一些无明确来源的疑似A型肉毒毒素制剂，同样能够检出A型肉毒毒素成分，实验用ELISA与动物中和试验法检验的初步结果完全一致，表明建立的ELISA法有较好的适用性。提示该方法可能有更广泛的应用前景，例如对未知样品进行A型肉毒毒素筛检等。还需联合不同的实验室对所建立的ELISA法作进一步验证和确认。在获得更充分的数据后，有望成为替代动物中和试验的可靠方法。参考文献1BarashJR,AmonSS.AnovelstrainofClostridiumbotulinumthatproducestypeBandtypeHbotulinumtoxins:J.JInfectDis,2014,209(2)J83-191.2 国家药典委员会