HPLC测定川芎药材和饮片中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量及其质量评价指标

1、HPLC测定川芎药材和饮片中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量及其质量评价指标吕光华 1, 2 收稿日期 2009-08-10通信作者 * 吕光华，Tel: (028) 61800231; E-mail: ，程世琼 3，陈金泉 2，梁士贤 2，赵中振2(1. 成都中医药大学 药学院 中药材标准化教育部重点实验室，四川 成都611137;2. 香港浸会大学 中医药学院，香港 九龙塘; 3. 四川省食品药品检验所，四川 成都610036)摘要 目的：建立HPLC测定川芎药材和饮片中游离阿魏酸和总阿魏酸的方法，测定不同来源的川芎样品，以期研究其质量评价指标。方法：用甲醇-甲酸（95 : 5）和甲醇0.24

2、mol.L-1碳酸氢钠水溶液（95 : 5）分别提取川芎样品中的游离阿魏酸和总阿魏酸。HPLC采用Alltima C18 (4.6 mm 250 mm，5 m) 色谱柱，保护柱为C18 (4.6 mm 7.5 mm，5 m)；以乙腈和1%冰醋酸水溶液为流动相，梯度洗脱；流速为1.0 mL.min-1；柱温为30 oC；测定波长为320 nm；进样量为10 L；以外标法测定样品中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量。结果：游离阿魏酸和总阿魏酸分别在0.01 0.20 g和0.05 0.46 g呈线性关系，回收率分别为95.7和98.5% (n = 6)。32份川芎药材和饮片中总阿魏酸与游离阿魏酸的含量之比

3、为1.03 4.98，平均值为2.38 (n = 32); 1份川芎栽培苓子中二者之比值达19.6。15份从川芎主产区收集的根茎药材中总阿魏酸的平均质量分数为1.42 mg.g-1，按平均值的80%和药材含水量10%计算，则川芎药材中总阿魏酸的含量以干燥品计为1.25 mg.g-1。结论：本方法可测定稳定、具有可比性的阿魏酸含量，操作简便，适合于川芎药材和饮片中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量测定。阿魏酸在川芎样品中以游离和结合型共同存在，但以后者为主，并以总阿魏酸的量发挥药效，故应以总阿魏酸为川芎药材和饮片质量评价的指标。 关键词 川芎；游离阿魏酸；总阿魏酸；高效液相色谱法；含量测定；质量评价川芎

4、为常用的活血化瘀药，来源于伞形科植物川芎 (Ligusticum chuanxoing Hort.) 的干燥根茎 1。现代化学和药理研究结果表明，川芎的活性成分主要包括苯酞类、酚酸类和生物碱类成分2-3。虽然对川芎中藁本内酯 (ligustilide)、阿魏酸 (ferulic acid) 和川芎嗪 (ligustrazine) 含量测定的文献报道较多 4-10, 但是在中国药典（2005年版）中川芎仍然没有质量控制的指标成分1。作者研究了大量的相关文献，认为其原因在于藁本内酯不稳定，对照品难以保存，纯度下降；阿魏酸对照品稳定，但报道的测定方法准确性差，结果误差大；川芎嗪被认为是川芎药材的特征

5、性成分，但具有升华性，供试液制备的步骤多，定量分析的结果误差大。作者曾对当归中藁本内酯和阿魏酸的测定方法进行过深入研究11-13，认为阿魏酸可最先作为川芎药材和饮片质量评价的指标性成分。台湾中华中药典（2004年版）中将阿魏酸大于0.07%规定为川芎药材的质量控制指标 14。为此，本研究建立了准确、快速地用HPLC测定川芎药材和饮片中游离阿魏酸和总阿魏酸含量的方法，并测定了33份不同来源的川芎药材、饮片和栽培苓子样品，分析了川芎药材和饮片的质量与阿魏酸含量的相关性，提出了评价川芎药材质量的总阿魏酸含量指标，以期为制定川芎药材的质量标准提供科学依据。1 仪器与材料Agilent 1100型高效液

6、相色谱仪 (美国)，配置G1322A真空在线脱气机，G1312A四元梯度泵，G1329A自动进样仪，G1316A柱温箱，G1315A二极管阵列检测器。电子分析天平为德国Satorius (d = 0.1 mg, CP224S) 和瑞士Mettler Toledo (d = 1 g, MT5)。超声提取器为Branson 5510E-MTH型（美国）。阿魏酸对照品购于中国药品生物制品检定所（北京），其纯度用HPLC色谱峰的面积归一化法计算大于98.0%。甲醇（分析纯）和乙腈（色谱纯）为Lab-scan (泰国)，分析纯的甲酸、冰醋酸和碳酸氢钠为Uni-chem (波兰); 纯净水由Millipo

7、re净水器 (美国)产生。33份川芎样品从川芎的道地产区四川省都江堰市、彭州、崇州和非地道产区以及香港不同公司收集 (表1)，由香港浸会大学中医药学院赵中振教授和吕光华博士鉴定。2 方法2.1 色谱条件 Alltima C18 色谱柱(4.6 mm 250 mm, 5 m)；C18保护柱(4.6 mm 7.5 mm，5 m)；流动相由乙腈和1%冰醋酸水溶液组成，梯度洗脱，0 18 min乙腈19%，18 60 min乙腈19% 100%；流速1.0 mL.min-1；柱温为30 oC；测定波长为320 nm，HPLC-DAD在线收集紫外光谱的范围为200 400 nm；进样量为10 L。在该色

8、谱条件下，阿魏酸峰达到基线分离。对照品和川芎供试液的色谱图见图1。(A)(B)图1 对照品及样品HPLC图 A. 对照品; B. 供试品; a. 游离阿魏酸的测定; b. 总阿魏酸的测定；1. 阿魏酸; 2. 阿魏酸松柏酯2.2 对照品溶液制备及线性范围考察2.2.1 制备测定游离阿魏酸的对照品溶液 精密称取2.5 mg阿魏酸对照品，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇-甲酸（95 : 5）稀释至刻度，摇匀，制得浓度为100 mg.L-1 的对照品贮备液。分别精密吸取对照品贮备液100, 300, 500, 700, 900 mL, 1.2, 1.5, 2.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇-甲酸(

9、95 : 5)稀释至刻度，摇匀。2.2.2 制备测定总阿魏酸的对照品溶液 精密称取5.0 mg阿魏酸对照品，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇0.24 mol.L-1碳酸氢钠水溶液（95 : 5）稀释至刻度，摇匀，制得浓度为 500 mg.L-1 的对照品贮备液。分别精密吸取对照品贮备液100, 200, 300, 500, 700, 900 mL于10 mL量瓶中，加甲醇0.24 mol.L-1碳酸氢钠水溶液（95 : 5）稀释至刻度，摇匀。2.2.3 线性范围考察 依选定的色谱条件进样测定，以峰面积 (mAU.s)与对照品进样量(mg)进行线性回归，得测定游离阿魏酸和总阿魏酸的回归方程分别为Y

10、 = 5 542.2X 1.829 (r = 0.999 8，n = 8) 和Y = 5 588.7X - 9.999 (r = 0.999 6，n = 6)。结果表明，用甲醇-甲酸（95 : 5）和甲醇0.24 mol.L-1碳酸氢钠水溶液（95 : 5）分别配制的阿魏酸溶液，进样量在0.01 0.20 g和0.05 0.46 g范围内分别与其峰面积呈良好的线性关系。本研究中将测定游离阿魏酸和总阿魏酸的对照品溶液分别制备的目的是与供试液相对应，尽量减小分析误差。用这两种溶剂制备的对照品溶液，阿魏酸的保留时间一致，紫外光谱相同；将二者的进样量(mg)与峰面积(mAU.s)合并在一起计算，回归方

11、程为Y = 5 582.8X - 6.526 (r = 0.999 7，n = 14)，线性仍然良好。2.3 供试液的制备 取样品粉末（20目） 0.5 g, 精密称定，置60 mL具密封盖的棕色瓶中，精密加入甲醇-甲酸（95 : 5）25 mL, 密闭，称定重量；超声提取90 min后取出, 称重，补足失重；摇匀，静置；取上清液经0.20 m微孔滤膜过滤，即得游离阿魏酸的供试液。重复1次，制备1份平行供试液。以甲醇 0.24 mol.L-1碳酸氢钠水溶液（95 : 5）为溶剂， 同法制得总阿魏酸的供试液。2.4 精密度试验 以对照品溶液连续进样和样品粉末重复测定的结果分别评价仪器的重复性和分

12、析方法的重复性。取用甲醇-甲酸（95 : 5）和甲醇0.24 mol.L-1碳酸氢钠水溶液（95 : 5）配制的对照品溶液各1份，依选定的色谱条件连续进样6次，测定峰面积，其RSD分别为1.20%和1.12% (n = 6)。取1药材粉末，分别用上述两种溶剂制备6份供试液，测定游离阿魏酸和总阿魏酸的含量，其RSD分别为1.67%和0.85% (n = 6)。2.5 回收率试验 取已知阿魏酸含量的川芎药材粉末约0.25 g，各6份，精密称定。分别精密加入游离阿魏酸量(0.2mg)和总阿魏酸量(0.85mg)的对照品溶液,甲醇-甲酸（95 : 5）或甲醇0.24 mol.L-1碳酸氢钠水溶液（95

13、 : 5）溶液。按照供试液制备方法制成供试液，测定游离阿魏酸和总阿魏酸的含量。其平均回收率分别为95.7 3.85% ( RSD, n = 6)和98.5 1.64% (n = 6)。2.6 样品测定 每份样品粉末称取2份，按照供试液的制备方法制成供试液，各进样测定2次。根据回归方程计算样品中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量。33份川芎样品中游离阿魏酸和总阿魏酸的质量分数及其比值见表1。表1 不同来源的川芎样品中游离阿魏酸和总阿魏酸的质量分数 mg.g-1No.样品类型来 源游离阿魏酸1)总阿魏酸 1)总阿魏酸/游离阿魏酸1根茎四川都江堰0.409 1.543.762根茎四川都江堰0.472 1.5

14、13.203根茎四川都江堰0.351 1.584.504根茎四川都江堰0.379 1.704.495根茎四川都江堰0.679 1.241.826根茎四川彭州0.565 1.091.937根茎四川彭州0.410 1.794.388根茎四川彭州0.505 0.8981.789根茎四川彭州0.769 1.351.7610根茎四川彭州0.591 1.622.7311根茎四川彭州0.462 1.423.0712根茎四川崇州0.569 1.272.2313根茎四川崇州0.301 1.504.98 14根茎四川什邡0.522 1.132.17 15根茎四川苍溪0.491 1.623.31 16根茎云南0.5

15、31 1.452.73 17根茎陕西南郑0.394 0.5191.32 18根茎香港公司10.516 0.8141.58 19根茎香港公司20.442 0.6161.39 20根茎香港公司30.548 0.6581.20 21根茎香港公司40.267 0.2981.12 21小块(约1cm)四川都江堰0.289 0.3851.33 23小块(约1cm)四川汶县0.430 0.7451.73 24小块(约1cm)云南0.905 1.121.23 25小块(约1cm)云南0.912 1.201.31 26小块(约1cm)陕西0.542 0.8011.48 27小块(约1cm)福建0.742 1.1

16、11.49 28饮片四川都江堰0.338 1.343.96 29饮片四川彭州0.499 1.002.01 30饮片四川彭州0.258 1.094.21 31饮片香港公司50.219 0.2251.03 32饮片香港公司60.333 0.3521.06 33栽培用苓子四川茂县0.102 2.0019.6注: 1) 此数值 (, n = 2) 为测定计算值，未以干燥品计。3 讨论3.1 测定川芎药材和饮片中阿魏酸含量的方法由于阿魏酸与阿酸酸松柏酯(coniferyl ferulate，CF)共同存在于植物组织中，CF很容易水解成阿魏酸，其水解程度不同而影响供试液中阿魏酸的量15-16。因此，只有阻

17、止CF水解而测定供试液中的游离阿魏酸，或者促进CF完全水解而测定供试液中总阿魏酸的含量才能得到具有可比性的阿魏酸值。作者曾研究过不同溶剂（甲醇、甲醇-甲酸、甲醇-盐酸、甲醇-水、水、甲醇-碳酸氢钠水溶液、甲醇-氨水，乙腈）和不同提取方法（超声波常温下提取、超声波50 oC恒温提取、回流提取）对当归药材中阿魏酸含量的影响及其稳定性，用甲醇-甲酸（95 : 5）和甲醇-0.24 mol.L-1碳酸氢钠水溶液（95 : 5）为溶剂超声波提取，可分别提取药材中的游离阿魏酸和总阿魏酸，且结果稳定，具有可比性12-13。川芎与当归亲缘关系相近，化学成分相近。研究结果表明，这两种溶剂也适合于提取川芎药材和饮

18、片中的游离阿魏酸和总阿魏酸。因本研究中未获得CF对照品，CF的色谱峰根据在线HPLC-UV和MS数据与文献值比较而鉴定15-16。在200 400 nm的紫外光谱中，其吸收峰位于270 nm，299 nm (肩峰) 和318 nm (最大峰)。在APCI-MS负离子谱中可见其负分子离子峰355 m/z M-H- 和阿魏酸部分的负离子碎片峰193 m/z；在APCI-MS正离子谱中可见松柏醇(coniferyl alcohol) 部分的正离子碎片峰163 m/z。用甲醇-甲酸（95 : 5）和甲醇-0.24 mol.L-1碳酸氢钠水溶液（95 : 5）制备的阿魏酸对照品溶液和川芎样品经超声提取制

19、成的供试液在常温、常压下保存5 d，其间测定10次，阿魏酸的峰面积变化值小于2%，HPLC图无变化，说明阿魏酸在5 d内稳定。超声提取时间比较了45，60，75，90，105和120 min游离阿魏酸和总阿魏酸含量。结果表明，提取75 min以后的含量不再增加。考虑川芎样品之间的差异，选择提取时间为90 min。阿魏酸和CF的最大紫外吸收波长分别位于322 和318 nm，选择320 nm为检测波长以便在同一张HPLC图中同时观察阿魏酸和CF峰。此外，本方法中流动相采用梯度洗脱，以便在测定总阿魏酸的含量时，监测CF是否水解完全。3.2 川芎样品中游离阿魏酸和总阿魏酸的比较从表1中看出，总阿魏酸

20、的量大于游离阿魏酸的量。32份川芎药材和饮片中总阿魏酸与游离阿魏酸之比值为1.03 4.98，其均值为2.38 (n = 32)，而川芎的栽培苓子中二者之比值达19.6，说明阿魏酸在植物组织中以结合型存在为主。总体趋势是总阿魏酸含量越高，与游离阿魏酸之比值越大。由于中药饮片常用水煎煮，CF在水溶液中加热条件下全部水解成阿魏酸，以总阿魏酸的量发挥药效12-13。因此，川芎药材和饮片应以总阿魏酸为质量评价的指标。3.3 川芎药材中总阿魏酸含量的指标川芎是四川省的道地药材，主产于四川省都江堰市、彭州、崇州等地。从四川收集的15份根茎药材（表1，No. 1 15）中，总阿魏酸的平均质量分数为1.42

21、mg.g-1 (n = 15)。按平均值的80%和药材含水量10%计算，则总阿魏酸的含量以干燥品计为1.25 mg.g-1。由于从其他产区收集到的川芎样品数量少，代表性不强，以及受贮藏时间和加工方式的影响，不能归纳出总阿魏酸的含量与川芎药材产地之间的相关性。但是，研究过程中发现，按川芎性状鉴别质量好的药材，其总阿魏酸的含量高；含水量高，贮藏过程中变质、变味的药材，总阿魏酸的含量较低；贮藏时间长，总阿魏酸的含量降低；根茎药材加工后，总阿魏酸的含量也降低（表1，No. 21 32）。从香港6家公司收集的川芎药材和饮片中总阿魏酸的含量相对较低（表1，No. 18 21，31 32），可能与贮藏、加工

22、方式不同有关。致谢 四川大学华西药学院张浩教授，唐心曜教授和香港浸会大学中医药学院易涛博士提供部分实验样品。参考文献1 中国药典. 一部 M. 2005: 28.2 肖培根. 新编中药志. 第1卷 M. 北京: 化学工业出版社, 2002: 121.3 国家中医药管理局中华本草编委会. 中华本草. 第5卷 M. 上海: 上海科学技术出版社, 1999: 976, 893.4 林燕芝, 唐星, 毕开顺. RP-HPLC测定川芎挥发油中藁本内酯的含量J. 中国中药杂志, 2004, 29(2): 154.5 汪程远, 张浩, 钱忠明. HPLC测定不同川芎药材中藁本内酯J. 中草药, 2006,

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26、rformance liquid chromatography J. J Food Drug Anal, 2007, 15(4): 438.14 行政院卫生署中华药典编修小组. 中华中药典 M. 台北: 行政院卫生署. 2004: 94.15 Li S-L, Chan S S-K, Lin G, et al. Simultaneous analysis of seventeen chemical ingredients of Ligusticum chuanxiong by on-line high performance liquid chromatography-diode array d

27、etector-mass spectrometry J. Planta Med, 2003, 69: 445.16 Kobayashi M, Fujita M, Mitsuhashi H. Studies on the constituents of Umbelliferae plants. XV. Constituents of Cnidium officinale: Occurrence of pregnenolone, coniferylferulate and hydroxyphthalides J. Chem Pharm Bull, 1987, 35(4): 1427.Determi

28、nation of free ferulic acid and total ferulic acid in Chinese Chuanxiong by high-performance liquid chromatography for quality assessmentLU Guang-hua 1, 2, CHENG Shi-qiong 3, CHAN Kelvin 2, LEUNG Kelvin S.Y. 2, ZHAO Zhongzhen 2 (1. Key Laboratory of Ministry of Education in China on the Standardizat

29、ion of Chinese Materia Medica, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China;2. School of Chinese Medicine, Hong Kong Baptist University, Kowloon Tong, Hong Kong;3. Sichuan Provincial Institute for Food and Drug Control, Chengdu 610036, China)Abstract

30、Ferulic acid (FA) is one the main bioactive compounds in Chinese Chuanxiong (CX, Szechwan Lovage Rhizome), the dried rhizome of Ligusticum chuanxiong Hort., but its amount in this herb is not known. An accurate and rapid high-performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed to investigate on the available amount of FA i.e. free FA and total FA. Herbal samples were extracted in methanol-formic acid (95:5) and methanol-0.24 mol.L-1 sodium hydrogen carbonate in water (95:5), respectively and then quantitatively analyzed by HPLC method. Altogether 33