复方地芬诺酯建立大鼠便秘模型及对肠道菌群的影响

1、www.CRTER.org李根林，等. 复方地芬诺酯建立大鼠便秘模型及对肠道菌群的影响复方地芬诺酯建立大鼠便秘模型及对肠道菌群的影响李根林，张颜语，李寒冰(河南中医药大学，河南省郑州市 450046)引用本文：李根林，张颜语，李寒冰. 复方地芬诺酯建立大鼠便秘模型及对肠道菌群的影响J.中国组织工程研究，2016，20(49): 7404-7410.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.016 ORCID: 0000-0001-6943-2539(李寒冰)文章快速阅读：便秘大鼠肠道菌群严重紊乱李根林，男，1963年生，河南省郑州市人，汉族，硕士，教授，硕士生

2、导师，执业药师，执业医师，主要研究方向有中药抗衰老研究、中医药用于骨伤病的临床与实验研究等。通讯作者：李寒冰，博士，副教授，硕士生导师，执业药师，河南省新药审评专家，河南中医药大学，河南省郑州市 450046中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)49-07404-07稿件接受：2016-10-13复方地芬诺酯便秘模型结肠常规病理观察盲肠内容物细菌16S rDNA的V3区进行PCR-DGGE粪便中大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌变化，盲肠内容物检查体质量、粪便粒量、粪便含水量、肠道内容物所占百分比、肠道张力整体指标肠道菌群综合 分析便秘与肠道菌群变化之间的关联 文

3、题释义：便秘：是指排便困难或费力、排便不畅、便次太少、粪便干结且量少。主要原因有习惯性忽略排便感觉、排便肌软弱无力、肛门扩约肌痉挛、肠蠕动迟缓、肠痉挛、肠梗阻、缺少体力活动等。急性便秘常由于肠梗阻、肠麻痹、急性腹膜炎、脑卒中、急性心肌梗死、肛周疼痛性疾病等引起；慢性便秘常由于慢性机械性肠梗阻或肠蠕动功能失调所致，如肠肿瘤、肠粘连、肠易激综合征等。便秘患者可表现为每周排便少于3次，或虽然每日排便多次，但排便相当费力，每次排便所费时间相当长，排出粪便干结如羊粪且数量少，排便后仍有粪便未排尽的感觉。地芬诺酯：是哌替啶的衍生物，代替阿片制剂。对肠道作用类似吗啡，直接作用于肠平滑肌，通过抑制肠黏膜感受器

4、，消除局部黏膜的蠕动反射而减弱蠕动，同时可增加肠的节段性收缩，从而延长肠内容物与肠黏膜的接触，促进肠内水分的回吸收。摘要背景：既往研究中检测便秘模型的指标多为粪便粒数、肠道张力变化等整体指标，很少涉及肠道菌群的变化。目的：以复方地芬诺酯建立便秘大鼠模型探索便秘对大鼠肠道张力、病理及微生态等方面的影响。方法：20只SPF级Wistar大鼠随机分为空白组和模型组，分别连续20 d灌胃10 mg/kg的复方地芬诺酯和蒸馏水。结果与结论：与空白组相比，给药20 d，模型组大鼠回肠收缩频率降低，24 h排便量减少，盲肠内容物中细菌种群结构存在变化，结肠结构严重破坏。结果表明，便秘大鼠肠道菌群严重紊乱。关

5、键词：实验动物；消化系统损伤与修复动物模型；肠道菌群紊乱；便秘大鼠；复方地芬诺酯；肠道张力；大肠杆菌；双歧杆菌；乳酸杆菌；国家自然科学基金主题词：便秘；地芬诺酯；肠杆菌科；组织工程基金资助：国家自然基金面上项目(81473435)；河南省高等学校青年骨干教师资助计划(2013GGJS-092)；河南中医药大学研究生苗圃计划(MP2015-89)7405 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Effect of constipation induced by diphenoxylate on intestinal flora in a ratLi Gen-

6、lin, Zhang Yan-yu, Li Han-bing (Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China)AbstractBACKGROUND: In the previous studies, the overall index in constipation models, such as fecal output in 24 hours and intestinal tension are usually measured. However, the changes of i

7、ntestinal flora are rarely involved. OBJECTIVE: To explore the effect of constipation on intestinal tension, pathology and microecology in the rat models of diphenoxylate-induced constipation. METHODS: Twenty SPF Wistar rats were randomly divided into blank control and model groups, followed by give

8、n 10 mg/kg diphenoxylate and distilled water by gavage once daily for 20 days, respectively. RESULTS AND CONCLUSION: Twenty days later, compared with the blank control group, the frequency of ileum contraction was decreased, 24-hour stool decreased, the ratio of bacteria group in the cecum changed,

9、and structure of the colon was seriously damaged in the model group. These results suggest that constipation results in the intestinal flora disturbance remarkablely.Subject headings: Constipation; Diphenoxylate; Enterobacteriaceae; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation

10、of China, No. 81473435; the Fund for the Young Talent Teacher in High Educations of Henan Province, No. 2013GGJS-092; the Nursery Plan for the Postgraduate of Henan University of Chinese Medicine, No. MP2015-89Cite this article: Li GL, Zhang YY, Li HB. Effect of constipation induced by diphenoxylate

11、 on intestinal flora in a rat. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(49):7404-7410.Li Gen-lin, Master, Professor, Masters supervisor, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, ChinaCorresponding author: Li Han-bing, M.D., Associate professor, Masters supervisor, Hena

12、n University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China7409ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction便秘是一种临床常见疾病，成因繁多，治疗效果不佳。目前常采用由盐酸地芬诺酯和硫酸阿托品组成的临床常用缓泻药复方地芬诺酯建立便秘的动物模型，该方法具有造模简单、方法可靠、重复性高等优点，谢培等1复制的便秘模型周期长达45 d，亦有周期短、剂量大，而有动物死亡现象，在指标测定上多集中于粪便粒数、肠道张力变化等整体指标1-2，很少涉及肠

13、道菌群的变化。目前，已知肠道菌群的失衡与许多疾病的发生、发展有着密不可分的关系，如肠易激综合征、抑郁症、肥胖等3-5。也有报道称人群中不同原因形成的便秘会对肠道菌群产生复杂的影响，同时肠道菌群结构的紊乱又会影响便秘的发展6-7。为了深入了解复方地芬诺酯造便秘模型的特点并探索造模后肠道菌群的变化特征，作者对复方地芬诺酯造便秘模型大鼠进行研究，在测定24 h粪便粒数、肠道张力等指标的基础上，结合新鲜粪便的细菌传统培养及盲肠内容物革兰氏染色来初步表征肠道菌群的杆球菌变化，并利用聚合酶链式反应-变性凝胶梯度电泳对肠道菌基因组保守区域亦被认为是“分子钟”的16S rDNA进行基因片段扩增分析8，以期完善

14、复方地芬诺酯的造模方法并为该便秘模型与肠道菌群变化之间的关联提供参考和依据。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 实验于2015年3至5月在河南中医药大学科研处科研实验中心完成。1.3 材料实验动物：SPF级Wistar大鼠20只，鼠龄7周，雌雄各半，体质量(180±20) g，购于山东省鲁抗医药股份公司，许可证号：SCXK鲁20130001；适应性饲养于河南中医药大学科研处科研实验中心SPF级动物房5 d。整个实验过程中，动物自由饮水和取食。主要试剂及仪器：复方地芬诺酯片(含盐酸地芬诺酯2.5 mg，硫酸阿托

15、品0.025 mg，产品批号1406005)，购自常州康普药业有限公司；四甲基乙二胺购自北京索莱宝科技有限公司，货号816B026；双歧杆菌琼脂培养基(产品编号HB0396-1)和乳酸杆菌选择性培养基(产品编号HB0385-1)均购于青岛高科园海博生物技术有限公司；蛋白胨(产品编号01-001)和琼脂粉(产品编号01-023)均购于北京奥博星生物技术有限责任公司；革兰氏染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，产品批号20151209，粪便基因组DNA快速提取试剂盒购自艾德莱，货号DN23；Multiplex PCR Assay Kit Ver.2购自TaKaRa，货号RR062A；高压灭菌锅LD

16、ZX-30KB购自上海申安医疗器械厂；PHS-100生化培养箱购自中科生命科技股份有限公司；SW-CJ 超净工作台购自苏州苏洁净化设备有限公司；IS-6800培清全自动凝胶成像系统购自上海培清有限科技公司；多功能 PCR仪购自赛默飞公司；琼脂凝胶电泳仪、Dcode DGGE电泳仪均购自美国伯乐公司；全自动脱水机、石蜡包埋机及全自动切片机购自LEICA公司；全自动显微镜购自OLYMPUS公司；BL-420F生物机能实验系统购自成都泰盟软件有限公司；超纯水仪购自上海茸研仪器。1.4 方法1.4.1 便秘模型的制备 20只Wistar大鼠随机分为空白组和模型组，各10只，每天上午9：00称体质量。模

17、型组每天灌胃复方地芬诺酯10 mg/kg，连续20 d；空白组给予相同体积的蒸馏水。1.4.2 常规指标的测定 实验过程中，每天称取大鼠体质量，并计算大鼠体质量的日变化量；体质量日变化量=第N天体质量-第(N-1)天体质量。在实验给药过程中，分别收集每只大鼠第0，7，14，20天的24 h粪便量。给药20 d后，摘眼球取血后，直接处死大鼠，立即取大鼠胃喷门至直肠末端肠道，各截取一段1 cm左右长度的十二指肠和回肠，采用BL-420F生物机能实验系统测量肠道张力。剩余肠道称质量记为肠道总质量，纵向切开用PBS清洗干净肠壁，滤纸吸干水分后，再次称取肠道净质量，二者差值为肠道内容物总质量，计算肠道内

18、容物百分比。内容物百分比=(肠道总质量-肠道净质量)/肠道总质量×100%1.4.3 肠道菌群指标测定新鲜粪便细菌计数：分别于给药后1，6，11，16，20 d，将大鼠置于干净无菌的代谢笼内，收集大鼠的新鲜粪便约0.1 g，于无菌无酶的试管中，进行10倍梯度稀释，筛选出1×10-7稀释倍数的菌液，分别接种到大肠杆菌培养基、双歧杆菌琼脂培养基、乳酸杆菌培养基，37 恒温培养，其中大肠杆菌培养24 h，双歧杆菌、乳酸杆菌在自制厌氧罐内培养48 h后，进行计数9。肠道菌群比例变化及种类分析：革兰氏染色法测盲肠内容物菌群比例变化10，并用粪便细菌基因提取试剂盒提取盲肠内容物细菌总D

19、NA，以16S rRNA基因可变区V3区为靶标11，进行PCR扩增，上游引物序列为357F：5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G CCT ACG GGA GGC AGC AG-3'，下游引物序列为518r：5-ATT ACC GCG GCT GCTGG-3'(下划线部分为40个GC碱基对，作为GC夹，为扩增产物制造高温解链区)，扩增体系为：2×Multiplex PCR Buffer(25 L)，模版DNA(1 L)、引物(10 mol/L，各1 L)、灭菌超纯水补足50 L。PCR反

20、应在Thermo PCR仪上进行。扩增条件为：94 预变性3 min；95 变性30 s；55 退火30 s；72 延伸20 s；72 延伸7 min，并进行30个循环，终止于4 。PCR扩增产物使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测(110 V， 20 min)。扩增产物进行变性凝胶梯度电泳以分析肠道菌群种类变化，全自动凝胶成像系统观察。1.4.4 病理观察 给药20 d后，立即迅速取大鼠近端结肠2 cm，剔除管壁周围的脂肪组织，PBS洗，中性甲醛固定，苏木精-伊红染色12，100倍的视野内使用Image pro-Plus6.0图像分析系统对隐窝深度进行测量定量分析。并采用结肠病理组织学指数评分标准对

21、结肠病理切片进行评价13。结肠病理组织学指数=炎症细胞浸润程度评分+杯状细胞损坏评分情况+病变深度评分。其中评价标准见表1：表1 结肠病理组织学指数评分标准Table 1 Scoring criteria of the histopathological index of colon炎症细胞浸润程度杯状细胞损坏情况病变深度得分无单核细胞浸润无损坏无0 固有层局部或多个位点有巨噬细胞、中性粒细胞浸润局部丢失仅限于黏膜层1 炎性浸润在固有层呈连续分布，并蔓延至黏膜下层多个位点丢失，但仍有正常上皮黏膜层、黏膜下层2固有层、黏膜下层均有明显浸润，并在黏膜下层呈连续分布大量消失波及肌层3 全层均有单核细

22、胞、中性粒细胞、淋巴细胞严重透壁浸润全被损坏全层4 1.5 主要观察指标 常规指标测定：测定大鼠体质量及其体质量日变化量、十二指肠及回肠肠道张力变化、肠道中内容物所占整个肠道质量的百分比变化、大鼠24 h排便量；肠道菌群相关指标：采用传统平板计数法测定粪便中大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌变化、采用革兰氏染色法以及聚合酶链式反应-变性凝胶梯度电泳法检测大鼠盲肠内容物中菌群的变化；采用苏木精-伊红染色检测大鼠结肠病理变化。1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析处理，采用非参检验方法对结肠病理组织学指数评分结果进行比较，其余数据采用独立样本t 检验进行比较。P < 0.

23、05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。2 结果 Results2.1 实验动物数量分析 所有大鼠均进入结果分析，无脱失。2.2 体质量及日变化量 与空白组相比，模型组大鼠体质量及日变化量略有升高，但差异无显著性意义(t0.05=0.344，P > 0.05；t0.05=1.178，P > 0.05；图1)。2.3 十二指肠及回肠肠道张力 与空白组相比，造模结束时，模型组大鼠十二指肠肠道张力差异无显著性意义(P > 0.05；图2 A，B，表2)；而回肠肠道频率显著降低(t0.05=5.27，P < 0.01；图2C，D，表2)，表明造模便

24、秘大鼠在小肠部位并未出现严重的病理表现，而回肠蠕动的频率降低，可能会导致食物在肠道内滞留。表2 便秘对大鼠肠道张力相关指标的影响 (±s，n=10)Table 2 Effect of constipation on the intestinal tension of rats表注：与空白组相比，aP < 0.05。项目空白组模型组十二指肠张力频率(n/min)26.20±3.6827.67±4.69最大值(g)0.24±0.220.19±0.13最小值(g)-0.24±0.22-0.15±0.09平均值(g)-0.00

25、±0.01-0.00±0.01峰峰值(g)0.47±0.440.34±0.22面积(g×s)1.45±1.551.19±0.48回肠张力频率(n/min)32.06±8.4522.98±4.37a最大值(g)1.63±0.981.62±1.10最小值(g)-1.48±0.71-1.46±1.06平均值(g)-0.02±0.01-0.03±0.02峰峰值(g)3.12±1.693.18±2.21面积(g×s)9.32&

26、#177;6.049.48±5.882.4 肠道内容物百分比 给药20 d后，与空白组相比，模型组大鼠肠道内容物百分比有所增加，但差异无显著性意义(t0.05=1.29，P > 0.05；图3)。2.5 肠道菌群2.5.1 24 h粪便量以及新鲜粪便细菌计数结果 与空白组相比，给药14，20 d后，模型组大鼠24 h排便量明显减少(t0.05=2.203，P < 0.05；t0.05=5.428，P < 0.01；图4A)；给药6 d后，模型组肠道内大肠杆菌、双歧杆菌及乳酸杆菌含量无明显变化(t0.05=0.118，P > 0.05；t0.05=0.417，P

27、 > 0.05；t0.05=1.492，P > 0.05)，给药20 d后，模型组大鼠的新鲜粪便中大肠杆菌略有增多，但差异仍无显著性意义(t0.05=0.647，P > 0.05，图4B)，而双歧杆菌增多(t0.05=3.159，P < 0.05；图4C)，乳酸杆菌含量显著降低(t0.05=7.149，P < 0.01；图4D)。2.5.2 盲肠内容物 采用革兰氏染色方法检测大鼠盲肠内容物中细菌变化。与空白组相比，在给药20 d后，模型便秘大鼠盲肠内革兰阳性/阴性细菌数量降低(t0.05=1.921，P < 0.05)，且杆菌/球菌比值下降(t0.05=2.

28、030，P < 0.05；图5，表3)，表明盲肠内菌群结构发生紊乱。表3 便秘对大鼠盲肠内容物中菌类比例的影响(±s，n=10)Table 3 Effect of constipation on the ratio of different bacteria species in the cecal contents of rats项目空白组模型组革兰阳性菌(%)杆菌22.03±6.9014.35±4.67球菌24.52±6.426.43±11.37革兰阴性菌(%)杆菌26.26±6.820.13±9.38球菌27.2

29、0±9.6639.08±10.96b革兰阳性菌/革兰阴性菌0.97±0.450.75±0.11a杆菌/球菌1.24±0.420.71±0.53a表注：与空白组相比，aP < 0.05，bP < 0.01。2.5.3 盲肠内容物细菌变化 与空白组相比，模型组便秘大鼠盲肠内容物中细菌种群结构存在变化，便秘大鼠盲肠内细菌总量明显减少，部分菌属增多，同时又有某些种属的菌群丢失或者是菌群丰度至检测到的最低限度(图6)。2.6 结肠病理变化 与空白组相比，模型组大鼠结肠隐窝深度变浅(t0.05=6.185，P < 0.01)，结

30、肠结构损伤严重，杯状细胞大面积缺失，炎性浸润在固有层呈连续分布，并蔓延至黏膜下层，结肠病理组织学指数明显上升(P < 0.01；图7，表4)。表4 便秘对大鼠结肠结构的影响 (±s，n=10)Table 4 Effect of constipation on the structure of colon in rats组别隐窝深度(m)结肠病理组织学指数空白组68.50±13.150.95±0.89模型组39.55±8.72a10.30±2.87a表注：与空白组相比，aP < 0.01。3 讨论 Discussion复方地芬诺酯中所

31、含的盐酸地芬诺酯口服吸收后，能够抑制肠道蠕动，使肠道分泌物减少，为临床常用抗腹泻药。谢培等1研究表明30 mg/kg高剂量给予复方地芬诺酯，造模周期短，但死亡率高，而8 mg/kg低剂量体质量日变化量(g)BA40036032028024020020151050-5-10-15图1 便秘对大鼠体质量及体质量日变化量的影响Figure 1 Effects of constipation on the body weight and daily cumulative change in body weight of rats in each group图注：图中A为体质量；B为体质量日变化量。空白

32、组与模型组大鼠体质量及日变化量接近。空白组模型组空白组模型组体质量(g)1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 201 4 8 12 16 20CDAB给药后时间(d)给药后时间(d)0.150.100-0.10-0.15-50.100.050-0.05-0.10-0.10-0.1-0.2-0.3-0.5-0.6-0.20-0.2-0.4-0.6频率：20次/min 最大值：0.77 g 最小值：-0.73 g 平均值：0.05 g频率：33次/min 最大值：0.66 g 最小值：-0.69 g 平均值：

33、0.01 g频率：32次/min 最大值：0.17 g 最小值：-0.15 g 平均值：0.01 g频率：32次/min 最大值：0.17 g 最小值：-0.17 g 平均值：0.00 g图2 便秘对大鼠十二指肠及回肠肠道张力的影响Figure 2 Effects of constipation on the intestinal tension in the duodenum and ileum of rats in each group图注：图中A，B为空白组和模型组大鼠十二指肠的肠道张力情况；C，D为空白组和模型组大鼠回肠的肠道张力情况。模型组大鼠回肠蠕动的频率降低。模型组空白组肠道内容

34、物所占百分比(%)图3 便秘对大鼠肠道内容物百分比的影响Figure 3 Effect of constipation on the percentage of intestinal contents of rats in each group图注：两组大鼠肠道内容物百分比接近。空白组模型组18017016015014013012020017515012510075501612840-4大鼠24 h排便量(g)乳酸杆菌菌落数(n)大肠杆菌菌落数(n)100806040200双歧杆菌菌落数(n)空白组模型组1 6 11 16 201 6 11 16 200 7 14 201 6 11 16 20

35、空白组模型组给药后时间(d)给药后时间(d)给药后时间(d)给药后时间(d)图4 便秘对大鼠24 h粪便量及粪便中大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌含量的影响Figure 4 Effects of constipation on the 24-hour volume of defecation, contents of E. coli, bacillus coli and Lactobacillus in feces of rats图注：图中A为24 h粪便量，B-D分别为0.1 g粪便培养获得的大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌菌落数。与空白组相比，aP < 0.05，bP < 0.01。图

36、5 便秘对大鼠盲肠内容物的影响(革兰氏染色，×1 000)Figure 5 Effect of constipation on the contents of the cecum in rats (Gram staining, x1 000)图注：图中A为空白组；B为模型组。在给药20 d后，与空白组相比，模型组大鼠盲肠内革兰阳性/阴性细菌数量降低，且杆菌/球菌比值下降。AB6050403020100ADCBbba空白组模型组M M MCBABA图6 盲肠内容物细菌16S rDNA V3区聚合酶链式反应-变性凝胶梯度电泳电泳结果Figure 6 PCR-denaturing grad

37、ient gel electrophoresis results of the V3 region of 16S rDNA gene in the cecum图注：图中A为细菌总DNA琼脂糖凝胶电泳结果；B为细菌总DNA的16S V3区PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；C为PCR扩增产物的梯度变性凝胶电泳结果。M：maker；：空白组；：模型组。图7 便秘对大鼠结肠结构的影响(苏木精-伊红染色，×100)Figure 7 Effect of constipation on the structure of colon in rats (hematoxylin-eosin stain

38、ing, x100)图注：图中A为空白组；B为模型组。与空白组相比，模型组大鼠结肠隐窝深度变浅，结肠结构损伤严重。则是造模周期长，无死亡率。作者对便秘大鼠形成过程中常规基础指标进行测定，结果显示复方地芬诺酯给药处理过程中，便秘大鼠体质量、体质量日变化量增加，十二指肠的肠道张力无显著差异，回肠肠道张力收缩频率明显降低，肠道内容物百分比明显增加，24 h粪便量减少，这些常规基础实验指标结果均符合便秘模型表现14，且造模过程中无大鼠死亡发生，因此作者采用10 mg/kg的复方地芬诺酯灌胃给药复制便秘大鼠模型稳定、快速、无死亡率。便秘是现代临床发病率非常高的胃肠道功能性疾病，现代研究表明，除始动发病因

39、素外，肠道菌群紊乱也与便秘的发生、发展有着密不可分的关联。在人体肠道中定植约1×1014个微生物，生理状态下这些细菌与机体胃肠道构成人类胃肠道微生态系统15，在成人肠道中细菌质量约1.5 kg，编码约300万个基因，是人类基因组编码基因数的150多倍，亦被称作是人体的“第二基因组”16。肠道菌群的转化产物、代谢合成产物、细胞成分等对宿主的生理功能的正常发挥起着非常重要的作用，肠道菌群因此也被称为“人体器官”17。根据肠道微生物对机体的作用，可以将肠道菌群分为三大类：生理性菌群，定植于深层黏膜上皮细胞表面，如类杆菌、双歧杆菌等专性厌氧菌，属于肠道菌群中的优势菌群，能够为宿主提供所需营养

40、，调节宿主免疫；条件致病菌，如肠球菌、肠杆菌等，以兼性需氧菌为主，属于非优势菌群，仅当机体处于某些特定条件下对宿主有害，具有致病性；病原菌；大多为变形杆菌、假单胞菌等过路菌，微生态平衡时，过路菌长期定植的机会少、繁殖数量少，不会致病，但当肠道内外环境剧烈改变时，可导致人体发病18。因此，同时作者针对便秘大鼠粪便中以大肠杆菌为代表的条件致病菌，以双歧杆菌、乳酸杆菌为代表的益生菌的动态变化进行研究。在实验前期(腹泻期)，便秘大鼠的新鲜粪便大肠杆菌(革兰阴性杆菌)、双歧杆菌和乳酸杆菌明显减少，说明在便秘发生前期，菌群结构就已经发生紊乱；在给药20 d后，大肠杆菌和双歧杆菌有增多趋势，乳酸杆菌则是持续

41、显著降低，说明便秘会加重肠道菌群结构的紊乱。实验后期的大鼠盲肠内革兰阳性/阴性细菌、杆球菌比例明显降低等情况一致表明便秘大鼠肠道菌群结构发生严重的紊乱。这也与Zoppi等19采用传统培养方法研究便秘的婴儿肠道菌群结构，得出便秘儿童粪便中梭菌属、双歧杆菌属较健康儿童显著升高的结论相一致。聚合酶链式反应-变性凝胶梯度电泳技术可以有效的随着变性剂浓度以及核算分子空间结构的差异来精确的分离大小相同或相近的核酸片段，特别适宜于分析样品中优势菌属的动态变化情况。作者采用聚合酶链式反 应-变性凝胶梯度电泳方法检测盲肠内菌群16S rDNA的V3可变区变化情况，来全面的了解盲肠内优势菌群的变化情况。16S r

42、DNA其分子内存在的可变区，可以显示出细菌属及属以上水平的特异性，适用于确定细菌的种属及亲缘关系8。聚合酶链式反应-变性凝胶梯度电泳结果显示，便秘大鼠盲肠内细菌总量明显减少，部分菌属增多，同时又有某些种属的菌群丢失或者是菌群丰度减少至检测到的最低限度。但是Zhu等18运用新一代高通量焦磷酸测序法研究便秘儿童的粪便微生物组成，结果表明，与健康儿童相比，便秘儿童粪便中粪球菌属、瘤胃球菌属显著增加，而普雷沃氏菌属则显著下降。这与聚合酶链式反应-变性凝胶梯度电泳结果趋势相同，推测实验中条带缺失的可能与普雷沃氏菌属有关，而对于便秘大鼠条带亮度增强的部位，推测与粪球菌属、瘤胃球菌属相关。另外，近端结肠病理

43、结果显示，便秘大鼠结肠隐窝深度减小，有大量的炎症反应，杯状细胞丢失。有研究表明肠道隐窝可以保护肠道干细胞，保证受损肠道细胞20；而杯状细胞分泌黏蛋白，构成黏液屏障，为宿主体内共生菌提供定植场所，防止致病微生物的定植，且分泌的粘液能够润滑肠道、促进食物排空。近端结肠中杯状细胞大量丢失，与便秘的发生有着密切的关系。有研究表明益生菌可以增强溃疡性结肠炎小鼠肠道上皮屏障功能并促进肠道生长，从而减轻结肠损伤的严重程度21，推测这应与粪便中乳酸杆菌显著减少有着密切的关系。越来越多的现代研究以及临床应用表明，肠道菌群参与诸疾病的发展。实验灌胃给予的复方地芬诺酯通过影响大鼠肠道功能以及肠道菌群的变化，而导致便

44、秘；便秘则在后期加重了肠道功能的损伤以及菌群结构紊乱。该研究结果对于探究便秘与肠道菌群紊乱二者之间的作用机制提供了理论和实验依据，也为指导临床合理治疗便秘提供了强有力的证据。作者贡献：李寒冰进行实验设计，实验实施，资料收集为张颜语，李根林审校。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验方案经河南中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号为：DWLL201402037。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始

45、图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 谢培,周永学.大鼠功能性便秘模型建立方法的研究J.陕西中医,2014,35(3):377-379.2 赵兵,唐学贵,吴至久,等.复方地芬诺酯建立便秘模型与AQP8的相关性研究J.中医临床研究,2015(18): 107-110.3 Jeffery IB, O'Toole PW, Öhman L, et al. An irritable bowel syndrome subtype defined

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