发酵工程复习

1、1. 发酵工程概念：发酵工程 是生物技术的重要组成和基础，是生物技术产业化的重要环节。它将微生物学、生物化学和化学工程的基本原理有机结合起来，广泛而深入地揭示了发酵过程的本质。狭义的发酵概念：微生物培养和代谢过程。广义的概念：生物学( ( 微生物学、生物化学) ) 和工程学( ( 化学工程) ) 结合。2. 发酵工程的应用： 在食品工业中的应用：食品加工、发酵乳制品、调味品 、食品添加剂、检验 在医药卫生中的应用 ：抗生素、 氨基酸、维生素、甾体激素、生物制品、治疗用酶 在轻工业中的应用：各类酶（糖酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶等、酶抑制剂）在化工能源中的应用：醇及溶剂，有机酸，多糖，清洁能源在农

2、业中的应用：生物农药，生物除草剂、增产剂，食用菌在环境保护中的作用 在细菌冶金中的应用 在高技术研究中的应用 3. 微生物代谢产物类型：包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。4. 发酵方法的类别：根据对氧的需要区分：厌氧和有氧发酵 根据培养基物理性状区分：液体和固体发酵 根据从微生物生长特性区分：分批发酵和连续发酵、补料分批发酵 按发酵原料来区分：糖类物质发酵、石油发酵、废水发酵5. 发酵生产的条件： 某种适宜的微生物 保证或控制微生物进行代谢的各种条件 进行微生物发酵的设备 提取菌体或代谢产物并精制成产品的方法和设备6. 组成典型的发酵过程可以划分成六个基本组成部分： （1

3、）繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定； （2 ）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；  （3）培养出有活性、适量的纯种，接种入生产的容器中； （4 ）微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长； （5）产物萃取和精制；  （6）过程中排出的废弃物的处理。7. 决定微生物工程工业生产水平的三个要素：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。8. 工业微生物菌种的基本要求： 1. 菌种生长繁殖能力强，能够在较短的发酵周期内产生大量有价值的发酵产物，因为高产菌株的运用可以在不增加投资的情况下大幅度提高生产能力。 2. 菌种的发酵培养基应该

4、价格低廉、来源充足、被转化为产品的效率高。3. 菌种发酵后，非目标代谢产物少，而且产品应相对容易分离。4. 菌种的培养条件易于控制，并具有抗噬菌体感染的能力。 5. 菌种的遗传特性稳定，不易变异和退化，这样才能保证发酵过程长期、稳定地进行，同时有利于实施最佳的工艺控制，保证发酵生产和产品质量的稳定性。 6. 菌种对人、动物、植物和环境不应该造成危害，还应注意潜在的、慢性的、长期的危害，要充分评估，严格防范。9. 一般菌种分离纯化和筛选步骤：标本采集 标本材料预处理 富集培养 性能鉴定 菌种复筛 菌种初筛 菌种保藏10. 富集方法 定向培养:底物 pH条件、培养时间 、培养温度、C源、N源 .抗

5、生素等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。11. 高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定，12. 施加选择性压力分离法：主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和

6、非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。13. 生长因子产生菌的分离：筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌生长。13. 放线菌产生多种抗生素（ 多种抗生素（12 000余种， 余种，60%左右来自放线菌），经济 左右来自放线菌），经济价值大。14. 育种方法 基因突变： 自然选育、诱变育种 基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程 基因的直接进化：定点突变、易错PCR、同序法、 DNA Shuffling

7、等 15. 回复突变： 高产菌株在传代的过程中 ， 由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降 ， 这种情况我们称为回复突变.16. 自然选育操作步骤：单细胞( 孢子) )悬液的制备 平板分离 挑选单菌落( 注意形态的观察) 发酵试验17. 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选 ， 称为诱变育种。18. 诱变育种步骤：出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选 中间培养：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。19. 筛选营养缺陷型的步骤：诱变 淘汰野生型检出缺陷型 确定生长谱 淘汰野生型方法 抗生素法：

8、野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。检出缺陷型方法：影印法、点种法、夹层法20. 微生物杂交育种一般程序：选择原始亲本直接亲本之间亲和力鉴定杂交分离到基本培养基或选择培养基培养筛选重组体重组体分析鉴定21. 常规杂交育种：原核微生物 ：接合 转化 转导 真核微生物：有性生殖 准性生殖22. 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离

9、剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。 原生质体融合育种步骤：1. 标记菌株的筛选和稳定性验证。 2原生质体制备。3等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 4涂布于再生培养基，再生出菌落。5选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。6 生产性能筛选。23 . 基因定点突变是指按照设计的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换和重排等变异。24. 酶分子定向进化是模拟自然进化过程(随机变异和自然选择)，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。25. 易错PCR

10、技术(error-prone PCR)是从酶的单一基因出发，在改变反应条件下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。第四章1. 菌种保藏原理：主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于 “休眠”状态 ，抑制其繁殖能力。2. 菌种保藏方法：斜面保藏法、穿刺保藏法、沙土管干燥保藏法、 真空冷冻干燥保藏法、 液氮保藏法、 悬液保藏法、低温保藏法(普通冷冻)、超低温冷冻保藏技术(-60-80)3. 悬液保藏法（寡营养保藏）：将微生物悬浮在不含

11、养分的溶液中，如蒸馏水、生理盐水中保藏。适用于丝状真菌、酵母状真菌及肠道科细菌。第五章1. 微生物的代谢类型：分解代谢和合成代谢。2. 酶活性的调节机制：共价修饰、别构效应、缔合与解离、竞争性抑制。 共价修饰：指蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开，使其活性改变的作用。共价修饰分可逆和不可逆两种 别构效应：是指一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的相互作用，导致这种蛋白质的构象发生改变，从而改变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。3. 酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节。4. 凡

12、是能促进酶合成的调节称为诱导；而能阻碍酶合成的调节称为阻遏。5. 诱导剂可以是诱导酶的底物，也可是底物的结构类似物. ü诱导剂也可以不是该酶的作用底物 ü酶的作用底物不一定有诱导作用6. 末端产物阻遏:指由某代谢途径末端产物过量积累而引起的阻遏。末端产物阻遏在代谢调节中有重要作用，保证细胞内各种物质维持适当的浓度. 分解代谢物阻遏:当培养基中同时存在有多种可供利用的底物时，某些酶的合成往往被容易利用的底物所阻遏，这就是分解代谢阻遏。 阻遏作用并非快速利用的碳源（或氮源）本身作用的结果；而是其分解代谢过程中所产生的中间代谢物引起；7. 效应物（诱导物、辅阻遏物）：指一类低分子

13、质量的信号物质（如糖类及其衍生物、氨基酸、核苷酸等）。8. 分支生物合成途径的调节：同工酶调节、协同反馈调节、累加反馈调节、增效反馈调节、顺序反馈调节、 联合激活或抑制调节、 酶的共价修饰9. 能荷调节： 指细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动，也称腺苷酸调节。10. 代谢调控 发酵条件的控制：发酵条件、使用诱导物、 添加生物合成的前体、培养基成份和浓度的控制 改变细胞透性 菌种遗传特性的改变：营养缺陷型的利用（利用营养缺陷型积累分支代谢途径中的中间产物或末端产物、从营养缺陷型的回复突变株也能获得抗反馈的突变菌株） 抗反馈调节突变株的利用（在工业上，生产氨基酸、嘌呤、嘧啶

14、和维生素的生产菌种大都是抗反馈突变株。）11.次级代谢调节方式：诱导调节、碳分解产物调节、氮分解产物调节、磷酸盐调节12.代谢工程的目：在于构建具有新的代谢途径，能生产特定目的产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。代谢工程的应用：改变代谢途径、扩展代谢途径、转移或构建新的代谢途径14. 微生物代谢调节的方式方式：反馈抑制、反馈阻遏、酶的诱导调节、 酶的共价修饰。第六章1. 培养基主要成分：能源，碳源，氮源，无机盐和微量元素，前体，促进剂和抑制剂，水2. 常见的碳源：糖类、脂类、有机酸、低碳醇等3. 有机酸积累，会引起pH的下降，并影响微生物酶系统的作用。有机酸的利用会使pH上

15、升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴随着碱性物质的产生，使pH进一步上升。4. 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫 生理酸性物质 ，如 硫酸铵， 若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为 生理碱性物质 ，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。 5. 前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。6. 促进剂：促进剂不是前体或营养物，可影响正常代谢，或促进中间代谢产物

16、的积累，或提高次级代谢产物的产量。7. 抑制剂：抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。8. 培养基的类型按培养基成分：天然培养基，合成培养基，无血清培养基按用途分：孢子培养基（供菌种繁殖孢子）、 种子培养基（供孢子发芽、生长和菌体繁殖）、发酵培养基（供菌体生长、繁殖和合成大量代谢产物）9. 预处理原因：是因为原料在收获贮藏和运输中会混入各种夹杂物，使原料出品率降低，影响后面工序的进行，如粉碎时会磨损机械等。10. 固体物料的筛选除杂设备：大麦粗选机，磁力除铁器，永磁滚筒11. 粉碎机的几种类型：锤式粉碎机、辊式粉碎机、微细超微细粉碎，12. 蒸煮目的 ：破

17、坏淀粉颗粒的外皮，使其内容物流出，呈溶解状态变成可溶性淀粉，便于糖化剂作用。灭菌。13. 糊化:指淀粉与水共热后，在一定条件下变成半透明状胶体的现象。 糖化：指淀粉加水分解成甜品的过程。14. 汽液分离器作用：维持蒸煮温度达到要求时间，使糊化 维持蒸煮温度达到要求时间，使糊化醪煮透。第七章1. 培养基灭菌：是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。2. 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。3. 培养基灭菌的要求：达到要求的无菌程度 尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程

18、中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。4.湿热灭菌原理：用高温蒸汽将物料温度升高使微生物体内蛋白质变性而进行灭菌。4. 微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热方式)下的致死时间。 相对热阻：是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。5. 致死温度(Deathtemperature)：杀死微生物的极限温度6. 致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间。 致死时间(Death Time)；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物类型7. 某些微

19、生物对湿热的相对热阻（与大肠杆菌比较相对热阻 细菌和酵母的营养细胞 1 细菌孢子 3×10 6 霉菌孢子 2-10 病毒及噬菌体 1-5 衡量灭菌是否彻底，一般以能否杀死细菌孢子为标准，因为它的相对热阻最大。（相对热阻越高，越难杀死）8. 对数残留定律：对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物活菌数量成正比。- dN/dt= KN t= 2.303/K·lgN 0 /N可见灭菌时间取决于污染程度(N 0 )、灭菌程度（残留菌数N）和K值灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即N = 0，则t 为，上式无意义，事实上也不可能。一般取N = 0

20、.001，即1000次灭菌中有1次失败。9 培养基灭菌温度的选择 培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸、维生素等受破坏。ü培养基灭菌时，必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。 灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型（从对数残留定律表达式可知）。 在其它条件不变时，比死亡速率 K 与温度的关系可用阿仑尼乌斯方程式表示。9. 影响培养基灭菌的因素：（1）微生物种类：不同的微生物k值不同。 （2）初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与初始菌量N0的对数成正比。 （3）培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。 (4)传热

21、与混合状况：影响受热均匀度。 (5)培养基物理状态 (6)空气排除情况 (7)pH：酸性pH下可加快微生物热死速率10. 分批培养：是指将细胞和培养基一次性装入反应器内，进行培炎，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一定时间反应后，将整个反应系取出。 流加培养：是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步生长代谢。到反应终止时，取出整个反应系 连续培养：是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，反应

22、条件处于一种恒定状态。与分批培养和半连续培养不同，连续培养可以控制细胞所处的环境条件长时间的稳定。因此，可以使细胞维持在优化状态下，促进细胞生长和产物形成。10. 在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程。分批灭菌：将配置好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用的设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌。连续灭菌：将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，进行灭菌。11. 保证分批灭菌成功的要素 内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象 压力稳定的蒸汽 合理的操作方法。12. 在发酵过程中夹杂其它杂菌

23、造成的后果： 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力； 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主； 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难； 杂菌会降解目的产物； 杂菌会污染最终产品； 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。12. 连续灭菌设备：配料罐、连消泵、连消塔、维持罐、蛇管冷却器等。13. 无菌空气：是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“ 无菌空气”。14. 空气除菌的方法：辐射灭菌、加热灭菌、静电除菌、介质过滤15. 过滤除菌：利用有孔介质从气体中除去微生物。16. 过滤机理

24、：直接拦截ü惯性冲击ü布朗扩散ü重力沉降ü静电吸引 气流速度小 布朗运动 气流速度中等 拦截作用 气流速度大 惯性冲击作用 表面过滤是拦截作用机理其作用17. 无菌空气的制备流程：空气 空压机 储气罐 冷却 除油水 加热(空气热处理) 总过滤器 分过滤器 无菌空气(空气过滤)18. 空气的预处理目的: 提高压缩前空气的洁净度 去除压缩后空气中的油和水19. 粗过滤器(安装在压缩机前）作用：是捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受磨损，同时也可减轻总过滤器负荷。 常用的粗过滤器有：布袋过滤、 填料过滤 、油浴洗涤 、水雾除尘20. 空气贮罐作用：消除空压机排出空

25、气量的脉动 、维持稳定的压力 、分离部分油水、贮气21. 气液分离器作用：分离空气中被冷凝成雾状的水雾和油雾。22. 常用的过滤介质：棉花、活性炭、玻璃纤维、超细玻璃纤维 棉花 宜选用纤维细长、疏松的新棉花，未脱脂棉。因为旧的棉花容易断丝，脱脂棉容易吸水，会影响过滤。23. 种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管、斜面试管中处于休眠状态的生产菌种接入斜面试管活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯种培养物称为种子。24. 种子制备的过程大致可分为：实验室种子制备阶段、生产车间种子制备阶段25. 作为种子的准则(优质种子的标准)： 1. 菌种细胞

26、的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短； 2. 菌种能保持稳定的生产性能，生理性状稳定； 3. 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； 4. 无杂菌和噬菌体污染； 5. 保持稳定的生产能力。 种子质量标准：细胞或菌体、生化指标、产物生成量、酶活力 种子异常分析： 菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结 菌丝粘壁27 .影响种子质量的因素及控制： 孢子的质量 培养基 培养条件：温度、pH、通风和搅拌、泡沫、染菌的控制 种龄和接种量 种子罐的级数 影响孢子质量的因素及控制： 培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间、接种量。28. 发酵菌种质量的保障措施：合理的育种 选用合适的培养基 创造良好的

27、培养条件 控制传代次数 利用不同类型的细胞进行传代 选择合适的菌种保藏方法发酵过程参数的控制：物理参数控制、化学参数控制、间接参数控制、28. 接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。29. 温度对发酵的影响：温度对微生物生长的影响、温度对产物形成的影响 温度对产物形成的影响： 影响发酵过程中各种反应速率，从而影响微生物的生长代谢与产物生成。 改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成 。 影响生物合成方向 。e.g. 四环素发酵中金色链霉菌：T<30 ，产生金霉素； 产生金霉素；T 达35 ， 产生四环素 。30. 发酵热：发酵过程中所产生的净热量。 净热量。 J / m

28、 3 · h Q 发酵 = Q 生物 + Q 搅拌 - Q 蒸发 - Q显 Q辐射31. 产生菌在生长繁殖过程中本身会产生大量的热，此为生物热。 影响生物热的因素：菌株特性、培养基成分和浓度、发酵时期生物热的大小还与菌体的呼吸强度有对应关系。生物热的大小与菌体呼吸强度有对应关系（）32. 发酵工艺的三类主要控制参数：温度、PH、氧32. pH对发酵的影响：（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻  （2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行   （3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用  （4）p