EMT的研究进展和具体信息

1、上皮细胞间质细胞转换机制一上皮细胞获得干细胞表型或恶性变的途径上皮细胞-间质细胞转换在胚胎发育过程中具有十分重要的地位。现在，越来越多的数据表明该过程在调控正常人体组织和肿瘤组织的细胞可塑性(cellularplasticity)方面也起到了关键作用。通过上皮细胞间质细胞转换过程能够形成多个各不相同的细胞亚群，即形成了肿瘤细胞异质性(intratumouralheterogeneity)。这些亚群细胞都具有各自的特点，有一些可能分化程度较高，但还有一些则表现出了干细胞的特征。而这些特征又都与肿瘤相关表型，比如肿瘤转移或致死率等有关，因此，如何针对肿瘤细胞的这种干细胞特征(即可塑性)来设计治疗方

2、案、寻找治疗药物已经成为了临床研究中的一大热点。虽然还有很多问题需要我们去解决，但这的确是一个非常有希望的发展方向。细胞从上皮细胞表型转变成间质细胞表型的过程被称作上皮-间质转换(epithelial-mesenchymaltransitions,EMT)而相反的转变过程则称为间质-上皮转换(mesenchymal-epithelialtransitions,MET),这些转变过程在胚胎发育(embryonicdevelopment)过程中都起到了关键性的作用，不过最近科研人员们又发现他们在肿瘤形成及致病过程中也起到了至关重要的作用。EMT过程是一个非常复杂的分子过程，上皮可以通过EMT过程“

3、褪去”已分化细胞的特性，比如细胞间的粘附(cell-celladhesion)现象、细胞极性(polarity)现象、细胞缺乏运动能力等等这些表型，获得间质细胞的特征，比如细胞具备移动能力(motility)、侵袭能力(invasiveness)、抗凋亡(resistancetoapoptosis)能力等。EMT转分化过程(transdifferentiation)最开始是在细胞培养过程中被发现的，不过一直以来学界对该过程与体内生理过程之间的关系还存在争议。随着科研工作者们对人体肿瘤和实验动物模型的观察越来越深入，他们逐渐发现EMT过程不仅与正常的胚胎发育过程有关，还与肿瘤发生过程有关。因此，

4、与对胚胎发育过程(详见背景知识框1)的作用相类似，EMT过程和MET过程似乎也都参与了肿瘤发生的过程。尤其是EMT过程对于肿瘤浸润(invasion)、转移播散(metastaticdissemination)以及对药物或治疗的抗性等性状都有关系，而与EMT过程相对的MET过程则似乎是在肿瘤细胞播散之后形成转移灶的过程当中发挥作用。胚胎发育与肿瘤形成之间有一个本质的区别，那就是肿瘤形成过程中基因异常的细胞会逐渐失去对正常生长调控信号的反应性，获得了进化的能力。这种进化现象是因为大部分赘生性细胞(neoplasticcell)所固有的遗传和表型因子不稳定性所造成的。这种不稳定性还能在肿瘤组织中形

5、成多个细胞亚群，这也是造成肿瘤细胞具有异质性(heterogeneity)的一个原因。肿瘤细胞还可能会因为它们所处间质微环境(stromalmicroenvironment)释放的一些信号而造成细胞生物学方面的改变，比如与EMT过程和MET过程有关的一些改变。正如在图1中所示的那样，在体内多处生长的肿瘤细胞都可能会接触到能够触发EMT过程的信号。更重要的是，在多种临床肿瘤中都发现，EMT过程与患者预后不良有关，这似乎是因为EMT转换可以赋予原发瘤细胞更大的侵袭能力(aggressivetrait)。自从我们发现了EMT转换过程之后，科研工作者们就开始对该过程背后的分子机制展开了研究，也逐渐取得

6、了一定的成果，最近有几篇非常精彩的综述对EMT研究领域进行了很好的总结，读者可以查阅这些文献获取更多有关EMT方面的信息。在简略介绍有哪些分子机制能够激活EMT过程之后，在本文中我们会将重点放到向读者介绍最近一段时间刚刚发现的，那些能够调控EMT过程后续表达过程的调控机制，还将就EMT转换和MET转换在肿瘤异质性中的作用，以及肿瘤进展和治疗抗性中的作用展开讨论。最后，我们还将对相关的医疗实践进展做一个介绍。细胞幡粒（由“班亲和疆口'桥技btrtch亡WN7RH/E（Spl）,hairyandenhancerofsplit发状分裂相关增强子WNTR,Wntreceptor：Wnt蛋白受体

7、图1参与调控EMT过程的信号通路网络简介。图中列举了几条参与EMT过程调控的信号通路，它们的下游效应因子，以及这些信号通路及细胞因子之间的相互作用。酪氨酸激酶受体（Receptortyrosinekinases,RTK）、转化生长因子3（TGF3）、Notch蛋白、内皮素A受体（endothelinAreceptor,ETAR、整联蛋白（integrin）、Wnt蛋白、缺氧以及基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMP）等这些信号都能通过各种信号通路诱发EMT转换过程发生。在不同的细胞内，这些信号通路的地位（重要性）各有不同。EMT转换和MET转换都与细胞骨架和细胞

8、外基质，以及细胞间连接方式的改变有关。能诱发EMT转换的信号可以通过蛋白磷酸化机制（比如TGF3信号通路导致的PAR6A蛋白磷酸化）破坏紧密连接和桥粒连接。还可以通过抑制某些蛋白的表达水平（比如ZEB1抑制血小板亲和蛋白3）来诱发EMT转换。细胞外基质的重构也能触发EMT过程，因为很多诱发EMT的因子都能上调细胞外基质蛋白（比如纤维连接蛋白fibronectin和胶原蛋白collagens、蛋白酶（比如MMP）以及其他一些重构酶（比如赖氨酸氧化酶lysyloxidase的表达水平。缺氧、RAC1B活化以及某些激酶途径（比如Akt激酶途径）的激活也都能够促进线粒体合成活性氧簇（reactiveo

9、xygenspecies,ROS）,包括缺氧诱导因子1a（hypoxia-induciblefactor1a,HIF1a）、NF-kEk糖原合成酶激酶33（glycogensynthasekinase-33,GSK33）等，使细胞获得多效性（pleiotropiceffect）。除了各种信号通路之间的相互作用之外，促进EMT过程的细胞因子（图中紫色圆圈表示转录因子）和miRNA之间也存在着非常复杂的相互调控作用。背景小知识速览上皮细胞和间质细胞之间的转换是上皮细胞获得可塑性以及肿瘤得以进展和出现肿瘤异质性的分子机制之一。多种信号都能够触发上皮-间质转换(epithelial-mesenchym

10、altransition,EMT)过程，比如生长因子、肿瘤细胞与间质细胞间的相互作用以及缺氧等信号。各种能触发EMT过程的信号和转录因子构成了一个非常重要的信息网络。EMT转换能够赋予肿瘤细胞干细胞样的特征，比如能够侵润周围组织，或者对某些治疗措施或药物具有抗性等。间质-上皮转换(mesenchymal-epithelialtransition,MET)过程在将转移的间质肿瘤细胞逆转成为上皮细胞表型的过程中发挥了作用。最近发现microRNA也是一种EMT过程调控因子，这可能是由于microRNA可以调控能够诱发EMT过程的转录因子所致。1. EMT过程活化的机制有多种细胞外信号能够激活EMT

11、转换过程，胞内的EMT下游信号通路与参与该过程的转录因子共同组成了一个复杂又意义重大的信号网络，该信号网络包含有多个正反馈回路(图1)。这个复杂的相互作用网络确保了细胞在EMT转换后所获得的间质细胞表型能够稳定的表达。最近有人对乳腺上皮细胞进行了研究，结果发现持续激活的EMT转换作用可以导致细胞进行性表观改变(epigeneticalteration),最终导致细胞发生永久的可遗传改变，使得细胞外诱导信号消失之后，细胞仍然能将间质细胞表型遗传下去。因此，在某些特定情况下，EMT转换过程能够形成稳定的表型改变，并且将这种表性遗传下去，形成特定的细胞谱系。1.1 参与EMT过程的信号通路EMT过程

12、通常都是在上皮细胞中发生的，该过程可以由多种信号诱导触发，其中尤以组成正常组织或肿瘤新生物组织(neoplastictissue)的间质细胞所释放的信号作用最为突出。转化生长因子3家族(TGF3)成员是所有能诱导胚胎发育过程里EMT转换过程的细胞因子中最重要，也是被研究得最透彻的一大类细胞因子，它们可以治疗纤维变性性疾病(fibroticdiseases)和肿瘤性疾病。最近的研究结果还表明，TGF3在调控乳腺癌干细胞(breastcancerstemcell)表型的过程中也起到了一定的作用，同时还发现TGF3对于维持人胚胎干细胞(humanembryonicstemcell)多向分化潜能具有关

13、键性作用。后面这样新发现说明TGF3信号通路可能在所有肿瘤进程中为维持肿瘤细胞的干细胞状态提供了帮助。TGF3信号能够通过多个不同的信号机制诱发EMT转换过程，比如通过直接磷酸化SMAD转录因子配体活化受体(ligand-activatedreceptorsofSMADtranscriptionfactor)的途径，以及通过某些能够调控细胞极性和细胞间紧密连接形成过程的胞质蛋白来触发EMT转换过程。比如在乳腺上皮细胞中，TGF3因子II型受体就能够直接磷酸化SMAD2蛋白、SMAD3蛋白和细胞极性蛋白(cellpolarityprotein)PAR6APAR6A1I白硫酸化之后，细胞会丧失垂直

14、方向的极性(apical-basalpolarity),同时，相邻上皮细胞间业已形成的紧密连接(tightjunctions)也会解体。TGF3还能影响其它多个EMT触发信号途径的活性，比如Notch、Wnt以及整联蛋白信号通路等。Wnt信号通路能通过抑制糖原合成酶激酶33(glycogensynthasekinase-33,GSK33)介导的磷酸化作用以及抑制胞质中的3连环蛋白(3-catenin)降解等作用来诱发EMT转换。胞内丰度大量增加的3连环蛋白会转移进入核内，作为转录因子亚单位诱导大量基因的表达，这些靶基因的表达产物中有很多都是能够诱导EMT转换过程的转录因子。不过，3连环蛋白自身

15、是不能够诱发EMT过程的。比如在大部分结肠直肠癌(colorectalcarcinomas)细胞中，APC基因的失活或3连环蛋白基因的激活都会提高胞内的3连环蛋白水平。不过这些肿瘤细胞并没有表现出间质细胞的特性，这说明3连环蛋白信号通路虽然在某些细胞中能够起作用，但是还不足以激活能触发EMT过程的转录因子的表达(表1)。多项研究都发现了人乳腺癌上皮细胞钙粘蛋白(epithelialcadherin,E-cadherin)的遗传突变失活与表观失活之间的差别，不过在乳腺癌细胞中很难观察到核内3连环蛋白积聚的现象。还有研究发现，Wnt信号通路的活性在结肠直肠癌细胞中也有所升高，而这是因为几个特异性沉

16、默Wnt蛋白的关键基因，比如SOX1又SFRPsDKK1等都被抑制的结果。这也从另一个方面进一步表明了Wnt信号通路的重要作用。表1在肿瘤细胞中与EMT转换相关的基因以及它们和肿瘤临床特征之间的联系Notch信号通路也在参与胚胎发生和肿瘤形成的EMT转换过程的调控工作中发挥了作用。Notch信号通路非常复杂，因为该通路中包含了多个受体、配体和下游调控因子。而且令情况更为复杂的是，Notch信号通路活化之后所造成的结果还具有细胞特异性，既有可能是促进肿瘤形成，也有可能会抑制肿瘤形成。Notch信号通路也能诱发EMT过程，它主要是通过激活NF-kB信号通路或者调控TGF3信号通路的活性来发挥作用。

17、Hedgehog信号通路也参与了EMT过程和肿瘤转移过程。综上所述，似乎参与了干细胞功能调控和生态位与干细胞间相互作用(niche-stemcellinteraction)调控的信号通路也都在EMT触发过程中起到了一定的作用。这也同时表明，EMT过程与细胞获得并维持干细胞样特征有一定的关系。大量的酪氨酸蛋白激酶受体(receptortyrosinekinases,RTK)也在和EMT过程相关的胚胎发育过程中起到了重要的作用，比如胚胎分支形态发生过程(branchingmorphogenesis)和胚胎心脏瓣膜形成过程(cardiacvalveformation)等。在某些肿瘤细胞中，这些RTK

18、蛋白中的某一些蛋白发生了突变，表现为组成性激活(constitutivelyactive)。还有一些细胞表面蛋白发生了改变，这也会促进EMT过程的发生。比如在多种肿瘤细胞中，上皮细胞钙粘蛋白的表达都会因为遗传或非遗传的各种原因而缺失。于是在胞质中往往因为结合了一个上皮细胞钙粘蛋白“尾巴”而受到限制的3连环蛋白获得了“解放”，然后如前文所述，3连环蛋白得以进入核内，诱导能促进EMT过程的转录因子的表达。因此，RTK蛋白的组成型激活和上皮细胞钙粘蛋白表达抑制这两条途径都会导致细胞获得间质细胞特性，一旦细胞获得了这种特性，形成了肿瘤细胞，就可以不再需要肿瘤微环境中各种诱发EMT过程信号的刺激而持续保

19、持间质细胞特性了。1.2 缺氧的作用缺氧(Hypoxia)也是一种能够诱发EMT过程的生理机制，它也是通过多种机制，比如上调缺氧诱导因子1a(hypoxia-induciblefactor-1a,HIF1a)、肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)、SNAI1以及TWIST1等蛋白的表达，激活Notch或NF-kB信号通路，以及诱导DNA低甲基化等作用机制来诱发EMT过程的。3%的氧含量就能够诱发多种人体肿瘤细胞发生EMT转换，这主要是通过抑制GSK33的活性，从而限制了3连环蛋白的磷酸化过程和降解过程来发挥作用的。缺氧细胞会变得更富有侵袭性，胞内的Wnt-3连

20、环蛋白信号通路活性也会增强，因此能够诱发EMT过程的转录因子SNAI1的表达量得以上升。在另一项研究中发现，Notch信号通路的活化是缺氧诱导EMT过程发生的先决条件。缺氧可能还会激活细胞自我加强的正反馈途径，帮助细胞维持间质细胞状态。比如，SNAI1蛋白的活化能抑制上皮细胞钙粘蛋白的转录，从而释放出胞质里的3连环蛋白，然后3连环蛋白进入核内，激活并维持EMT诱发转录因子的表达。还有一些其它的胞外信号也能触发EMT过程。比如有人对小鼠乳腺上皮细胞研究发现，该细胞能对异位表达的基质金属蛋白酶3(matrixmetalloproteinase3,MMP3,又名间质溶解素1,stromelysin1

21、)做出反应，诱发EMT过程。MMP3蛋白是因为RAC1蛋白的剪接变异体RAC1B蛋白介导的活性氧簇(reactiveoxygenspecie)增多而出现的。1.3 上皮细胞与基质细胞间的相互作用可以调节EMT和MET过程正如前文所述，在肿瘤中诱发EMT过程的因子通常都是起源于和肿瘤有关的基质，即形成肿瘤微环境的基质细胞中的各种信号通路。最开始有一些研究表明，间质细胞与上皮细胞间的相互作用在诱发EMT过程中也起到了一定的作用，它们能够增加肿瘤细胞与基质发生相互作用的表面上多种EMT分子标志物的表达。这一点已经在多种人体肿瘤细胞核动物肿瘤模型中得以证实。肿瘤细胞由于受到了所处微环境的影响也会发生M

22、ET转换。比如前列腺癌细胞与正常的肝细胞共培养时就会出现上皮细胞钙粘蛋白表达上调的现象，随后细胞会表现出已分化上皮细胞的特征。这种前列腺肿瘤细胞逆转进入上皮细胞状态的证据还包括一些其他的特征，比如在正常肝细胞与肿瘤细胞间出现了细胞间相互作用，这也是通过在细胞间形成同型上皮细胞钙粘蛋白桥(homotypicalE-cadherinbridges)来完成的。还有一个尚未解决的问题就是可扩散因子，尤其是生长因子和前文中提到的细胞因子是否参与了MET的诱导过程。可能还有一种缺省机制(defaultmechanism)应该也在EMT转换过程中起到了同样重要的作用，在没有能够促进细胞发生EMT转换并维持间

23、质细胞状态的信号存在的情况下，很多正常的细胞和新生肿瘤细胞就会在这种缺省机制的作用下回复上皮细胞状态。该理论似乎就可以解释例如在转移肿瘤细胞的生长阶段发挥作用的MET过程。因此，在原发灶肿瘤细胞缺乏基质来源的EMT刺激信号的情况下，位于正常组织环境中的转移瘤细胞可能会通过MET过程回复上皮细胞状态。背景知识1:胚胎发育过程中的EMT和MET转换已经有好几篇非常精彩的综述介绍了有关在胚胎发育过程中出现的上皮-间质细胞转换(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)和间质-上皮细胞转换(mesenchymal-epithelialtransition,MET)现象。

24、EMT和MET转换在好几个发育进程中都起到了重要的作用。在胚胎发育过程中出现最早的EMT转换是在原肠胚形成期(gastrulation)时发生的间质细胞(mesenchymalcells)形成和中胚层(mesoderm)形成事件。胎盘(placenta)、前体节(somites)、心脏瓣膜(heartvalves)、神经管崎(neuralcrest)、泌尿生殖系统(urogenitaltract)、继发腭(secondarypalate)等组织器官的形成过程以及胚胎多个器官的分支形成过程(branchingmorphogenesis)中都有EMT和MET转换作用的参与。转化生长因子3(tran

25、sforminggrowthfactor-3)、Notch、Wnt、酪氨酸激酶受体信号通路等分子间的相互作用也都共同参与了在肿瘤发展进程中发挥作用的EMT和MET转换过程。在胚胎发育过程中，与EMT作用相同的调控机制能够将上皮细胞转换成可迁移间质细胞，帮助器官的形成。但是在肿瘤发生发展的过程当中，该机制会异常活化，从而促进了肿瘤的浸润和转移。尽管这些机制当中存在着相似之处，但是在胚胎发育过程中发挥作用的EMT和MET和在肿瘤发生发展过程中发挥作用的EMT和MET之间还是存在着一些重要的区别，尤其是在某些肿瘤中，因为体细胞突变情况，所以上述转换过程有可能是一种不可逆的过程。2 .遗传控制和表观遗

26、传控制有好几个基因都参与了EMT的调控功能，研究发现，这些基因在肿瘤细胞中都会因为遗传的或“后天的(表观遗传学)”作用而发生改变(背景知识2)。正如前文所述，细胞会通过各种机制稳定的缺失上皮细胞钙粘蛋白。比如编码上皮细胞钙粘蛋白的CDH1基因突变就是遗传性弥漫性胃癌(hereditarydiffusegastriccancer)的病因。而且在CDH1基因发生突变的人群中有一部分罹患乳腺小叶癌(lobularbreastcarcinomas)的风险也要明显高于常人。这同样是因为，在乳腺小叶癌患者中，CDH1基因经常会出现体细胞性遗传失活(somaticgeneticinactivation),但

27、CDH1基因失活也不一定会诱发EMT过程，这和我们前面提到的用RNA沉默方法抑制上皮细胞钙粘蛋白表达的情况有所不同。背景知识2：表观调控机制表观调控机制包括DNA甲基化、染色质或组蛋白修饰、以及非编码RNA调控等方式。每一种机制都在干细胞功能和干细胞分化，以及肿瘤形成过程中发挥了调控作用。比如DNA甲基化就在抑制基因表达，基因印记和X染色体失活等过程中发挥了重要作用。此外，DNA甲基化还与某些基因的细胞特异性表达现象有关。DNA甲基化和基因印记作用发生遗传异常会引起胚胎发育缺陷，增加肿瘤的患病几率。最近的研究还表明，DNA甲基化水平异常和染色质的改变会在细胞发生基因突变之前就能够促进肿瘤形成。

28、DNA甲基化过程和染色质修饰之间存在着相关性，非编码RNA可能就是联系它们之间的纽带。在最近几年里，我们新发现了好几种组蛋白修饰方式以及参与组蛋白修饰过程的酶。最近又发现在哺乳动物细胞中，非编码RNA与DNA甲基化和组蛋白修饰也有关，这也已经逐渐成为了非编码RNA研究领域的一个新的发展方向。通过这种对应机制的作用，那些所编码的转录因子能够特异性诱导细胞获得干细胞表型的基因会发生低甲基化，从而促进EMT过程发生，在肿瘤细胞里则表现为促使细胞去分化并增强其转移能力。比如最近有人对干细胞样的CD44+CD24-细胞和来自正常组织或新生乳腺组织的已分化CD24-CD44隹田胞的DNA甲基化情况作了一个

29、全面的分析。该研究发现了几个能诱导EMT过程的转录因子，这些转录因子的编码基因在CD44+CD24-细胞中都表现为低甲基化水平，因此能够高表达，而在CD24-CD44+细胞中甲基化水平明显增多。在MCF-12A细胞或MDCK细胞中异位表达FOXC1蛋白也能诱导EMT转换现象出现，这是因为降低了胞内的上皮钙粘蛋白表达水平，增加了波形蛋白(vimentin)的表达，促进了细胞的运动能力和浸润能力。基于这种基因低甲基化导致EMT的理论，有人对MCF-7乳腺癌细胞给予5-氮杂胞昔(5-aza-cytidine)进行了实验。5-氮杂胞甘是一种DNA甲基转移酶(methyltransferase)抑制剂，

30、它能上调与EMT过程相关的促细胞侵袭基因(pro-invasiveEMT-associatedgene)的表达，增强细胞的侵袭能力和转移能力。这些研究结果提示我们，需要谨慎对待使用DNA甲基转移酶抑制剂来治疗乳腺癌的这种方法，因为这会增加肿瘤细胞的播散转移风险。2.1 转录调控机制图1和表1中我们列举了大概6至8种转录因子，它们被证实能够调控胚胎发育过程和肿瘤发生发展过程中的EMT作用。这些转录因子中既有能够直接抑制上皮钙粘蛋白表达的SNAI1、SLUG(又名SNAI2)、SIP1(又名ZEB2)、E47(又名E2”)等转录抑制因子(transcriptionalrepressors),也有T

31、WIST1、FOXC2FOXC1GSCZEB1等间接对上皮钙粘蛋白表达发挥作用的因子。越来越多的证据表明，这些转录因子间大量的相互作用使得它们能够形成一个信息网络，来诱导上皮细胞表现出间质细胞的表型并且长期维持这种表型。另外，还有一些转录因子，比如TWIST1还在抵抗细胞衰老，诱导肿瘤干细胞形成的过程中起到了关键性的作用。正如前文中所提到的，EMT诱导转录因子同时也能赋予上皮细胞干细胞的表型，见图1。KIT受体这个在造血系统中对维持造血细胞的干细胞状态起到重要作用的因子也支持了上述理论，因为在小鼠和人体试验中都发现，KIT蛋白能诱导SNAI2的表达。2.2 非编码RNA对EMT和肿瘤转移过程的

32、调控作用我们现在越来越认识到非编码RNA在基因表达调控方面占据了十分重要的地位。最近有好几个研究都发现，非编码RNA能够激活EMT程序，这些RNA包才miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429)和miR-205等。同时还发现ZEB2基因的天然反义转录产物(anti-sensetranscript)也具有同样的功能。在所有这些研究中都发现了一个共同点，那就是在所有的EMT调控途径中，上皮钙粘蛋白的表达都会受到抑制。有两个独立的研究团队运用两种完全不同的方法分别发现了miR-200家族和miR-205在EMT程序中的作用。在其中一项研究

33、中发现，各种不同肿瘤细胞中的miRNA表达模式都与细胞表现为上皮细胞特征还是间质细胞特征有关，而这又可以通过上皮钙粘蛋白(CDH1基因)和波形蛋白(vimentin,VIM基因)的mRNA水平来判断。miR-205的表达水平以及miR-200家族成员的表达水平也都会随着波形蛋白mRNA的表达水平而“反向运动”。后续的研究工作又发现，这些miRNA的靶标包括ZEB1和ZEB2这两种能够诱导EMT过程发生的转录因子，它们都能抑制上皮钙粘蛋白的表达。后来又在原发性人体卵巢浆液性乳头状癌(primaryhumanserouspapillarycarcinomasoftheovary)中发现这些miRN

34、A的表达都与CDH1基因呈正相关，与VIM基因呈负相关。另一项研究发现，在马-达二氏犬肾(Madin-Darbycaninekidney,MDCK)细胞中，细胞如果经TGF3或者酪氨酸磷酸酶PEZ的诱导进入EMT程序之后，miR-205和miR-200家族成员的表达均有下调。ZEB1和ZEB2仍然是这些miRNA的作用靶标。而且，这些miRNA分子的表达下调足以诱导EMT过程的发生，同时如果异位表达这些miRNA分子，则能够诱发MET过程。还有一些科研人员在人结肠癌细胞中利用SNAI1诱导发生的EMT过程发现了另一种调控ZEB2基因mRNA水平的机制。细胞在SNAI1蛋白的诱导下进入EMT程序

35、之后，ZEB2蛋白的表达会随之增加，因为ZEB2基因的mRNA水平有所提高，但是并没有发现ZEB2基因的转录水平有明显的改变。Beltran等人结合了好几种手段发现，ZEB2的表达是由一自然反义转录产物所调控的，该转录体能够阻止包含有内部核糖体进入位点(internalribosomalentrysite)的5'非翻译区(untranslatedregion,UTR)中一大段内含子被剪接。该5'UTR区还含有一段序列，该序列能够抑制核糖体扫描(ribosomescanning),从而降低mRNA的翻译效率，导致上皮细胞中ZEB2蛋白的水平降低。不过在EMT程序激活时，这种反义转

36、录产物的水平会升高，它与5'UTR结合之后会抑制其剪接，从而保留了内部核糖体进入位点，增强了mRNA的翻译效率，增加了ZEB2蛋白的水平，因此也就降低了胞内上皮钙粘蛋白的含量。非编码RNA通过对EMT和MET的调控也参与了肿瘤浸润和转移过程的调控。比如对转移乳腺癌细胞和非转移乳腺癌细胞中候选miRNA的分析表明，miR-10b是与细胞获得间质细胞表型和侵袭转移能力有关的miRNA。随后又有研究人员发现，miR-10b能够被TWIST1蛋白诱导，而胞内TWIST1蛋白水平升高之后也会抑制HOXD10基因的表达，上调RHOC蛋白的水平，从而增强细胞的侵袭和转移能力。还有一点需要提及的是，在

37、出现转移灶的患者体内原发肿瘤细胞中miR-10b分子的表达水平会更高一些。与miR-10b作用相反，有人对MDA-MB-231乳腺癌转移细胞和非转移细胞进行芯片分析之后发现，miR-335可以抑制肿瘤侵袭和转移。miR-335似乎能够通过影响转录因子SOX4和胞外基质蛋白粘蛋白C(tenascinC)的表达来抑制肿瘤转移。Tavazoie等人还发现了一种miR-335基因标签(genesignature),该标签由6个基因组成，它们分别是COL1A1MERTKPLCB1PTPRN2TNC和SOX4基因。这些基因的表达会受到miR-335的抑制，不过在转移瘤细胞中，它们的表达水平会升高。这种mi

38、R-335基因标签还与乳腺癌患者无转移发生生存率较低的现象有关，这也说明了miR-335在肿瘤转移调控中发挥了一定的作用。在将来，随着发现鉴定非编码RNA技术的进步，以及非编码RNA功能研究手段的丰富，我们必将能够发现更多的非编码RNA在EMT和MET过程中发挥关键的调控作用。现在，大家都逐渐认识到miRNA与细胞生理的各个方面都有联系，因此我们有理由相信，miRNA和蛋白质一起，在细胞调控机制中发挥了主要作用。3 .间质细胞-上皮细胞转换最近的研究表明，具有与EMT过程相关基因表达标签的原发肿瘤发生转移的可能性会更高，患者的无转移生存时间也更短。不过我们反复观察的结果却是转移灶肿瘤组织主要是

39、由表现上皮细胞表型的肿瘤细胞组成，即与原发灶肿瘤细胞比较类似，但这种现象与上述EMT会促进肿瘤转移的观点看起来非常矛盾。如果肿瘤细胞必须经过EMT转换才能播散转移的话，为什么转移灶肿瘤细胞会与原发灶细胞在组织学水平上如此相似呢？实际上，这并不矛盾，因为在肿瘤细胞经历EMT转换转移到远隔部位之后还会再经历一个MET转换，让转移瘤细胞回复到上皮细胞状态(图2)。有好几项研究都表明，CDH1基因启动子的DNA甲基化水平会随着肿瘤转移的进程而不断发生变化。在原发乳腺癌细胞中，肿瘤细胞会发生一个短暂的超甲基化，抑制CDH1基因的表达，增强肿瘤细胞的侵袭性和转移能力，但是肿瘤细胞完成转移之后，上皮钙粘蛋白

40、的表达又会再次增强，这是因为CDH1基因启动子又经历了一次去甲基化修饰。不幸的是，这些研究都没有对肿瘤细胞进行克隆鉴定。还有一种可能就是原发肿瘤细胞中具有上皮细胞DNA甲基化状态的肿瘤细胞发生了转移，因此转移灶处的肿瘤细胞也就表现为上皮细胞表型。因此，EMT-MET转换理论还值得进一步的推敲、验证。原发肿瘤血液循环送隔转移灶图2在肿瘤发生发展过程中，肿瘤细胞在上皮细胞状态与间质细胞状态之间转换过程示意图。在肿瘤原发灶中，EMT过程和MET过程都与肿瘤细胞异质性(heterogeneity)现象有关，而肿瘤细胞异质性现象正是肿瘤难以治疗以及容易发生转移的一大原因。粒细胞和肿瘤相关成纤维细胞等间质

41、细胞之间的相互作用可能会触发EMT转换过程，赋予上皮样肿瘤细胞间质细胞或者肿瘤干细胞的表型，从而促进肿瘤细胞的生长和存活。肿瘤干细胞更容易发生转移，也更容易从循环系统和微小转移灶(micrometastases)中被检出。不过临床可见的巨大转移灶(macroscopicmetastases更主要的是由分化更好的上皮样肿瘤细胞所组成。这是因为在微小转移灶形成之后，又会出现一个MET转换，将EMT转换得来的细胞回复成上皮样肿瘤细胞。之所以会出现这种回复过程可能是因为，在转移灶处的局部选择压力使得具有上皮细胞表型的肿瘤细胞更适于生长，或者是因为缺乏EMT诱导信号的刺激。不过，我们也不能排除，是上皮样

42、肿瘤细胞和间质样肿瘤细胞相互合作促使肿瘤转移发生的。背景知识3:小非编码RNA最近发现的一些小非编码RNA属于一大类新型的基因表达调控因子，它们可能是在转录后水平发挥调控作用，可能还参与了表观遗传调控过程。在最近这几年里，研究发现miRNA和piRNA对于干细胞的功能、细胞分化以及胚胎发育都是必须的。而且，miRNA还具有促进肿瘤形成和抑制肿瘤形成的作用，miRNA是一段1925bp长的单链RNA分子，它由RnaseIII经过一系列催化作用彳#来。miRNA会参与形成miRNA诱导的沉默复合体(miRNA-inducedsilencingcomplexes,miRISC)。一种miRNA分子能

43、与多种mRNA靶标结合，抑制其翻译，甚至促进其降解。在某些情况下，miRNA还能通过某些未知机制影响基因转录。piRNA在生殖细胞(germline)里起到了调控转座子移动的作用，它们还可能在体细胞里参与细胞生理过程的调控，不过目前机制还不清楚。4 .EMT和MET的临床重要性EMT转换过程与肿瘤的两大重要特性有关，这两大特性分别是肿瘤转移以及肿瘤抵抗治疗。这两大特性可能都与EMT转换所导致的肿瘤细胞干细胞样特性有关。有两个研究小组都分别发现，在乳腺上皮细胞里能诱导EMT过程的转录因子TWIST1或SNAI1表达之后，通过细胞表面抗原检测、基因表达谱检测、能否形成mammosphere的检测以

44、及异体移植后能否形成导管等检测方法发现，干细胞样细胞的数量都会明显增多，使用TGF3也能得到同样的结果。其中一个研究小组分别对从正常人体乳腺组织和原发乳腺癌组织中分离出的CD44+CD24-细胞进行了与EMT过程有关基因表达情况的分析，结果发现能够诱发EMT转换的转录因子，比如TWIST1、FOXC2SNAI1、ZEB2(又名SIP1)TWIST2等，以及波形蛋白(vimentin)和纤维连接蛋白(fibronectin)在CD44+CD24-干细胞样肿瘤细胞中的表达水平要比在分化程度更高的CD44+CD24-上皮样肿瘤细胞中高的多。这些实验结果加上以前的研究成果一起表明，在CD44+CD24

45、-孚L腺癌肿瘤细胞中与肿瘤浸润、转移和血管生成相关的基因都有上调，同时细胞的侵袭和转移能力也增强了。同时，研究还发现，播散到循环系统和骨髓中的乳腺癌细胞中表现为CD44+CD24-抗原表型的细胞数量也明显增多。大量出现的CD44+CD24干细胞样肿瘤细胞以及与EMT过程相关的基因大量表达这些现象都与基底细胞样乳腺癌有关(basal-likesubtypeofhumanbreastcancer)。对479例乳腺癌样品进行免疫组化分析后发现与EMT过程有关的蛋白，比如波形蛋白、“平滑肌肌动蛋白(a-smoothmuscleactin)、神经钙粘蛋白(neuralcadherin,N-cadheri

46、n)、SPARC1白、层粘连蛋白(laminin)以及成束蛋白(fascin)等都会大量表达，而上皮钙粘蛋白的表达量相比其他类型的乳腺癌细胞则会下降。这些肿瘤因为容易发生转移，所以预后都比较差。另一个研究小组分析了117例原发侵袭性乳腺癌样品中能诱发EMT转换的转录因子FOXC2的表达情况，结果发现该因子与基底细胞样乳腺癌关系密切。结合这些实验结果以及双重免疫组化检测(dualimmunohistochemicalanalysis)结果证明，基底细胞样乳腺癌细胞就是CD44+CD24-肿瘤细胞。EMT转换机制对于肿瘤抵抗临床治疗也具有十分重要的作用。在经过标准化疗之后的肿瘤“残余”灶中，剩余的

47、肿瘤细胞大部分都是干细胞样肿瘤细胞。比如给予乳腺癌患者新辅助疗法(neoadjuvanttherapy)和标准的慈环霉素及紫杉烷化疗(anthracycline-taxanechemotherapy)之后，在活检组织中可以发现，表达有与EMT过程相关基因的CD44+CD24-细胞的数量明显增多。但是对ERBB2+勺孚L腺癌患者用表皮生长因子(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR和ERBB2双重抑制剂拉帕替尼泊(lapatinib)治疗之后则不会出现这种情况。对于某些肿瘤而言，比如肺癌和结肠癌，细胞经历EMT转换之后，对于EGFR激酶抑制剂的敏感性会降低，这可能是因为细胞活化了EGFRt酶的下游因子PI3K和Akt,从而不再需要EGFRt酶信号通路的作用。EMT转换作用和肿瘤细胞随即表现出来的肿瘤干细胞特征也都与肿瘤细胞的抗凋亡机制相关。对EpH-4和NMUMG鼠乳腺上皮使用TGF3诱导EMT作用之后，这些上皮细胞都对紫外线诱导的凋亡机制产生了抵抗作用。同样，在乳腺癌细胞中，下调l