显微操作在脐血干细胞移植修复大鼠脊髓损伤中的应用

1、显微操作在脐血干细胞移植修复大鼠脊髓损伤中的应用         10-05-04 15:28:00     编辑：studa20             作者：尹文化，金大地，鲁凯伍，闫慧博，王璐，邓许勇 【摘要】  目的建立大鼠脊髓全横断损伤模型，应用显微操作方法和人脐血干细胞移植修复大鼠脊髓损伤，观察显微操作技术对大鼠受损脊髓功能恢

2、复的影响。方法 取足月健康顺产新生儿脐血，分离、培养脐血干细胞。60只SD雌性大鼠，随机分为假手术对照组（A组，n=10）、实验对照组（B组，n10）、常规治疗组（C组，n=20）和显微治疗组（D组，n=20）。A组大鼠只打开椎板；B、C组大鼠采用常规方法行T89平面脊髓全横断，造成急性脊髓损伤，C组大鼠于脊髓两断端用1 l注射器分别注射脐血干细胞悬液1 l（干细胞浓度为6×109/L 7×109/L），B组同法注射等量PBS液；D组采用显微操作技术行脊髓横断，并以口径50 m的毛细玻璃针用相同方法注射脐血干细胞。术后18周内每周进行1次后肢BBB评分，术后第8周处死大鼠，

3、对比观察术中和术后第8周各组大鼠脊髓大体标本外形、颜色、质地和体积大小改变。结果A组大鼠手术前后运动功能、脊髓大体标本未见明显变化。B、C、D组大鼠术后双侧后肢完全性瘫痪，B组大鼠无明显恢复。而C、D组大鼠，从术后第2周开始逐渐恢复部分后肢运动功能。第3周以后，D组大鼠后肢运动功能BBB评分明显优于C组，具有显著性差异（P<0.05）。术后第8周，所有大鼠脊髓横断处均瘢痕愈合，B组大鼠远侧段脊髓干瘪、皱缩；C组大鼠远侧段脊髓直径轻度变细，外形尚饱满；D组大鼠横断处两侧脊髓直径无明显差异，外形圆润，但局部可见明显瘢痕粘连。结论人脐血干细胞移植对脊髓横断性损伤具有较好的治疗作用，显微操作技术

4、的应用能最大可能地减少人为造成的脊髓损伤，有利于脊髓损伤的功能修复。 【关键词】  显微操作； 脊髓损伤； 脐血干细胞； 移植    Abstract：ObjectiveTo establish effective and reliable complete spinal cord transection models in rats, and to investigate the effects of micromanipulation used in surgical procedure of transected spinal cord treat

5、ed with human umbilical cord blood stem cells (UCBSCs) grafts in rats.MethodHuman UCBSCs were obtained from umbilical cord blood of term deliveries.Sixty SpragueDawley (SD) female rats were divided randomly into  group A(control group), group B(spinal cord transection and PBS injection), group

6、C(spinal cord transection and UCBSCs transplantation) and  group D(spinal cord transection and UCBSCs transplantation by using micromanipulation).All groups were operated, and 1 l UCBSCs（6×109/L 7×109/L） were injected into the both ends of the completely transected spinal cord at the&

7、#160; groups C and D by two different surgical procedures respectively. From 1 week to 8 week postoperation, a behavioral testing was performed weekly upon each hindlimb for all animals according to the BBB scoring system. At the 8th week, all animals were sacrificed and the spinal cords were taken

8、out for morphological observation. ResultNo changes were observed at group A pre and postoperation. After 2 weeks postoperation, the hindlimb motor function of groups C and D began to recover. After 3 weeks postoperation, the  group D showed more improvement than  group C, and the differen

9、ce between  groups D and C were significant in the BBB scores(P<0.05).No functional recovery was observed at  group B. In addition to the adhesion between the spinal dura matter and peripheral tissues at  group D, hypertrophic scar existed in the injured spinal cord of every experi

10、mental rat.ConclusionHuman UCBSCs may improve functional recovery of the hindlimbs of the experimental rats. Micromanipulation is benefit to elevating the therapeutic efficacy, because it might minimize the possibility of spinal cord injury in surgical procedure.    Key words：microman

11、ipulation;  spinal cord injury;  umbilical cord blood stem cells;  transplantation    脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）严重影响患者的生活质量，促进SCI后脊髓神经和轴突再生，在一定程度上恢复双下肢感觉和运动功能，一直是医学界努力的方向。多种干细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究已取得一定进展，但疗效尚不理想，除却进一步探索更理想的种子细胞，操作方法的选择也是影响疗效的一个重要因素。人脐血干细胞来源广泛，具有分化成包括神经细胞在内的

12、多种组织细胞的潜能1、2，有望成为脊髓再生研究中移植细胞的良好替代品，具有较好的应用前景。本实验建立了大鼠完全性脊髓横断模型，并对采用不同操作方法治疗大鼠脊髓损伤后神经功能的恢复和脊髓大体形态学变化进行了对比研究。    1  材料与方法    1.1主要实验材料  微型不锈钢薄唇枪钳（枪头2 mm×1.5 mm，唇厚0.15 mm）、微型神经剥离子（宽1 mm、1.5 mm各1把，唇厚0.15 mm）和用上海吉列刀片改制的超薄手术刀片（刀片厚50 m）由广州器化医疗设备有限公司代为加工制造。显微镊和微型

13、自动牵开器购自广州市金路工贸有限公司。甲基纤维素5 g/L（美国Sigma公司,），低糖DMEM培养基（Hyclone公司）；FBS（Gibco公司），淋巴细胞分离液（比重1.077 g/ml，天津生物制品研究所）。抗人CD29、CD34、CD45、CD105、CD106单克隆抗体（深圳晶美公司）, EpicsXL II型流式细胞仪（Beckman Coulter公司）。1 l微量注射器购自上海高鸽工贸有限公司。毛细玻璃针由南方医科大学生理教研室提供。手术显微镜（云南SSX型），立体定向仪（Narishige SR6），倒置相差显微镜、荧光显微镜（日本Olympus产品）。实验主体在南方医科大

14、学生物材料研究所（广东省重点实验室）完成。    1.2  实验动物与分组  雌性SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供（许可证号SCXK(粤)200600152006B023）。随机挑选60只成年雌性健康SD大鼠，体重230270 g，平均（236±6.78）g，随机分成4组，其中A组（n=10）只打开椎板，为假手术对照组；B组（n=10）行完全性脊髓横断PBS断端注射；C组(n=20)行完全性脊髓横断脐血干细胞移植，D组(n=20)在显微操作下行完全性脊髓横断脐血干细胞移植。对死亡大鼠模型，分析死亡原因，并及时予以补足。 

15、;   1.3  大鼠脊髓全横断模型的建立和人脐血干细胞移植  大鼠用100 g/L水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于手术台上，无菌条件下以T9椎体棘突为中心，纵行切开约2 cm，钝性分离棘突两侧椎旁肌达椎板表面，微型自动牵开器牵开两侧椎旁肌，暴露椎板和椎体棘突，咬除T810椎体棘突。微型神经剥离子钝性分离T810椎间黄韧带，微型枪钳咬除T8、9椎板至两侧关节突内缘。纵行剖开硬脊膜约0.5 cm，经硬脊膜切口，于硬脊膜下蛛网膜外，将超薄手术刀片抵在一侧骨壁上，划断脊髓，包括脊髓背静脉、两侧的脊髓背动脉和脊髓腹动脉，避免反复切割。选

16、择健康足月产妇，待新生儿娩出后，按照Wang等3的方法备取第3代脐血干细胞，在立体定位仪下用1 l微量注射器行细胞移植。D组大鼠采用毛细玻璃针行细胞移植，其硬脊膜切口采用显微缝合。其余各组大鼠背侧硬脊膜切口用胸背部筋膜片覆盖，常规分层缝合。术后连续3 d每日予青霉素（3万IU/kg）肌注1次。每笼饲养45只大鼠，恒温保暖，隔日更换垫料。每日行人工膀胱按摩排尿，早晚各1次。D组显微操作在10倍手术显微镜下完成。    1.4  脊髓形态学观察及后肢运动功能评价  术中观察各组大鼠脊髓形态结构变化。从术后第1周开始，对大鼠进行BBB评分4，每周1次

17、，每次持续观察4 min或来回爬行5个轮回，取平均分，直至术后8周。没有额外的引诱或促动因素。评分者为非本组实验人员且熟知BBB 评分标准。术后第8周，过量麻醉处死大鼠，经心脏灌注固定脊髓，观察其形态、颜色、质地、体积大小及局部粘连情况，并与术中情况进行对比。    1.5  统计学数据处理  所有计量资料均以±s表示，应用SPSS 12.0软件包进行统计学处理，组间比较用OneWay ANOVA检验，组内比较用t检验。 P0.05为差异具有统计学意义。    2  结果    2.1  人脐血干细胞分离、体外培养及免疫鉴定    共采集36份新鲜脐血，每份脐血平均采集量为25.94 ml(2089