槲皮素医治口腔溃疡的愈合研究

1、槲皮素医治口腔溃疡的愈合研究     本文作者：赵志宇 郭兰 韩淑英 单位：河北联合大学附属医院口腔科 河北联合大学复发性口腔溃疡(recurrentoralulcer，ROU)是口腔黏膜病中最常见的疾病之一，发病时疼痛剧烈，且复发率高，很难根治。因疾病原因及机制不清，故治疗多以对症为主。全身药物治疗繁琐，副作用多，不易为患者所接受。物理及心理疗法疗效还不确切，故多以局部治疗为主。局部治疗的剂型有糊剂、霜剂、软膏等，以上剂型由于在口腔内维持时间短，局部药物有效浓度降低，易受唾液影响等原因疗效欠佳。近年来发展起来的新剂型膜剂克服了上述剂型的缺点，具有含药量

2、准确，抵抗唾液清除，延长药物作用时间，较好地发挥药效，且携带方便，用药方法简单等优点，逐渐成为治疗复发性口腔溃疡的主要剂型。槲皮素是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物，广泛存在于自然植物中，约有100种中草药含有槲皮素。近年来对它的研究日益增多，发现其有抗氧化清除自由基、抗肿瘤、镇痛、抗炎、抗菌、抗病毒、增强免疫及保护心血管等多种药理活性。由于槲皮素毒副作用小，越来越显示出重要的临床应用价值，但应用于口腔溃疡的治疗尚未见报道。本实验拟用壳聚糖为成膜材料，加入槲皮素制备口腔溃疡药膜，应用于口轻溃疡动物模型验证其疗效，为临床应用提供实验依据。1材料与方法11动物清洁级SD大鼠，雌、雄兼有，体重19

3、0230g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号SCXK(京)2009-0004。实验动物在华北煤炭医学院实验动物中心屏障环境动物实验室喂养和实验。60Co照射大鼠普通饲料，由北京科奥协力饲料有限公司提供，合格证号SCXK(京)-2005-0007。12药品槲皮素(querctin，中国药品生物制品检定所，批号0090-1006，纯度99%);壳聚糖(chitosan，CS白色粉末，脱乙酰度821%，相对分子质量138000，青岛生化厂);冰硼散(山东方健制药有限公司，批号20100511)。13仪器TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、电子天平(上海第二天平仪器厂)、RB

4、-200智能热板仪(成都泰盟科技有限公司)、自动双重纯水蒸馏器SZ-93(上海容亚生化仪器厂)、超低温冰箱(三洋电机株式会社)、电热恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)、722型分光光度仪(北京市六一仪器厂)、日立7180全自动生化分析仪(日本日立公司)、GL-20G-型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)、酶标仪(BIO-RADcompany)、石蜡切片机(德国LeicaRM2145)、MoticMed60数码医学图像分析系统(北京航空航天大学)、数码照相机(日本日立公司)。14方法141动物模型的建立1清洁级SD大鼠60只，体重190230g，普通饲料(饲养条件:大鼠自由取食、饮水，分笼饲养，勤

5、换垫料，房间温度22，湿度40%，12h明暗周期)适应性喂养1周后，在100g/L水合氯醛(09g/kg)麻醉下，用直径03cm的NaOH晶体圆片在双侧下唇靠口角黏膜处烧灼6s，生理盐水冲洗后形成溃疡。142槲皮素壳聚糖贴膜的制备称取一定量的CS，溶于1%(v/v)的冰醋酸水溶液中，得到4%(w/v)的CS醋酸溶液，3000r/min离心30min除去杂质即为CS液，密封备用。称取一定量槲皮素于乳钵中，滴加少量无水乙醇搅拌，溶解后加入上述醋酸壳聚糖溶液，使其浓度为1%，充分搅拌即成复合膜液。用流涎法于玻璃板上制成膜，室温自然干燥后，起膜。在紫外线灯下灭菌15min，用直径04cm打孔器制成原型

6、膜片(其中槲皮素含量02mg/每片贴膜)，包装密封，其中不加槲皮素为CS对照膜。143分组和给药造模后第2天将所有口腔溃疡大鼠随机分为基质组(CS，不加槲皮素的膜，8mg/每片)、复合膜(QUCS，02mg/每片贴膜)组、冰硼散(BPS，每溃疡面02mg)组和空白对照组(control)，并开始给药，单笼饲养。对照组不采取任何处理措施;基质组动物在溃疡处贴CS膜;槲皮素与壳聚糖复合膜组贴QUCS膜;冰硼散组在溃疡处喷洒冰硼散。各药均2次/d，即上午8:00和下午5:00各1次，直至溃疡完全愈合为止。144QUCS对大鼠溃疡局部充血水肿程度、感染情况影响拍照记录溃疡愈合情况，记录每只鼠溃疡完全愈

7、合时间，计算各组平均愈合时间。用透明胶片画记创面大小，计算创面面积，以判断愈合速度。平均愈合速度(mm2/d)=最大溃疡面积(mm2)/治疗时间(d)2。溃疡周围水肿，充血程度:度:充血直径1mm;度:充血直径12mm;度:充血直径2+4mm;度:充血直径4mm。145QUCS对大鼠溃疡处组织病理学影响大鼠于给药4d(造膜5d)各组随机取5只脱颈处死，切取溃疡处病变组织，4%中性甲醛液固定后，用乙醇脱水，经二甲苯透明后，再浸入已融化的石蜡中进行浸透、包埋。用切片机切成5m的薄片，贴于载玻片上，脱蜡，常规HE和马松染色。于切片上滴加中性树胶，并用盖薄片进行封固，显微镜下观察、拍照。组织学评价为记

8、录炎细胞数、坏死及溃疡等。疗效判定分级标准:根据口腔黏膜损伤程度定出5个分级，镜下按半定量评分法评分，每张片连续观察10个视野(200倍)，求其平均值，其标准见下。0级:口腔黏膜无炎细胞、坏死及溃疡等改变;1级:口腔黏膜有少数炎细胞，无坏死及溃疡等改变;2级:口腔黏膜有较多炎细胞，无坏死及溃疡等改变;3级:口腔黏膜有大量炎细胞，部分有坏死，但无溃疡等;4级:口腔黏膜溃疡形成，有坏死组织及肉芽组织。146数据处理所有数据用SPSS130统计软件进行分析。结果以x珋±s表示，组间均数比较采用方差分析，以P005为差异有统计学意义。2结果21QUCS对大鼠口腔溃疡模型溃疡愈合速度、水肿充血

9、程度及表面感染情况的影响造模24h(1d)大鼠双侧口角处黏膜可见直径约4mm×35mm的溃疡形成，略凹陷，表面灰白色，周缘充血水肿，触痛阳性。2d(用药后1d)，对照组溃疡面积有扩大，充血水肿均较重;各给药组也有不同程度扩大，但多不明显，组织水肿轻于对照组，以QUCS组较轻。3d(用药后2d)空白对照组溃疡表面坏死，有假膜生成，覆盖于溃疡表面，并明显严重于各给药组。45d(用药后34d)，溃疡表面假膜开始有脱落，假膜下组织创面暴露，部分溃疡面开始愈合，给药组创面愈合明显好于对照组，QUCS组溃疡面积明显小于对照组。67d(用药后56d)，溃疡明显好转，溃疡面积明显缩小，各给药组愈合情

10、况明显好于对照组;QUCS组用药6d多数大鼠溃疡完全愈合，BPS组溃疡愈合快于CS组。治疗10d后对照组多数大鼠溃疡完全愈合。QUCS使溃疡愈合时间由10d缩短至6d。各组大鼠溃疡愈合速度、水肿充血程度及表面感染情况见图1和表12。22QUCS对大鼠口腔溃疡模型组织形态影响大鼠于给药4d(造膜5d)各组随机取5只脱颈处死，切取溃疡处病变组织，HE染色切片显示:对照组炎症反应较重，上皮坏死脱落，有出血灶，炎细胞浸润明显;QUCS组和BPS组见少量炎细胞浸润，出血灶少，可见新生的成纤维细胞和许多新生的小血管;CS组介于QUCS组和BPS组之间(图2)。按半定量评分法评分，每张片连续观察10个视野(

11、200倍)，求其平均值，其分值见表3，分值最低者为QUCS组(与BPS组相近)，最高者为对照组。3讨论目前，口腔溃疡动物模型制作方法主要有辐射诱导3，免疫法诱导4，细菌感染诱导5，创伤性溃疡模型6等，其中免疫法模型的病理及临床表现最接近复发性口腔溃疡，但该方法造成全身免疫系统紊乱，可能同时造成胃黏膜及其他组织溃疡及损伤，影响进食及其他身体功能，且溃疡部位不定，不便于观察测量，因此本实验采用创伤法，NaOH晶体圆片在大鼠双侧下唇靠口角黏膜处烧灼6s，生理盐水冲洗后制备口腔溃疡模型。该方法具有定位准确、大鼠溃疡直径大小一致、便于观察及测量的优点。口腔溃疡是口腔黏膜中最常见的疼痛性疾病，具有周期性及烧灼性疼痛的特点，且复发率高。目前，口腔溃疡的治疗主要以局部为主，但由于口腔环境复杂，药物在口腔溃疡表面常被唾液、食物等稀释，使药物的使用疗效受限，而全身用药治疗效果也不理想。近年随着对槲皮素的研究日益增多，发现槲皮素有抗氧化清除自由基、抗肿瘤、镇痛、抗炎、抗菌、抗病毒、增强免疫及保护心血