有关物质方法学验证pdf

1、有关物质方法学验证(HPLC法一、检测波长与流动相条件的确定。一般有国家标准的并不改变国家标准,可直接参照国家标准,可不做。确实有需要的,检测波长一般用紫外扫描确定,流动相可以多种流动相比较确定,选取其中最合适的。二、系统适用性取样品,按照有关物质供试品浓度配制溶液,进样,记录图谱。理论板数应符合规定,分离度应大于2.0或符合规定、拖尾因子应0.8-1.2或符合规定。有已知杂质并且杂质对照品可获得的:配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析,该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%,保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外,理论板数应符合规定,分离度应大于2.0或符合规定、拖尾因子应0.8-1.

2、2或符合规定。三、专属性1、空白溶剂干扰试验。取溶解样品用的溶剂,注入液相色谱仪,记录色谱图。观察溶剂图谱情况。有辅料的,做空白辅料试验。2、降解试验降解对照品溶液:取样品,按照有关物质供试品浓度配制溶液,进样,记录图谱。高温降解溶液:取样品,按照有关物质供试品浓度配制溶液,于一定温度水浴中放置一段时间,补充溶剂至刻度,滤过,进样,记录图谱。酸降解溶液:取样品,置量瓶中,加入适量流动相溶解,再加入少量一定浓度盐酸溶液,常温放置或于一定温度水浴中放置一段时间,取出,冷却,加同浓度氢氧化钠溶液调节p H值至中性,再加溶剂稀释至刻度,滤过,进样,记录谱图。有辅料的,做空白辅料酸破坏对照。碱降解溶液:

3、取样品,置量瓶中,加入适量流动相溶解,再加入少量一定浓度氢氧化钠溶液,常温放置或于一定温度水浴中放置一段时间,取出,冷却,加同浓度盐酸溶液调节p H值至中性,再加溶剂稀释至刻度,滤过,进样,记录谱图。有辅料的,做空白辅料碱破坏对照。过氧化氢降解溶液:取样品,置量瓶中,加入适量流动相溶解,再加入少量双氧水,常温放置或于一定温度水浴中放置一段时间,取出,冷却,加溶剂稀释至刻度,滤过,进样,记录谱图。有辅料的,做空白辅料氧化破坏对照。3、中间体、降解物、已知其它杂质与主成分的分离度试验及定位试验取中间体配置成一定浓度,进样,记录图谱。取降解对照品溶液,加入少量中间体,进样,记录图谱。取降解物配置成一

4、定浓度,进样,记录图谱。取降解对照品溶液,加入少量降解物,进样,记录图谱。取已知其他杂质配置成一定浓度,进样,记录图谱。取降解对照品溶液,加入少量已知杂质对照品,进样,记录图谱。可接受的标准:空白对照应无干扰,主峰与杂质峰应完全分离,已知杂质峰与其它峰应能完全分离,分离度不得小于2.0。四、检测限与定量限一般采用信噪比法。取对照品,加溶剂稀释至很小浓度,进样,记录图谱,观察信噪比。信噪比10:1,为定量限;信噪比为3:1,为检测限。有已知杂质并且杂质对照品可得的,须用已知杂质对照品同时做。可接受标准:杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外,配制6

5、份最低定量限浓度的溶液,所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%,峰面积的相对标准差应不大于5.0%。五、线性关系试验取对照品,配制成一定浓度(大于自身对照浓度贮备液,精密稀释,或分别精密称样,制备一系列被测物质浓度系列进行测定,至少制备 5个浓度。上述被测物质浓度系列,以自身对照溶液浓度为中间浓度,向两边梯度延伸。比如先配制成自身对照溶液浓度两倍的溶液,分别量取3、4、5、6、7m l置10m l 量瓶中,即得到相对浓度为60%、80%、100%、120%、140%(相对于自身对照浓度的系列溶液。取该系列溶液进样,记录色谱图,计算回归方程。若有已知杂质并且杂质对照品可得的,则取

6、已知杂质对照品另作线性关系试验,供试品中已知杂质峰面积,应在线性范围内。一般,此类线性关系试验浓度从定量限浓度起,至杂质对照品溶液浓度的120%或更高。可接受的标准为:回归线的相关系数(R不得小于0.9990。六、精密度1、重复性无已知杂质的。取样品,配制成自身对照浓度,由同一人员在相同操作条件下,连续进样6次,记录图谱,计算r s d。有已知杂质的。取杂质对照品溶液,由同一人员在相同操作条件下,连续进样6次,记录图谱,计算r s d。可接受的标准为:r s d不得大于2.0%。2、中间精密度A、取样品,由不同人员,在不同时间,使用不同仪器,按照测定法测定同一样品的有关物质。计算检查结果的R

7、S D。R S D不大于2.0%。可以5名人员分别使用5台仪器,于不同工作日测定。仪器也可3台。B、配制6份杂质浓度(一般为0.1%相同的供试品溶液,分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试。R S D不大于2.0%。七、溶液稳定性取供试品溶液,规定条件下放置8小时,分别于0、2、4、6、8小时进样,记录色谱图,观察主峰峰面积变化并计算R S D,观察主要杂质及总杂质峰面积变化并计算R S D,观察是否有新杂质。确定溶液是否稳定,不稳定的应注明立刻进样。取自身对照溶液同法测定。有已知杂质的,应另取杂质对照品溶液同法测定。八、准确度一般以回收率试验进行验证。无已知杂质的,可不做。有已知杂质

8、的,须做加样回收试验验证准确度。例如某杂质的限度为0.2%,取已知杂质含量的样品适量9份,分别加入0.1 %、0.2%和0.3%的杂质(各三份,稀释到有关物质供试品溶液浓度。每个样品进一针,记录色谱图。另取杂质对照品,按照标准配制成杂质对照品溶液,进样,记录色谱图。计算回收率。该项目的可接受的标准为:各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间,如杂质的浓度为定量限,则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%,相对标准差应不大于10%。九、耐用性分别考察流动相比例变化±5%、流动相p H值变化±0.2、柱温变化±5、检测波长变化±5n m、流速相对值变化±20%以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时,仪器色谱行为的变化,每个条件下各测试两次。可接受的标准为:各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0,杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离;各条件下的杂质含量数据(n=6的相对标准差应不大于2.0%,杂