烟草核心种质DNA遗传多样性研究_图文

1、中国农业科学院硕士学位论文烟草核心种质DNA遗传多样性研究 姓名:刘建丰申请学位级别:硕士 专业:作物种质资源学 指导教师:王志德20070601摘 要采用SRAP标记分析了米白烤烟、舾晾烟、白肋烟、香料烟、黄花烟和野生烟7种不同类型 烟草110份烟草种质的遗传多样性,并进行了聚类分析。主要结果如F:烟草种质的聚类分析表明.7类烟草种质资源各自聚在一类或者亚类中。烤烟.晒晾烟、白 肋烟、香料烟、雪茄烟、黄花烟和野生烟7类材料问具有一定的遗传差异,但同种类型烟草内部 的遗传多样性较小。8l份静通栽培烟草种质Dice遗传相似系数在0.57O.99之问,烤烟、115晒 烟、白肋烟、香树捆和雪茄烟类群

2、内的遗传相似性系数较人,在O.91730.98952同;黄花烟和 野生烟与其它类型间的遗传相似性系数较小,在o.64850.7929之间;81份将通藏培烟草的平均 多样性指数(h为0.2586,Shannon信息指数(I为O.3795,表明烟草种质的遗传相似榉度较 高,亲缘关系较近。研究结果还表明,野生烟草的遗传多样性与地域存一定的相关性,而栽培烟 草种质问的遗传多样性与地理来源相乏性不明显。关键词:烟草,种质资源,核心种质,逛传多样性,分子标记,SR怠PIlAbstractThe genetic diversity among l 10tobacco varieties iududlng f

3、lue-cured tobacco。sun/air cured b3bacoo.burly tobacco,oriental tobacco。rustlca tobacco and wild tobacco wel'e assessed衄SRAP markersAn optimized PCR reaction systcnll for SRAP analysis was established:PCR was performed in a 251_i1reactionmixturewithDNA(200ng/FI1.5FI PrimerI(100retool趣11plt Primer

4、2(100mmollpJ1me 29wild toband 81common cuhivatod tobacco varietias/linas were amplified时Ig SILP primers selected from 160prilllcl-s In the J 10tobacco cultivatedvasieties/ines,The oumlml-of polymorphic bands amplified by 18primers in wild tobacco and common tobacco was 206and 3085, andthe averagefor

5、per-primerwasl82bands.The ratioofpolymorphicbands(PPBwasl00%and 44.7%respectively.Only orle primer call distinguish the common tobacco from rustica tobaoco.That ;ndicatodSRAPmarkerswere suitableforthe studyofgermplasm diversity.The UPGMA cluster based oil SRAP indicated that the.same type tobacco co

6、uld approximately elust日together.there Wg￥some genetic diversity among 7dilfferent type tobacco.hut therelationship.The result also shows wild tobacco%related to theirorigin.but thecultivated tobaccogermplasm relationship wnot obvious.Key word:Tobacco,Germpbm,Core germ#am,genetic dIve礴i劬molecuhr mar

7、kers,SRAP lIl独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知,除了文中特别加以标往和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包古为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。研究生签名:;-随丰 时间:7年占月7R关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定,即:中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位

8、论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学盥论文的全都或部分内容。研究生签名:面谢 时问:翮年6月纠R 导师签名 熟静 时间:zt,7年月五/R1.1烟草种质资源概述第一耄文献综述烟草在植物学分类上属于双于叶植物纲(Dicotytedoneae、管花目(Tubiflorae、茄科 1Solanaceae,掴属(Nicotiana。烟属植物人多是草本,少数是灌术或争乔术状,为一年 生或多年生,大多数植株有茸毛。主摹从十儿坦米剑数甘厘米不等。nf弛斧异较人.主要有 椭锄型、卵倒形、披什形、心形几种,有的有叶柄、有的无叶柄但叶基部抱苹成侧翼状。花 序有聚伞、总状、复总状(圆锥状

9、儿种类璎,花色有黄、绿黄.白,粉红、红、紫或置备 种花晕,花萼管状或钟状。五裂,花麓管圆筒装,&5.100ram,花冠口五裂,每肇花有雄 嚣5枚,雌蕊l枚,子房2室或4室。果实为蒴果,每个蒴果约2000粒种子。烟属植物大 多数都能产生一种特有的植物碱一烟碱,含量O.50/0-10%.烟碱是烟草中最具有生理作刚的 物质,烟碱含鼙的多少直接影响烟制品的香吃味事i劲头.现今烟草的分布几乎遍布牲界各地,世界上至少有97个国家和J地医都有烟草戡螭 (Akehurst,1981。目前全球的吸烟人数为15亿左矗,世界卷烟年销Ii额接近4000亿美 元,全世界约有1.8亿人完全或部分地依靠烟草行业诞生

10、。烟草及烟草制品作为特殊的肖费 品,成为世界备国政府财政收入的重要来源之一<郑新章辞,1997k烟草作为一种流通性 极为广泛的商品,正像世界各地居住着箨种肤色的人一样,fII=界各地生产的烟叶种类也是备种各样.而且它啊j各白反映了本国的特色。全世界虻集起来的划草形成r一个具有国际色彩 的.|l!|革市场,烟草的产地以畦洲为中心,遍及了南美洲、北荧洲、1F洲及东欧的r人地厦. 烟草大约r明朝万历年闻(15731620传入我国。起初栽培的都延晒晾烟,二十世纪 初才开始有烤烟的传入和就培(苏德成,2005。烤lIl在我国的种植时间虽然不长,但由于 人耵I吸li和卷iII J:业对原料的需要,烤

11、烟生产发展迅速.日前我国烟草种植面积帛l总产譬均 居世界首位。是名副其实的烟草生产人国。烟草作为一种重要的经济忭物,在我国的国K经 济中具有重要地位。袭I-I烟草量分娄表Table I-1Classifiealion ofNicotianagenus畦属 纽 种 仆卸I施染色体麴日 Subgenus Section Species Chromosorac Numbers 黄花烟草 圆锥懈草 粉蓝烟草glauca 24Rusti晤PaniculataE 嘲锥悃单paniculata 24奈特氏捆草hi曲t赫8窖抽州悃草solanifolia Z叭纳求特氏烟草bcnavid露ii ;j,brq烟草

12、rdifolia24攮穗献稍草Thyrsiflorae黄托稍草Rustiea普墒烟草 绒毛烟草Tomen蛳lauacum殛牵牛状 烟草 Petunioid嚣酱通柙I草Genuina拔叶娟草undulatac三角叶烟草Trigonophylla且厦烟草Alatac夜艟烟草Noetiflorae毕堆劳氏烟草Bi鲥删钿1衅裸茎烟草Nudicau|cs番裂德氏悃粤raimondii拟秘状蛔早thyrsiflonl嚣拒烟睁rustica绒毛烟草mmdntosa绒毛扯胡革tommtosifmmis耳扶烟草otophom卡瓦卡米氏j月阜kawakamii褰特氏烟草sctc,hellii粘烟草glutinos

13、ll普通恫草tallaeum波叶烟草undulata河伦特氏烟掌m、entsii三角叶炯荦trigonophylla林捆单sylvcstris蓝料斯多大烟草langsdorff具露姗草alata编a:古特氏捆草forgetiana博内毕烟草bonaricnsisK花烟草Iongiflora蓝苯莉叶烟草plumbaginifolia残渡旧筚rcpanda新托克逋氏朋学stoektanii岛生堋氍nesopIIila瘦花棚辑noetiflora矮牵牛献炯挚ptunioides无茎炯草acaulis阿米摹诺氏烟瞽amcghinoi渐尖n|,炳草minala少托悃卓pauciflora渐犹nI娴午at

14、icnuataK苞烟草Iongibractcata峰两氏煅草miersii伞睐烟草corymbosa麸叶jl草lineatis24 48 24 24 24 24 24 24 48 24 48 24 24 24 ls lS 18 18 20 20 48 49 49 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 48 48 43 36 462蒋r基巾硝烟草鼎朴伍埠'1997Jl-1.3烟草的演化形成荚丁:烟届原产地的论豇E曾有不同的看法.有的历史学者推断烟草原产中国,即远在冰河 时料从弧洲传剑北美洲的阿拉斯加,以J斤从北美IfI传创南美洲。也有人认为,.IlI|草

15、是由1F洲 传到美洲去的。但这些说法都缺少足够的历史证据,冈此,Il!I草原产美洲一说仍是多数史科 和世界各国烟草专著所公认。考古学的研究表明,烟草(Nicotiana spp.作为一种吸食用嗜好性经济作物,早在公元 前芤世纪美洲人就已种植(蒋予恩。1997。闪为烟届的许多种禽有凡有生理作川的烟碱中闻农业科学院顺I学位论史 第幸立献综述烤熘是烟抒采收肃放丁烤房里,朋火管加热烘干的划叶.故义称火管烤烟。烤烟开始是 在1832年由美翟弗古尼弧人塔克(GTuck发明的,内而义称为弗占尼弧弛烟。烤烟的植 株高大,一般株高120-150cm,叶数20-30片.分布较稀疏而均匀。叶片厚游适中,中部叶 片质

16、量最好。州片白下而上成熟,分次采收。烤后的烟叶桔黄。晒烟是指采收后利_【j阳光晒干的烟at。根据晒后叶片的颜色X分为硒黄烟莆l晒红烟。晒 烟可用作斗则、水划、卷烟.雪茄烟、鼻烟和嚼烟等的原科。我国种植晤烟有四卣多年的历 史.经验丰富,各地烟农创造山许多的独特的栽培和调制方法.加l:成异且特色的产品。如 四川什邡的“毛熘”.江蹦,¨丰的“紫老烟”,山采沂水的“缨子倒”。占林蛟河的“关东烟”罅孳。 晒烟一般叶数较少,叶肉较厚,需氮肥较多.分次或一次采收,晒历多毕棕色或深棕色t一 般以顶部叶片质鼙最佳。烟叶含糖肇偏低,虽自质和烟碱龠茧较高,田此烟味浓,劲头人4中田农业科学院硕l+学位论义

17、第一市空献练述这些种质适应当地的环境条件,只有人盯J喜爱的香气和l吃味,有的抗某些病害和虫害,在育 种上有重要的使川价值。晾烟世指划叶采收后放住阴凉通风的场所晾干的烟叶,包传统晾烟 和马里兰烟。马里兰烟是从美国引进的,属浅色晾烟。nI片人而礴,抗逆性强,适席性厂。, 焦油和烟碱禽蕾低,阴燃性抒.填充力强,是混合型卷烟的良好配料。由丁:我国种植晒晾烟 时问长.遍布全国各地,在多种复杂的环境条件影响和人.【:选择下形成了异常丰富,备具特 色的种质资源,现收集保存有1900多份。这些种质适应肖地的环境条件,具有人们喜爱的 香气和吃味,有的抗某些瘸害和虫害,在育种上有重要的使价值(蒋予恩,1997.白

18、肋烟是马里兰烟的一个突变种。1864年住美国俄亥俄州布朝县的乔治韦勃农场种植 马里兰型阔叶烟的苗床里发现的缺绿突变抹,后经专广J种植,证明具有特殊使刚价值.从而 发展成为烟草的一个新类型。白肋烟的主要特点是苇杆和叶片土脉墨乳白色.叶片黄绿色,叶绿幕含量低,其它性状 与马里兰烟相似。自肋烟的烟碱和总氯耸比烤烟高,含糖颦低。叶片较薄。弹性强,组织疏 松。白肋烟作为一种独特的烟草栽培类酗,除在卷烟jC业中有较高的使_【14价值外.在烟草育 种中也有其它类型烟草所不具备的一些优势。例如.在从烟草野生种向裁埔种转移抗野火痛 基闪的过程中发现,烟草野生种的抗野火病性能可以锻快在自肋型烟草内稳定下来。但在烤

19、 烟耻和雪茄型内却没有出现一个稳定韵抗野火病品种。田而白肋荆烟草作为从野生烟草向其 它栽培烟草类玳转移抗病基冈等方面具有桥梁亲本的作崩。目前有些白肋烟种质往我国烟草 育种上起了重要作用,如白肋21不育系的不育性已转移判烤烟.晒烟和香料烟,培育|山一 系列不育系和杂种一代在生产上推广利I;I。烟草野生资源是插烟草属中除了普通烟草和黄花烟草这两个裁培种以外的所有烟草野生 种,目前有“个。这些野生种术被人们人面积栽靖过.无商业价值。但这些野生种兵有不6中阿农业列学院礤卜学位论正 铝一币艾献综述同的特性,特别是有些抗病虫能力比较盟,是就培烟草所没有的.可以利H|传统的远缘杂交 或现代生物技术加l;【利

20、川。有些抗病基冈己转移劁戡培烟草上.选育山抗病品种。如通过 N.,46聊×.glutinosa杂交多倍伟和对此鲕台反复同交获得抗臀通花f.病品系;坩 .tabac知,a的同源四倍体与J longiflora杂交获得抗烟草野火病的品系:用警通烟草与 .otophora杂交提高了静通烟草的抗病能力;M/abacumxN.gossPi厉得皇4抗烟蚜的厉代. 而抗白耢病的烟属野生种.嗍日肼出,i11.Iongiflora枉法国也进行利瑚。印度中央烟草所 通过.benthnina,-glutinosa和_譬通烟草.tabaeaum杂交,育出抗烟草斜纹夜蛾的 烟草品种。有些野生种如.alata、

21、N.glauea花色艳丽,气味芳香.己作为观赏植物有少 量种植(苏德成,2005。1.2烟草种质资源的研究内容丙酮溶液、催芽回干和脱水等都可以在一定样度上蜒K种子活力,尤其以GA3丙酮溶液 (50mg/kg效果晟好(孙学永等,2004;J。永乐等t 2004;还有研究发现青霉暴和菜莉 酸等也可以显苦提高种子活力(韩锦锋等。1999;张燕蒈1999。收集和保存种质_巅源研究的第一步,对收集的种质资源进行有效的鉴定币I评价是种质r 佧的重点。种质资源I:作的最终目的与门宿,在丁为生产、科研、特别是育种服务。通常种 质性状的鉴定包括植物学,农艺、品质、抗性等不同方面。在jl|草学上,烟叶的化学成分是

22、 十分重要的指标(牛佩兰等,1992,施红林,2003。从国外引进的晶种首先要在专门设苴 的鉴定锄内进行鉴定,以确定有无检授性病虫害,而后蒋来进行农艺性状t包括产鲑性状鉴 定,品质性状鉴定、抗痛虫害鉴定、抗逆性等鉴定。中国农业科学院烟草研究所对收集保存的烟草种质进行了J+泛的研究。筛选出了一批综 合性状好的品种,建立了比较完备的烟草种质档案。卢江平等(1997把聚丙烯胺凝胶电泳 应用到了烤烟品种的鉴定中。另一方面,对一些特殊的烟草种质资源还要结台一般性状鉴定-进一步研究特异性状的遗传率,基因型效应、遗传田子数、配台力和杂种优贽等,以便更台 理的利Jj种质资源(陈学平等.1995;许明辉等,20

23、00.许美玲等(2001在19962000年问收集并鉴定评价烟草国内鼎种(系60个,国外品种(系90个.通过多年的鉴定评 价.缔选出优异种质K346、RG/l、RGl7等在云南省和全国范同内摊r使Jj。何川生等(1998 对云南地方晾晒烟品种资源经过历时5年的普查,从中筛选出15个有趣好利Jj滞耆力的晾晒 烟特异地方品种.供育种单位选择利坩。王素葶等(2001对302份河南省烤烟品种瓷源进 行农艺性状及抗性鉴定、综台评价,鉴定il:30份备凡不同优异性状的种质,并提出了优异 种质在生产上的利用设摁。 烟草抗性方面的研究较多,现已鉴定山一批对TMV,青枯瘸、根结线虫瘸等具有抗性 的品种(潘建菁等

24、.2004;许美玲等.2004:巫升鑫等,2004i丰年等.2000:于静等,2001. 据蒋予恩等(2001统计,1990年以来我国已鉴定烤jl!j品种3541份。包括生育期测定2132份次,农艺性状的鉴定945份资历,农艺性状的鉴定1352份次。经济指标测定845份次.田问 自然发病率情况调在1453份次.以及原烟外观观测523份次,内住化学成份测定3245份次。(I地方优良品种的利朋地方优良鼎种只有适应当地环境条仆和1人们喜爱的吸Hj价 值,在生产上得以妊期的推广和利HI,尤其是晒晾烟更是如此。如四川“贞烟”的主栽品种睁 铁泡、红花铁杆子;吉林的“荚东.IIiI”土栽黼种红花铁矮子、八人

25、香;甘肃水烟”的士戴品种 大州烟,小叶熘菩。(2国外优良种质的利“|国外种质对发展我国的|崩草生产做出了重要的贡献。如肮 美国引进的烤烟优质鼎种NC82、NC89、K326等品种,一度成为我国的土栽品种.优异种质的发现和利用对培育烟草新品种,促进烟叶生产发展有着积极的作用。如我 国通过系统选育从人金元品种中选出fI勺红花人金元。白20世纪70年代在生产推,“。至今仍 在人面积的种植使用。国内优异种质金星6007不仅在生产上发挥了巨人的作.在杂交育种和系统育种中也 得到,“泛的利心.埘其傲采本直接或问接选育出的品种共有20多个;抗赤星病种质净叶黄 抗病遗传力高,成为抗赤星病育种的良好材料;具有特

26、殊香气的种质人向筋599有旅香味、 且避传力强,用其作采本选育出了86-3002.923041,88-4锋新晶系(佟道儒.1997;贸兴 华等,1994。国外的晶质优良种质如Special400乖】G28,抗病种质抵字101和Ky56以及白肋2l雄 性不育系等在我国的烟草育种中也都发挥了重要件H3(佟道儒,1997。在K期得烟草种植 过控中还形成了许多各具特色,适应当地的气候十壤条件得优良地方融种,如山东的啼州 烟”、河南的“许昌烟”、吉林的“关东烟”、甘肃的“承烟”等都是我国优良的地方烟草种质资 源。1-2.5烟草在科学研究上的利用20世纪70年代,中国农科院烟草研究所利M花药培养进行单倍体

27、育种,选育出单育I 号、2号、3号等新品种,并在当时的生产上推广,走在了世界的前列(蒋予惠,1997。_吴 中心等(1994还利尉花药培养系统选育烟草抗办旱病品系。桦通烟草与野生烟草及烟草近 缘种植物的体细胞杂交已获得有使J;价值的材料:以根瘤农杆菌雨质粒为载体的重组基囡 转移,已获得抗将通花叶病、黄瓜花什J嘀、马铃翦y病毒、抗虫等的转基田植株,利转 基因烟草作为植物1:厂,生产提纯疗效高的药物己取得一定的进展,如生产胰岛索、干扰素,中回农业科学院颇I学位论空 锕一章史献综述抗癌物质、采疾疫苗、抗艾滋病药物和人造血液代_LIj品等(李光炬.2001。美国Scripps 研究所早在1989年就开

28、始研究利刚烟草生产单克隆抗体,获得千代烟叶表达水平高达总蚩 白鼙的1.3%。按此伟算.生产27万癌症患者一年治疗所需渝疗崔内(270kg,只需全美国 烟草种植面积的1%(阵学平等,1997,。种质的创新和种质的利JH可以相互促进协调发展.种质资源的创新主要是通过常规或现 代生物学技术色q新出新物种、新JI1种、新品系和新的遗传材料。种质资i畴|的创新士要有三个 方面采源.第一是通过育种家、翅传学家和生物群学家研究创造出的新物种、新品种、新 品系和新的遗传材料,如烟草单倍体(张修国等,2000:Burk等,1979:Wernsman等,1990 帛I DH群体(蒋予恩,1997;朱惠琴.2004

29、的创造曹;第一二是由不断产生的自然变异获得 特殊的烟草类犁,如香料烟、向肋烟等,第三是品种资源I。作者的创新,郎通过品种问杂交 或远缘杂交等常规或现代生物学技术手段米强化某一优照性状或将某些优良性状进行综台, 有目标地扩大遗传基础,产生育种家易于进一步利用的新的种质资源,如抗黑胫病种质 Flerida301,抗普通花nI-病种质Hotlmes等。种质资源的创新不同于作物育种,而是为育种 服务的,是品种培育的重要组成部分,在现代作物育种中具有十分重要的作朋。1.3烟草种质资源遗传多样性研究方法对遗传多样性的测验,是系统研究生物多样性的基础和前提。在遗传学上通常将可识圳 的等位基网称为遗传标记,用

30、来研究基闪的遗传与变异。随着遗传学和分子生物学的发展. 从19世纪Mendel Hj表现魁性状分析遗传差异剑今天多种多样的分子手段,遗传多样性研 究经历了一个从简单到复杂.从宏观剑微观,从定性划定餐的发展过程(高翔等,2002s姬 广海等,2003。理想的遗传标记主耍虑具备咀下4条标准:(”具有较强的多态性:(2 表现为共显性(Cadominance,冈而能够鉴别出纯台基因型或杂台基田璀;(3对主要的 农艺性状没有影响:【4经济方便,容易观察记载。苎j前遗传标记土要有4种类璎,郎形态 学标记(Morphological markers、细胞学标记(Cytological mm'kers

31、、生化标记(Biochemical markers和分子标记(Molecularmarkers(贾继增,1996.形态学标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状,如株高、穗形、粒色或者芒 毛镩的相对著异(方宣钧等,2001。从形态学或表玳性状米检测遣传变异是最直接也最简 便易行的方法。由丁.表即帚l基因喇2问存在着基冈表达,凋控,个体发育等复杂的中间环仃。中同农啦丰!f学院麒f,学位论文 第争史献综述 I I如何根据表斟上的差异采反映基田碰上的差异就成为坩形态学方法检测逋侍变异的,乏键所 在。通常利埘的表型性状有两类,一类是由一对戚少数儿对墓冈控制的质量性状,另类是 由多对基因决定的数量性

32、状。典刑的形态标记肉眼即可识别科l观察。厂义的形态标记还包括那些借助丁.简单测试卸 可识另q的某些性状如生理特性、生殖特性、抗病虫性锋。形态标记人都由白发变异喊理化诱 变产生.井经过人l:选育.形成具有特定形态特征的遗传标记材科。朋形态学业袁喇性状来 检测遗传变异简单直观、容易观察记载。长期咀来,对物种的分娄及资源鉴定都是以形态标 记为主要指标。烟草的主要农艺性状的遗传土要受加性效应为主。如移般至开花的人数(pandcya等, 1983;prasannaSirahaRao等,1990、株商(Pmsm.nSimhagao荨,】990;WilhirKon等, 1994,攀围(许健等,2004、叶数

33、(fandeya等;1994;陈顺辉等,2004、叶K叶宽(Prasanna ￥imhaRao等,1990;Wilkioson等。1994以及化学成分(Wilkinson等,1994;陈顺辉等, 2004等.此外显性致麻和上位性效应在部分性状的遗传中也起一定的作用。近些年来,利 _Ij形态学方法进行烟草种质资i|;【分类研究的较多。牛佩兰等(1991通过对烟草的5砷化学 成分的分析对30个品种进行了归类。何川生等(2000对104份国内外烤烟晶种按14个农 艺性状进行聚类分析,形成了烤划的系统分类.但是由于形态标记散最少,可鉴别标记基田 有限,另外,形态学标记还会受到环境、生育期等田素的影响,

34、因此在植物遗传育种中的应 用会受到一些雕制。细胞学研究方法利用细胞学特征研究生物遗传多样性的方法是种重要的生物学手段。 在细胞学方法中最常见的是染色体研究,冈为染色体是遗传物质的载体,是基因的携带青, 染色体变异必然导致生物遗传变异的发生,是生物遗传多样性的重要来源。在细胞学方法中. 最常见的是染色体研究.冈为染色体变异必然导致生物遗传变异的发生。染色体变异士要表 现为染色体组型特征的变异。包括染色体数目变异以及染色体结构变异。通过细胞学观察建 立染色体棱型币1带帮分析技术及细胞原位杂交技术,使得在染色体水平上揭示出更多的变异 性(Shishido等,1998。在烟草上,通过胞质融合技术获得标

35、记材料是最重要的手段。早在;993年夏镇澳等就 用烟草与龙葵细胞杂交获得成功,选育出了694-L新晶系。jj茸属内种问的融台研究主要是烤 烟与野生烟问的融台杂交研究(刘宝等,1995:杨其光等.1998;黄文川,2001:孙学水等, 2001;ATanasv等,1999,郑慧琼等(2003成功将革新一号和黄花烟草的原生质体在空 问进行了电融合试验。此外.在烟草中利M单体。己成功地将许多质龉性状基闻定位r染色 体上,并建立了相戍的连锁群(Buck等,979:Werii9111au等,|990.生化标记是指利_lIj植物代谢过拌中的具有特殊意义的生化成分或产物进行晶种鉴定嗣I 遗传多样性标记的技术

36、。与形态性状、细胞学特征相比.生化标记数鼍上更丰寓,受环境影 响小,易于操作,能更§,地反映遗传多样性:但其结果可能会随动植物不同发育时期、器官 及环境而变化.同时遗传位点数链比较少(胡能5等,1985:樊冬丽,2003。烟草中醋酶具有迪传稳定的特性,可以Hj丁烟草牖种的分类和鉴定以及杂交后代的单株 类剩鉴定研究(刘宝等.1995;许明辉等,1997;陈学平等,1998;许明辉等,190%孙学 永等,2001。如SNPS标记(方宜钧等,2001。主要类硝的DNA分子标记的技术特点如表l-2所示。 表l-2主要娄型的DNA分于标记的拄术特点比较j蓬兰。竺兰竺竺竺竺!竺!竺:趣蝴分布僵持

37、n鞲g蚌乳I 整个接f棚整十苹N-R整个基埘组整个墒闻绯整个举嘲组 遗传特点 共硅性 多数娃性捌m共%酣牛共h蹦生刊%睡世性 妊性多态性 中等 较高 较高 高 牧岛 较高 撵们懒堑蹴嚣黯渤删耘捌貔嬲篙特异双-:;1物DNA质量要求 盎=低 1匠 中等 冉 中等 技术难度 扁 低 低 低 向 中等 放特性 通常有 无 老 戈 通常无 七 可靠性 离 低/中荨 商 高 高 赢 耗时 多 少 少 少 岛 少 成丰 搿 艘低 较低 中等 较盎 庸限制性片断陆度多态性(Restriction Fragment嘶舯Polymorphismt RFLP是Bo:.sein (1980提出的分子标记技术,是晟早

38、发展的分子标记。其基本原理是利H限制性内切酶酶 切生物体DNA后,利H撤射性同位素.通常坩P32与喊某些1F放射性(如地高辛等>探针, 与转移到支持膜上的基因纽DNA进行Southern杂交,显示限制性酶切片段的人小,米检测 不同遗传位点等位变异(多态性的一种技术。RF乙P标记具有如卜特点:(1RFLP标记的检测不受环境条什平¨发育阶段的影响;(2 RFLP标记在等像基因间魁共显性的,可以区别纯台基冈璀和杂合基内喇:<3在1#等忙的 RFLP标记之间不存在上傅性效虑;(4RFLP标记静;fr基用组DNA的自身变异.在植物组 织内普遍存在,多态性丰富。目前该标记已在作物基冈

39、定位、主基冈的连锁分析及连锁图谱 的建立等方面得到了广泛庶JJ(贾继增等,1993;Hartl ct a1.1995;zh帅g et a1.,199q;Fukuoka et al,1998:Isobed aI.,2003;Mntsnhiro,2003;刘玉梅等。2003。但RFLP需要人域的 DNA,多态性频率较低.制备放射性探针进行Southern杂交。因此比较费时.对人体健康 有影响,对环境有污染。RAPD(Random Amplifw.afion Palymorphism是由Williams等(1990发明的分子标 记技术。该标记技术是指以一个通常为lO个核苷酸组成的寡核苷酸序州为引物,

40、利用对基 因组DNA随机扩增来鉴别多态性DNA的过程。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳等分离,经 EB染色,可直接检测DNA多态性,并用丁:DNA指纹分析。Coussirat(1994对32个烟草肺种进行研究的结果表明,利刖RAPD标记技术。可以 区分不同类型的烟草品种。许明辉(1998、檗明山(2001君1张-汉尧(2001对烟草品种进行RAPD分析,证明RAPD标记在烟草品种fl勺鉴定、分类以及遗传斧异研究(Coussirat, 1994;许明辉嚣,1998;粱明山等,2001;张汉尧筲,200I,f,厶德,2001都可以麻增。SSR X叫微1晕重复序列(Microsatellile Repea

41、tst是由Zielkiewicz等(1994建立的 一种新犁的分子标记技术。已经证明,真核生物的基冈俎中数布黄人齄的￥SR。同一粪的 SSR可分布于整个基阅组的不同位置上。每个庵位上重复单能的数日及重复单位的序列都可 能不完全相同,冈而造成了每个座位上的多态性。在植物中,Akkaya等(1992和Morgante 婷(1993发现AT重复较AC重复更为普遍。SSR是一种较理想的分子标记,它具有以F 一些优点:多数为共显性遗传,可以检测纯台基田刑和I热台基因型;变异丰富,多态性高:随机均匀地分布在整个基田纽中;可通过PCR迅述测定分柝;所需DNA世少,且对其质 量要求不高:微多引物序iI.l公开

42、发表。易在并实验室,“为传播使用。风此。该技术庄动植物 的遗传分析中得到了广泛的应用。(Weising 1992;Gregan,1994=Plasechkdal.t 1996:Smith ec a/,1997:Bryan etat.1997i震力行等,2000;刘峰等,2000。由于SSR标记的开发成本较人.近年来随着农怍物基田表达序列的不断开发和扩充. 利用基冈表选序列米开发的SSR标记数量日益增多。从EST筛选微甲尾标记的I。作,在许 多物种如小麦(Enjaul et al。2002;李宏伟等,2003;陈军方等,2005陈海梅。2005, 云杉(Schubert etal。2001.苜蓿

43、(Eajaul et a1.,2004.甘蔗(Cordeimetal.-2001,棉 花(李华盛等,2005等中已见报道。目前,有关烟草SSR引物的开发和利用报道较少, Bryan等(1999从普通烟草(N.tabacum L的剐绿体基冈组中开发了部分SSR引物,并 将其应Jl到茄科(Solanacanus植物的多样性研究。杨永霞蒋2005窥接从Genebank数 据库中搜索合成盘Ii草的SSR引物,初步建立了划草的SSR反应体系。1.3,4.4简单序列重复问区(ISSRISSR标记技术是由Zielkiewicz等(1994提山的,该技术检测的是两个SSR 2间的一 段短的DNA序列上的多态性

44、。坩予ISSR扩增的引物通常为16IS个碱基序列.由I4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成.从而保证了引物与基田组DNA中 SSR的5和3,末端站台,通过PCR反麻扩增SSR之问的DNA片段。ISSR在真拔生物中的 分布非常普遍,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR-PCR可以检测剑基因纽许 多位点的差异(Arnmirajuotat.2001:Archakelal.,2003;Danilovaelat.,2003t王建波, 2002,是非常理想的分子标记,可用_】:构建PCR为基础的分子图谱。与SSR-PCR相比, 其引物没有物种特异性。可以和RAPD一样Ij丁辑类植物研

45、究。丁.ISSR-PCR的引物不需 要预先的DNA测序(Gupta et a1.,1994;Goodwin el at.,1997.也止网如此,有些ISSR14中同农业科学院硕1:学位论丘 鼐一章空献综述 引物可能在特定基闻组DNA中没有配对区域而无扩增产物。微Tj屉(ATn在植物中的分 布是最车富的,但由于(1n引物自身可以结合而影响ISSR的扩增(Wangetal.,1994。 ISSR通常为显性标记(Tsumura d aI.1996,早Mendel式遗僖,且贝有很好的稳定 性年¨多态性(FangandRoose,1997。ISSR分千标记已圳丁遗传多样性分析、绘制DNA指 纹

46、幽谱、品种鉴定等许多研究领域,if力锟人(Ngaoka et al,1997:钱韦等,2000;Danilova et al,2003:Tianct a1.。2004.Gilben等(1999和Yang等(1996的研究表明,ISSR 对PCR反应的敏感性低于RAPD,稳定性优于RAPD。SRAP(scq雌nccRelatedAmplified Polymorphism标记是美国加洲人学植物系的“和 Quiros(2001在差苔属植物上开发出的新型分子标记技术,其原理是利埘特定引物对ORFs 区域(Open Reading Frames进行扩增。上游引物长17bp.5端的前10bp是一段填充序

47、 列,紧接着是CCGG组成核心序列及3瑞3个选抒碱基,对外显子进行特异扩增。下游引 物睦18bp.5的前1lbp是段填充序列.紧接着是AATr组成核心序列及3端3个选择 碱基。对内含子区域,启动子域进i特异扩增。闶不同个体、物种的内禽子。启动子及同 隔区长度不同而产生多态性。目前己被成功的应朋于作物遗传多样性分析(FcrriolMal,2003.遗传I鲴谱的构建(Linz etal,2003 关基内的克隆等方面。与其它分子标记相比,重要性状的标记(LiG et al,2001以及相 SRAP的特点士要表现在:它结合了AFLP及RAPD箨白的优点.方便快速。不需要预先知道DNA的序列信息,试验结

48、果可靠,可以快 速获得天鼙的信息,因而菲常适合r品种指纹翻潜的绘制.墙传连锁蹦的构建及遗传多样性中周农业科学院彻j学位论殳 第一章史献综连 I的研究。已经在水稻、棉花、油莱、马铃薯、苹果.相橘类果树、樱桃、梅子、人蒜、葛邑、 芹菜以及水稻稻瘟病的研究中麻J,表现了徇便、高教,产率高、高批显性、重复性好.易 铡序、便r克窿目标片段的特点。Femol et a1(2003对甜瓜的研究表明SRAP比AFLP更 能反映形态学的变异与进化历史。粱景霞等(2005优化了烟草的SRAP反I51体系,证明 SRAP标记可以很好的廊用在jIl草的遗传多样性研究中。1.4核心种质资源的研究的重要意义种质资源是人类

49、JI以选育新品种和发展农业盼坍质基础,作物育种成效的人小.很大程 度上取决于拥有的种质资源的敷量、质鬣和对其性状表现,生理生化基础及遗传规律研究的 深度和广度。育种上突破性成就的取得,大都决定丁关键种质基冈的发现和利朋。隔此,世 界各国非常重视对作物种质瓷源的搜集、创新、整理、保存、研究静l利,为此美国科学家 提出了援心种质(CoreCollection的新概念,坚持”r泛搜集,妥善保存、综合评价、深入 研究、积极创新、充分利Hj”的方针,使种质资源研究取得了重人进展。核心种质,即以最 小的资渊数量莆J遗传重复,最人样度地代表整个遗传资源地多样性,从而方便于种质的保存、 评价与利用。核心种质并

50、不是全部收集晶的简单代表,而是以最少的份数最人限度地代表其 遗传多样性。种质资源的根本价值在于其所蕴藏的丰富的遗传多样性。这促使世界各唇及有 关机构通过备种渠道尽可能全面地l|5【集幕I保存各种米源的神质材抖,以避免遗传资源的丢失 和J遗满。核心种质的构建有助丁.了解现有种质资源遗传多样性的组成特点嗣1分布状况,以及 其潜在的利用价值.进而对于今后种质资源的引种、115集l:作,包括引种方向、引种类型-材料等的确定具有重要的指导作用,可驵减少和避免盲目及重复引种所带来的国家人、财、 物力的浪费。其移:,核心种质的构建可以有敛地加强和实现我们对重点资源的重点保护和管 理,防止和避免优异种质和基田

51、的丢火。第三,核心种质实际上为我们提供了一套规模急割 减少而遗传多样性X十分丰富且具有代表性的样赫集,这使得我押J在现阶段即能够采删一系中围农业科学院顾l。学位论业 第一帚卫献琛述列先进手段和方法有目的、有重点地进行重要性状遗传规律的研究,以及优异种质、基田的 筛选与克隆,避免研究:I:作中的盲目性,从而尽快提高种质资源的研究水平和利_Hj簸率。 事实上,生物体的袁现型是基田啦与环境相且怍Hj的结果,田lfIi个体之间在表现抛上的 变异在鲢人程度上并不能完全反映其遗传筹异.对丁人多数数姑性状来说尤其如此。近年来, 随着分子生物学,特别是DNA分f标记技术的迅猛发展,生物遗传多样性韵检测水平也选

52、 到了一个新的高度。综台利JJ形态、生化及分子水平的遗传信息,才能真正的最人限度的反 应该物种的遗传多样性。与过去的形态标记、细胞学标记及蛋白质标记不同,DNA分子标 记是通过DNA分子上某些位点酶切域增扩片段之闻的著异直接检澳4其多样性。近年爿SSR、 ISSR、RAPD、AFLP等DNA分子标记技术可有效地评价生物的遗传多样性.为构建基于 DNA变异水平的核心种质提供了强有力的l:具。田此.利HJ分子标记技术研究和构建核心 种质,有助于种质资源得深入研究,拽出各种性状的遗传笑系,以少量资源代表人量资源的 遗传多样性。1.5本研究的主要目的和意义目前,烟草种质资源的遗传研究已取得一定的进展,

53、DNA分子标技术在烟草种质资源 的遗传多样性分析和育种辅助选择上的研究也已开始得割席用.随着潮叶生产的发展和对吸 烟与健康问题的关注,对烟叶质晕的要求也越来越高,优质、安全、高抗晶种的培育已成为 日前烟草育种柞的重点。以往对烟草种质资源的研究和鉴定主要是借助于常规的形态学鉴 定、细胞学观察、同酶分析等技术,分子标记特别是SRAP标记技术在倒草种质资源上的 研究虑用在国内外还未见报道,因此将SRAP标记技术麻州r烟草种质资游遗传多样性的研 究中,加快对现有烟草种质资源的研究分析和鉴定评价.有助丁更为准确地鉴定、评价现有 资源,将为烟草种质资源的合理利H|羽I优良新品种的培育提供更可靠的依据和选择

54、手段。 基于以上理论基础,本研究的主要内容和目的如F:(1优化适台于烟草SRAP分析lj匀反应条件,建立烟草的SRAP反应体系:(2选取烟草7种类型110份烟草棱心种质为供试材料.利用SRAP标记技术研究其 遗传多样性,为烟草种质鉴别、遗传分类,鉴定评价年¨亲本台理选配荨提供相关的依据。72.1实验材料第二章材料与方法表2-I 野生烟草材料疆其来源"IPn,le2-IThetypes/ofiginsefwildtobacco uscdintheexperiment编号Code品种Cldtivar 类型Typc 来源0一百nl N.acuminata 野生种Wild typc

55、 芰固2Maff衲is 野生种Wild帅c 纳米比弧3N.africana 野生种Wild type 智利4N.alala 野生种Wild type 尤热冈5N benavldesii 野生种Wildtype t'1奉6N honaficnsis 野生种Wild“pc 秘鲁7N clevelandii 野生种Wild type 踅目8N debneyi 呈f生种Wild type 困斯兰N,g王辛uc4N,glutinosa N,goodspdil N.kawakamii N,knlgIdana N Iongiflora N,nesophilaN aoctiflofaN nudieau

56、lis N,mophomN DaniculalaN plumbaginifolia N quadrivalvis N tcpandaN stocktonilN.suavIcnsH,SylvcsltisN.。mcr,tosaN.tom删tosiformis N.undulalaN,veimina 野生种Wild type野生种Wild晰野生种Wild type箩f生种Wild type野生种Wild type野生种Wild type野生种Wild type野生种Wildtype野生种Wild啦野牛种Wild啪e野生种Wild type野生种Wild帮野生种Wild type野生种Wild噼野生种

57、Wild type墼f生种Wildtype野生种Wild type野生种Wild辟pc野生种Wildlype野生种Wild type野生种WildOrpc硒报廷秘鲁澳大利哑涣人利亚南荚秘普阿根廷趋两哥智利照两暑f南盖秘鲁阿恨廷整两;盱克拉运岛澳人利弧阿报延北部 秘鲁发玻蚺维弧 南羹秘鲁89m附表2-2栽培烟草材料的类型殛其来薄T“hle2-2The卵m埘ofcomnmbacco u鲥面船“PmP2Hicks 烤帮iFlue-c.redtobacco 麓困USA K326烤棚Flue-cur世ltobacco 戈国USAP4NC￥2烤烟Fuhmrcd tobeLcco 美国USA” Nc99辱烟Flue-ced mb8c 楚固USAP6革新童号gcxinsanhai 烤煅Fiue-cuaxlt曲a。 中囝ChinaP7红花盎五hongIluadajinyuaSa 烤炯Fluo_curcd【to.mcco中国ChinsP8永定一母y酣i“留il啪 烤炳FMe-curedtobacco 申田ChinaIx 寸茎j螬c噬tjinymt 烤炯Flue-curedtobacco 中国ChinaPlO 小黄金1025siaohu加jinl025烤炯Fl