生物芯片技术在性病学中的应用进展

1、KKME-专业医学搜索引擎生物芯片技术在性病学中的应用进展 分类 皮肤性病学 研究进展 【性传播疾病新进展/傅志宜主编-北京：人民军医出版社，20099】描述为： 生物芯片技术是20世纪90年代中期以来快速发展起来的分子生物学高新技术，是各学科交叉综合的崭新科学。生物芯片技术目前在国内外都取得了较大的进展，近年来该技术在检测性传播疾病病原体、病原体耐药性突变及性传播疾病的诊断中都得到了广泛应用。 为了使临床医师熟悉生物芯片的概念及其在性病学中的应用，本文综述了近年来国内外在本领域中的相关研究进展。 生物芯片的概念 生物芯片技术是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技

2、术，不仅对基因功能具有重大的基础研究价值，而且也具有明显的产业化前景。生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支持物上的高密度的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分的微点阵。芯片与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号即可实现对生物样品的分析。基因芯片技术主要包括芯片微阵列制备、样品制备、杂交、信号的检测和分析等。蛋白质芯片主要是蛋白质如抗原或抗体在载体上的有序排列，依据蛋白质分子、蛋白质与核酸相互作用的原理进行杂交、检测和分析。从不同的组织内进行活体解剖后取出圆拄状的组织，然后包埋在受体区组内，这样的石蜡块集成体便构成了组织芯片。缩微芯片实验室(lab-on-a-chip)：在固体材质上

3、制造出微型管道网络系统，从而对生化样品进行处理和分析，也称为微型全分析系统。液态芯片又称悬浮阵列流式荧光技术，是基于美国公司研制的多功能流式点阵仪(100)开发的多功能生物芯片平台，它有机地整合了编码微球激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，具有很强的检测特异性和灵敏性，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，也是目前惟一得到权威机构和医学界共同认可用于临床诊断的生物芯片平台，它具有重复性好、信噪比高、没有灰区以及高通量的优点，可同时对一个样本中的多种不同目的分子进行分析，可以在3560min内对96个不同样本进行检测。 基因芯片在病原体研

4、究中的应用 1人免疫缺陷病毒(HIV)Wout等利用DNA芯片对HIV-1感染不同时间后CD4+T淋巴细胞的基因表达进行研究。结果发现感染后一些基因的表达受到抑制，且在24h时最为明显。其中包括与细胞分裂、转录、翻译和剪接有关的基因。然而整个细胞的活性和信号传递却增强了，这与有大量的病毒产生一致。Pastinen等设计寡核苷酸芯片调查300多例HIV感染的芬兰人，同时设正常对照，发现只在对照者中存在趋化因子受体(CCR5)变异的等位基因，而在HIV患者中甘露糖结合植物血凝素(MBL)变异的等位基因发生率特别高，进一步证实MBL变异的等位基因在HIV-1传播中的危害性。黎志东等建立新的HIV亚型

5、分析方法，并检测其特异性及敏感性。HIV-111个亚型及HIV-2的env基因C2V3区一段核苷酸序列，点样于经预处理的玻片上，制备成HIV亚型分析基因芯片，并用其对15份HIV阳性样本进行亚型分析，所得结果与目前常用HIV亚型分析方法即基因序列分析法所得结果进行比较，发现结果完全符合，敏感性高、特异性好，并且具有操作简单、省时、价廉等特点，有望推广应用。温颖等以HIV2个基因型(包括9个亚型)的32株典型性代表株和HIV-2特有的vpx序列的保守序列为靶序列，设计长寡核苷酸探针，并制备成Oligo芯片。样品经随机特异性引物PCR标记后与芯片杂交，PCR产物同时进行测序分析。结果：1例HIV患

6、者芯片杂交结果阳性，20名健康对照者血清均为阴性。阳性标本的序列分析表明，芯片杂交结果符合测序的分型结果。结论：此芯片可初步用于检测血清HIVRNA，并对HIV基因(亚)型进行分析。石向东采用HIV基因芯片对9例HIV抗体阳性母亲所生婴幼儿进行检测，其中阳性2例，阴性7例，与抗体确认结果相比，敏感性和特异性均为100。该方法能够在婴幼儿出生48h即可进行诊断，判断HIV垂直传播的方式，便于干预和治疗。 现在对于HIV检测技术的原理主要是基于蛋白质(抗原或抗体)之间的相互作用。微流控芯片(microfluidicchips)技术具有制备简单、试剂用量少、操作方便等优点，因此在生化分析中的应用越来

7、越受到重视。蒋兴宇等采用静电纺丝技术(electrospinning，ES)制备纳米纤维薄膜，应用于微流控芯片检测HIV。与商业薄膜相比，静电纺丝纳米纤维薄膜具有更大的比表面积，对于被检测物的吸附提高了一个数量级，从而使得检测的灵敏性有很大提高，在1h内就能完成检测工作，使用的试剂为常规用量的几十分之一。这种结合微流控技术和静电纺丝的新芯片系统(ES-microfluidicchip)具有廉价、操作方便、便携、灵敏性高的特点，将推动重大流行疾病早期诊断的研究和产品开发。 2单纯疱疹病毒(HSV)HSV感染诱发一种抗病毒反应，此反应主要与可溶性干扰素(IFN)的合成和分泌相关。Mossman等使

8、用表达19000个人基因序列的芯片技术分析了HSV-1感染人肺胚胎细胞诱发的IFN非依赖性抗病毒状态，结果发现有限的宿主基因被诱导表达，这些基因大多数也可由IFN诱导产生。他们的数据指出一种新的不依赖IFN的细胞内机制的存在来检测病毒的感染。通过HSV诱导和解除系统来解释这种机制，将增加我们对病毒一宿主相互作用的基础生物学的理解，帮助我们合理的设计用于基因治疗的病毒载体。Sting-ley等用DNA芯片技术成功地分析HSV-1转录的整个过程。有效地检测了所有病毒转录水平且在感染的不同条件下定量病毒的含量。同时利用该技术分析了-27(UL54)基因转录产物在感染突变病毒株细胞内的表达，约在感染后

9、6h其表达水平分3种情况：一种情况为-27基因转录产物表达水平上调或不变；其次为表达水平稍下降；最后一种情况为明显下降。-27基因转录产物在大多数细胞内表达水平上调，提示其主要在病毒感染的早期起调节作用。 3沙眼衣原体(CT)和解脲脲原体(Uu)Ren等利用DNA芯片对CT感染后宿主细胞THP-1基因表达谱的变化进行研究，发现与未感染的细胞比较，感染后细胞中有548个基因上调或下调表达至少2倍。这些基因包括细胞因子、生长因子和信号分子等，从而进一步显示出CT感染后宿主细胞的转录反应可能影响每个生物体的感染周期。Dessus-Babus等设法研究衣原体感染上皮细胞产生的信号，这些信号能触发自然反

10、应和调节多形核中性粒细胞趋化现象；使用cDNA微阵列技术检测了CT血清型E和L2感染的极化宫颈内皮细胞产生的细胞因子；结果发现血清型E或L2感染的Hela细胞诱发一种强烈反应并类似多形核中性粒细胞的化学趋化现象，感染血清型L2的细胞产生大量的白介素(IL-8)和(IL-11)，感染两型均产生中等量的IL-6，但在两型感染细胞培养的悬浮物中均未检测到IL-1和肿瘤坏死因子(TNF-)；IL-11并不影响CT感染的多形核中性粒细胞反应，大量分泌这种抗炎细胞因子主要作用于巨噬细胞，在感染的早期可能使CT逃避自然防御而产生感染。Nicholson等利用DNA芯片比较发展周期中不同时间点的基因表达谱分析

11、CT不同发展时期特异性地转录。时间点选为6、12、18、24、36h，代表的时间与表型的改变有关。微阵列分析检测RNA在相关不同器官中出现，存在一个固有的相关基因表达体系，然而基因的表达量有3倍的改变就是不正常的。他们通过芯片技术在CT生长周期中5个重要的时间点描述CT的转录，为基因的改变提供了一个全面的基因组范围内的描述。李玉叶等为评价基因芯片在检测淋球菌(NG)、CT和Uu中的应用价值，对697例NG检测样本、663例CT检测样本及653例Uu检测样本均用现有临床常规检测(培养法检测NG及Uu，免疫层析法检测CT)、PCR检测及基因芯片检测。以临床常规检测为参照，分析基因芯片检测与临床常规

12、检测结果的符合情况；以临床常规检测和PCR检测为参照，分析基因芯片检测的敏感性及特异性。结果：基因芯片检测结果与临床常规方法的符合率为：NG阳性符合率为992，阴性符合率为979；CT阳性符合率为1000，阴性符合率为972；Uu阳性符合率为845，阴性符合率为971。基因芯片检测NG的敏感性为991，特异性为993；基因芯片检测CT的敏感性为989，特异性为995；基因芯片检测Uu的敏感性为985，特异性为995。结论：基因芯片检测泌尿生殖道NG、Uu及CT的特异性和敏感性均较高，在泌尿生殖道病原学诊断中有很好的临床应用价值。 4人乳头瘤病毒(HPV)HPV感染角化细胞引起增生性损坏。在被感

13、染的细胞中，病毒基因的产物改变了细胞内蛋白的活性，如Rb和p53，从而改变了细胞生长周期。可能HPV基因产物也改变了细胞内基因的表达。Chang等利用芯片技术检测高危险度的HPV31所有基因在表达上的改变。在7075个已知基因和表达序列标签(expressedsequencetags，ES-Ts)测试中，发现HPV31感染细胞与正常的角化细胞比较时178个基因表达上调，150个基因表达下调了2倍或更多。虽然没有特殊的模型可以说明这些上调和下调的基因，但这些基因大致可以分为3类：调节细胞生长的，在角化细胞中特别表达的和在IFN刺激下表达增强的基因。而后他们又对HPV的基因产物改变细胞对IFN的反

14、应机制进行了进一步的研究，发现HPV的基因产物通过抑制转录子(Star-1)的活性来抑制IFN带来的反应从而逃避免疫监视。Klaassen等开发了一种新型高密度寡核苷酸芯片对HPV进行检测和分型，能够对目前53种黏膜型HPV进行检测和鉴别。其中的45种类型可以通过1条单一的种类特异性探针进行鉴别，相反还有8种黏膜型HPV需要通过与探针的特异性结合来鉴别。这种简单的分析模式不需昂贵的仪器，在配有PCR仪的诊断实验室里就可以进行。为探讨宫颈癌、癌前病变、尖锐湿疣与HPV感染的关系，为早期防治宫颈癌提供临床依据，周剑波等在381例患者中采用荧光定量PCR技术对病变标本HPV-DNA进行检测，用上述方

15、法无法明确HPV型别的标本，采用基因芯片技术检测。结果子宫颈上皮内瘤变(CIN) 、CIN 和宫颈鳞癌的标本中HPV的检测率均为100，以HPV16型感染为主，但存在2种以上HPV型别感染，在子宫内膜癌中主要是HPV18，仍然存在HPV多种型别混合感染。196例女阴尖锐湿疣中，HPV阳性率为964，其中以HPV6(444)和HPV11(286)为主，少数患者是HPV16和(或)HPV18感染，也有少数为2种以上甚至四重HPV感染。结论：子宫及宫颈瘤变主要以高危型HPV16和HPV18为主，外阴生殖道的尖锐湿疣以低危型HPV6和HPV11为主，但两者都可合并多种型别的HPV混合感染，给临床治疗和

16、患者机体病理生理改变造成一定的复杂性。为了解尖锐湿疣组织中感染HPV的亚型分布，治疗后原皮损部位的携带情况及性病门诊隐性感染的发生率，黄进波利用基因芯片对1625例性病门诊就诊者进行23种亚型检测。结果693例患者皮损组织阳性率为9365，共检出21种亚型，其中低危型HPV6、11和43出现频率分别为5115、3667和693，高危型HPV16、33、18、31、73、58和59出现的频率分别为1479、647、600、493、477、462和385，单一感染占6749，重叠感染占3251；189例患者治疗后半年内原皮损部位的携带率为5026，HPV58出现频率最高(2421)；743例非患者

17、隐性感染率为1884，共检出17种亚型，低危型以HPV6、11和43为主，出现频率分别为2429，200和786，高危型以HPV16、18、58、35、33、56和59亚型为主，出现频率分别为1786、1000、1000、714、571、571和571，单一感染占7714，重叠感染占2286。作者认为HPV11、6、16型感染是尖锐湿疣的主要型别，HPV58可能是最难治疗的病毒亚型，隐性感染在性病门诊就诊者中较常见。Mendoza-LorenzoP应用一种寡核苷酸芯片检测HPV16有5种突变体。 基因芯片在检测病原体耐药性突变中的应用 Lipshutz等用基因芯片技术筛选HIV-1病毒反转录酶

18、和蛋白酶的突变基因，这种基因突变能使HIV-1病毒对齐多夫定(AZT)等抗病毒药产生耐药。1996年，Kozal等在临床上利用芯片技术研究病毒抗药基因，对102例患者167例分离病毒的基因多态性进行分析，发现美国HIV-1包膜B蛋白酶极其多变，99个氨基酸中475存在变异，而且在从未用蛋白酶抑制剂治疗的患者分离到的HIV-1毒株中也观察到包膜氨基酸的自然多态性，其中许多氨基酸改变与抗蛋白酶抑制剂的抗药性有关。HIV-1蛋白主要变异在于包膜蛋白，这种自然突变对临床治疗与预后具有重要意义。目前，Affymetrix公司开发出一种检测反转录酶基因(rev)的HIV芯片，用于rev各种突变型的检测，因

19、此，人们可以像肿瘤药敏试验一样，预测艾滋病患者对反转录酶抑制剂(如AZT等)的抗性，指导艾滋病的药物治疗。 蛋白芯片在性传播疾病诊断中的应用 Bacarese-Hamilton等曾将蛋白芯片用于病毒感染性疾病的血清学检测。用点样仪将微生物抗原点样，直接测定血清鼠弓形虫、风疹病毒、 型和 型单纯疱疹病毒和巨细胞病毒的抗体，并用ELISA法作为对照，结果显示蛋白芯片法和ELISA法检测的符合率达80以上。因此，蛋白芯片技术能够用于临床诊断，且与ELISA法相比具有高通量、低价格、更便利等优点。西安联尔生物技术有限公司研制的性传播疾病蛋白芯片检测系统可检测HPV6、11，Uu，CT和NG。 应用专利

20、情况 1吴海，肖学葵，孙晓丰，陈秋雯。一种对丙型肝炎、乙型肝炎、艾滋病和梅毒病毒进行共检的基因芯片及其检测方法(CN1405322)。 2王磊，刘丹，许天正，王金忠。检测HIV对反转录酶抑制剂抗性的基因芯片及试剂盒(CN1982473)。 3冯铁建，赵广录，王晓辉，陈琳，石向东。HIV基因检测芯片，其制备方法和应用其检测HIV核酸的方法(CN101045946)。 4周文明，赵建龙，张学军，曹慧敏，杨森，赵辉。泌尿生殖道炎症病原体和耐药性集成诊断基因芯片及方法(CN1570145)。 5毛裕民，谢毅，李瑶。用于感染性疾病乙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、艾滋病病毒和丙型肝炎病毒诊断的基因芯片(CN1310236)。 展望 性传播疾病发病率越来越高，严重威胁人类身心健康，由于引起性传播疾病病原体的种类繁多，其症状及并发症各异，并存在混合感染、耐药等一系列临床有待解决的问题，故对其早期诊断和预防已是当务之急。尽管由于近几年基因诊