云南师范大学毕业论文

1、成人继续教育学院学生（ 科）毕业论文（科研初步训练论文）论文题目 H2株病毒接种量与收获量的 相关性研究 学院、专业生命科学学院 生物科学年 级 2010 学生姓名 岳 俊 指导教师 职称 学 号 107830005 二零一四年十月十五日内容提要：云 南 师 范 大 学毕业设计（论文）H2株病毒接种量与收获量的相关性研究年 级: 2010 学 号: 107830005 姓 名: 岳 俊 专 业: 生物科学 指导老师: 二零一四年十月摘 要 本文采用酶联免疫吸附试验1（双抗体夹心ELISA）检测在人胚肺二倍体细胞KMB17细胞上（以下简称“KMB17细胞”）以不同MOI接种甲型肝炎病毒H2减毒株

2、后得到的病毒收获液，研究MOI与收获液效价之间的关系。通过对5个试验批收获液的检测数据研究表明：MOI与收获液效价之间没有明确的关系。经分析发现：1. H2株接种后随着细胞的分裂而不断增殖并释放少量抗原至培养液中继而进入新的细胞继续增殖。2.感染性滴度的检测：一方面毒种需要进行10倍系列稀释至-8，要求精度较高，另一方面酶联免疫吸附试验操作步骤较多容易造成误差。关键词：MOI； 感染性滴度； 抗原检测；AbstractIn this paper, using enzyme-linked immunosorbent assay 1 (double antibody sandwich ELISA)

3、 detection in human embryo lung diploid cell KMB17 cells (hereinafter referred to as the KMB17 cells) with MOI of different inoculation of hepatitis A virus H2 attenuated virus liquid obtained after harvest,To study the relationship between MOI and harvest liquid titer. Through the show on the 5 tes

4、t batch of harvested liquid detection data research: there is no clear relationship between MOI and harvested liquid titer. The analysis found that: 1.H2 strain after inoculation with cell division and proliferation and continue to release a small amount of antigen into the liquid culture medium and

5、 then enter the new cells continue to proliferate. 2. Detection of infectious titers of virus: hand needs to be 10 fold serial dilution to -8, requiring high precision, on the other hand, enzyme linked immunosorbent assay steps more easy to cause the error.Keywords: MOI; infective titer; antigen det

6、ection;目录本论文的背景和意义5本论文的主要方法和研究进展5KMB17细胞扩增5H2株病毒接种5病毒收获6抗原检测6感染性滴度检测7酶联免疫吸附试验（双抗体夹心ELISA）8滴度尾数查算表8结 论9致谢10参考文献11附录1 KMB17细胞株12附录2 H2株131 本论文的背景和意义现今疫苗已经成为疾病预防的主要手段，降低疫苗的生产成本不仅有利于大规模的推广使用疫苗消灭疾病，还能使疫苗生产企业减少物资的投入，节约资源。在此就中国医学科学院医学生物学研究所（以下简称“生物所”）生产的冻干甲型肝炎减毒活疫苗生产过程中甲型肝炎病毒H2减毒株（以下简称H2株）接种MOI与病毒收获量的相关性进行

7、初步试验研究。生物所从事多年的冻干甲型肝炎减毒活疫苗的生产，病毒收获阶段的效价检测结果有的批次效价高，有的批次效价低，效价高的批次可以更大倍数稀释病毒原液后进行分装。相同的培养条件下为什么各批次间的效价会有明显差异。本论文通过不同MOI接种病毒，经培养后收获病毒原液。用酶标分析仪检测不同MOI所收获的病毒收获液的效价和感染性滴度，以找到生产出高效价病毒原液的最适MOI。意义：生产高效价病毒原液，减少原材料的耗费和人力物力的投入，大幅降低生产成本。2 本论文的主要方法和研究进展2.1 KMB17细胞扩增 从细胞库领取工作种子在37恒温室进行培养，每隔四天按1：2比例进行细胞传代扩增8个细胞工厂。

8、2.2 H2株病毒接种 领取10代H2株工作毒种经超声破碎后按“表1 H2株病毒接种量与检测结果汇总表”所示MOI和五个试验批的细胞悬液进行病毒吸附后分按1:4比例分种,培养温度为35。H2株工作毒种抗原含量为107.67/ml，MOI为病毒感染复数MOI=病毒数/细胞数。为了保证批间差异最小化，细胞悬浮液经混合均匀后分成五个批次再下表MOI加入病毒进行吸附。表1 H2株病毒接种量与检测结果汇总表Table 1 H2 strains of the virus inoculum and detection results summary批号培养面积细胞总量MOI毒种加量ml抗原检测感染性滴度S1

9、6*10*632cm215亿0.288.910247.50S26*10*632cm215亿0.319.910247.34S36*10*632cm215亿0.5016.010248.33S46*10*632cm215亿1.0032.110247.50S56*10*632cm215亿1.5048.110247.502.3 病毒收获 从病毒接种之日起9-12天更换细胞维持液，22-26天按四倍浓缩（5ul/cm2）进行病毒收获并做无菌检查。2.4 抗原检测各批病毒收获液经超声破碎细胞后取样倍比稀释至如下表“表2 抗原检测上样计划表”所示并复孔上样至酶联免疫吸附法检测试剂(盒) 2，设置阴性对照、标准

10、品参考。使用酶标分析仪4检测OD值。检测结果如下表“表3 抗原检测OD值”。Cut off=阴性对照平均值*2.1 =0.236，OD值大于0.236的为阳性，小于0.236则为阴性。结果显示不同MOI种毒收获液抗原检测均为1024（效价相同）。表2 抗原检测上样计划表 Table 2 antigen detection sample schedule123456789101112AS1-32S1-32S2-32S2-32S3-32S3-32S4-32S4-32S5-32S5-32阴性对照BS1-64S1-64S2-64S2-64S3-64S3-64S4-64S4-64S5-64S5-64阴性

11、对照CS1-128S1-128S2-128S2-128S3-128S3-128S4-128S4-128S5-128S5-128阴性对照DS1-256S1-256S2-256S2-256S3-256S3-256S4-256S4-256S5-256S5-256标准128ES1-512S1-512S2-512S2-512S3-512S3-512S4-512S4-512S5-512S5-512标准128FS1-1024S1-1024S2-1024S2-1024S3-1024S3-1024S4-1024S4-1024S5-1024S5-1024标准128GS1-2048S1-2048S2-2048S2-

12、2048S3-2048S3-2048S4-2048S4-2048S5-2048S5-2048空白H 表3 抗原检测OD值 Table 3 antigen detection OD123456789101112A3.6733.5493.5063.3483.7223.8263.5083.6023.4613.3520.134 B3.2143.1082.8172.6433.5513.4313.2803.1753.3263.2490.107 C1.6591.7621.3761.4821.5971.5521.7141.6291.5721.5380.096 D0.8370.9150.6980.7540.83

13、90.7090.9260.8910.8330.8270.362 E0.5240.6070.5330.4190.4030.4790.5810.6270.4980.5040.347 F0.294 0.315 0.349 0.308 0.382 0.297 0.317 0.448 0.372 0.356 0.351 G0.115 0.109 0.142 0.137 0.108 0.116 0.1210.150 0.132 0.140 0.027H注：Cut off=(0.134+0.107+0.096)/3*2.1=0.2362.5 感染性滴度检测从各批病毒收获液中取样1ml分别做10倍梯度稀释至-

14、8，选择-5 -6 -7 -8四个稀释度，各稀释度接种事先传代好的5个T25小方瓶（每个小方瓶加入1ml病毒稀释液），培养至24天进行病毒收获（每8天需更换细胞维持液）。对收获液进行超声破碎后按下表“表4 感染性滴度检测上样计划表”上样至酶联免疫吸附法检测试剂(盒) 2后使用酶标分析仪4检测OD值。检测结果如下表“表5 感染性滴度检测OD值”。Cut off=阴性对照平均值*2.1 =0.257，OD值大于0.257的为阳性，小于0.257则为阴性。结果按“表6 滴度尾数查算表”查找各批滴度并统计到“表1 H2株病毒接种量与检测结果汇总表”，结果显示不同MOI种毒得到的收获液感染性滴度之间没有

15、明确的关系。表4 感染性滴度检测上样计划表Table 4 infective titer detection sample schedule123456789101112AS1-8S1-6S2-8S2-6S3-8S3-6S4-8S4-6S5-8S5-6对照细胞BS1-8S1-6S2-8S2-6S3-8S3-6S4-8S4-6S5-8S5-6对照细胞CS1-8S1-6S2-8S2-6S3-8S3-6S4-8S4-6S5-8S5-6对照细胞DS1-8S1-6S2-8S2-6S3-8S3-6S4-8S4-6S5-8S5-6阳性对照ES1-7S1-5S2-7S2-5S3-7S3-5S4-7S4-5S5

16、-7S5-5阳性对照FS1-7S1-5S2-7S2-5S3-7S3-5S4-7S4-5S5-7S5-5阴性对照GS1-7S1-5S2-7S2-5S3-7S3-5S4-7S4-5S5-7S5-5阴性对照HS1-7S1-5S2-7S2-5S3-7S3-5S4-7S4-5S5-7S5-5空白表5 感染性滴度检测OD值 Table 5 Infectious titer detection OD123456789101112A0.147 3.408 3.257 3.560 0.185 3.362 3.209 3.229 0.108 3.358 0.131 B0.138 3.244 0.115 3.438

17、 3.465 3.518 3.4263.215 0.109 3.391 0.127 C3.52 3.350 0.150 3.591 3.505 3.266 0.133 3.341 3.509 3.287 0.109 D3.4163.445 0.162 0.150 3.524 3.379 0.155 3.338 0.108 3.419 2.175 E3.364 3.219 3.419 3.640 3.511 3.545 0.137 3.513 0.197 3.639 2.230 F0.1573.484 0.168 3.672 3.617 3.622 0.129 3.554 3.448 3.495

18、 0.097 G0.120 3.558 3.382 3.451 3.459 3.471 3.263 3.481 3.520 3.548 0.101 H3.544 3.322 3.408 3.562 3.480 3.515 3.392 3.470 3.285 3.509 0.036 注：Cut off=(0.131+0.127+0.109)/3*2.1=0.2572.6 酶联免疫吸附试验1（双抗体夹心ELISA）加待检抗原 37 120分钟 形成固相抗体-抗原复合物，洗涤五次、抛干加酶标抗体 37 60分钟 形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，洗涤五次、抛干加底物液 37 15分钟显色加终止液用

19、酶标分析仪测定OD值检测结果输出至excel表格2.7滴度尾数查算表5（表6 滴度尾数查算表）查找方法：找到与病变细胞管数相符横列*数字之所在，该稀释度即为 Log10TCID50之整数，加上该横列之尾数，即为Log10TCID50。如 10-5稀释度有4管病变，10-6及10-7各有一管病变，找到左首第三横列即：Log10TCID50为5.83。表6 滴度尾数查算表 Table 6 titer mantissa look-up table各稀释度病变管数尾数各稀释度病变管数尾数4 *0000.543 *00.334 *100.6743 *10.504 *110.8343 *11.5041 *

20、11.0043 *20.7742 *00.00432 *1.0042 *10.23432 *2.2542 *11.44433 *0.1742 *20.50433 *1.3442 *21.75433 *2.56422 *2.004333 *.00结 论五个试验批的抗原检测和感染性滴度检测数据显示MOI从0.28至1.5之间各批抗原检测无差异、感染性滴度检测中只有S3批达到8.33，其余均在之间，感染性滴度检测不随MOI增加而增加，而是呈抛物线形状。结论：MOI和抗原含量、感染性滴度之间无明确关系。H2株培养周期较长，因H2株在KMB17细胞上接种后随着细胞的分裂不断增殖并释放少量抗原至培养液中继

21、而进入新的细胞中继续增殖，所以即使MOI较低也能使大部分KMB17细胞感染H2株，所以不同MOI得到的收获液抗原检测都一致。感染性滴度的检测一方面需要对毒种进行10倍系列稀释至-8，且培养周期比较长（24天），另一方面酶联免疫吸附试验操作步骤较多、要求精度较高容易造成误差。从五个批次抗原检测和感染性滴度检测结果来看可以使用更低的MOI来进行病毒接种。表1 H2株病毒接种量与检测结果汇总表Table 1 H2 strains of the virus inoculum and detection results summary批号培养面积细胞总量MOI毒种加量ml抗原检测感染性滴度S16*10*

22、632cm215亿0.288.910247.50S26*10*632cm215亿0.319.910247.34S36*10*632cm215亿0.5016.010248.33S46*10*632cm215亿1.0032.110247.50S56*10*632cm215亿1.5048.110247.50致 谢生物制品二室生物制品四室质量检定室参考文献1GB/T14926.50-2001实验动物酶联免疫吸附试验2 YY/T 1183-2010酶联免疫吸附法检测试剂(盒)3邢玉兰 黄雪卿 周绍莲 酶联免疫吸附验试抗-HAV IgM试剂盒的研制与应用生物工程进展 1986年03期: 55-564 JJG 861-2007 酶标分析