实验非变性PAGE胶电泳(活性电泳)

1、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)一、实验目的1、了解非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和优势；2、掌握如何活性电泳和染色的步骤。二、实验原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native-PAGE)或称为活性电泳是在不加入SDS和疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生 物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，

2、其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色， 对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性 SDS-PAGE电泳在操作上基本上是相同的，只是非 变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会向阳极移动；而碱性蛋白通 常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带

3、正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离碱性蛋白。三、实验器材与试剂1、电泳仪、电泳槽、离心机等2、 丙烯酰胺、Tris、HCI、溴酚蓝、ABTS等四、实验步骤1、PAGE胶电泳缓冲液配置1) 丙烯酰胺单体贮液：14.55g丙烯酰胺加上0.45g N，N'-甲叉双丙烯酰胺， 先用40mL 双蒸水搅拌溶解，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀至50mL，过滤。用棕色瓶4°C保存备用。2) 浓缩胶缓冲液贮液(0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8) : 3.03gTris溶解在40mL双蒸水中，用 4mol/L盐酸调pH6.8。再用双蒸水稀至 50mL。保存在4

4、6;C备用。3) 分离胶缓冲液贮液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.9) : 18.16gTris溶解在80mL双蒸水中，用 4mol/L盐酸调pH8.9。再用双蒸水稀至 100mL，保存在4°C备用。4) 10 %( AP)过硫酸铵：0.1g过硫酸铵溶入1.0mL双蒸水，使用前新鲜配制。5) 电极缓冲液(0.025mol/L Tris, 0.2mol/L 甘氨酸，pH8.3): 15.14gTris 加上 72.07g 甘氨 酸，用双蒸水稀释到 5L。可在室温保存一个月。6) 样品缓冲液(O.1mol/L Tris-HCl , pH6.8) : 2ml浓缩胶缓冲液贮液加

5、上1mL87%甘油、0.1mg溴酚蓝，用双蒸水稀释至10mL，可在-20 °保存6个月。2、活性PAGE配方分离胶：双蒸水6.6ml30%丙烯酰胺溶液8.0ml1.5mol/L Tris(pH8.8)5.0ml10%AP(W/V)200 TTEMED15円浓缩胶: 双蒸水30%丙烯酰胺溶液1 mol/LTris(pH6.8) 10%过硫酸铵(W/V) TEMED6.8ml1.7ml1.25ml10i|100川3、活性PAGE电泳将玻璃板、胶垫、梳子用双蒸水洗干净，用酒精棉球擦拭，将电泳槽安装好，配制分 离胶(12%)和浓缩胶(5%)如表1。过硫酸铵和 TEMED最后加入，加入后聚合即

6、开始， 应立即混匀倒入两块玻璃板之间。分离胶倒入两块玻璃板间，应该留下适合的高度，使点样孔前端离分离胶有 2.5cm左右的距离，在胶顶部缓缓加入约 0.5cm高的双蒸水，待 分离胶聚合完全后， 倾去上层的双蒸水， 用双蒸水清洗凝胶顶层， 用吸水纸吸去残余的 水滴。将浓缩胶倒入玻璃板夹层，插上梳子，待浓缩胶聚合完全后，拔去梳子，立即用 双蒸水清洗点样孔。加入电极缓冲液，将样品用微量进样器点入点样孔底部，200伏电泳。当溴酚蓝到达分离胶时，电压改为250伏，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。将凝胶剥下，浸泡在100ml的底物液中，染色 1小时，待胶带显色后立即照相。然后将凝 胶进行常规的考马斯亮蓝染色

7、。五、结果与分析记录和观察电泳过程中的温度变化，电泳完后进行活性染色时凝胶有色条带的变化。对 比活性染色和常规的考马斯亮蓝染色后凝胶中蛋白质条带的变化。六、Native-PAGE注意事项1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统；2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度；3. 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率 和其它的蛋白质分开，反之亦然 ；4. 变性样品的离子强度不能太高(