22策移花接木先锋

1、22lncRNA 和蛋白结合的套路模式lncRNA 出现之前，蛋白是无所不能的神，然后 lncRNA 崛起了你才发现你的信仰崩塌了，以前学习的知识全都过时了，必须重新建立世界观号称暗物质新发现的非编码 RNA，尤其是占到主要数量的 lncRNA，被认为是个调节DNA，甚至有不需要蛋白参与的独角戏裹得像个粽子一样，社交能力很一般；而 lncRNA 不受约束，来去自如，搞得蛋白心里痒痒的，很容易跟它擦出火花，动不动就要结合一下子，特别舒服。现在就是这么一个百家的，我们且看他们怎么去折腾，我自岿然不动，所有的这些理解都在无所不能，这样境界就很逍遥了。总结 lncRNA：无所不能。当然也要有的资本，你

2、要是什么也不懂还我自岿然不动，那就是自欺欺人本策叫“移花接木“，就是把之前研究功能、蛋白的套路移植过来，当然带来的是课题创新性显著提升，在这个领域lncRNA 和 mRNA 的差别已经占据了不少地盘。在 natural review genetics 2016 unique features of long noncoding RNA在表型和按照一个可以作用在之间建立一个，先下后上对另一个产生调控的不同层次来分，lncRNA 对的调控一样水平、转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平一共能够影响 12 个DNA 甲基化表达的环节对转录因子和其他的调节蛋白也有作用，分为 recruitment

3、 和抑制当然招募不一定是促进转录，因为可以是招募抑制，那就是负负得正lncRNA 可以直接结合 DNA 序列，这样结合了就能抑制转录lncRNA 可以影响转录中的 RNA 聚合酶的催化活性染色质结构的解开才能进行转录，因为 DNA 是一起的，影响 DNA 结构的组蛋白修饰比如甲基化、乙酰化，这些过程也有 lncRNA 的参与，调节转录。以上 6 个就和蛋白调节转录过程相似。lncRNA 结合 mRNA 影响它的可变剪切。可变剪切是 RNA 调控的一种重要调节方式，可以理解成 lncRNA 可以影响 mRNA 前体的过程mRNA 的蛋白翻译受到 lncRNA 的影响，mRNA 需要经过转运进入到

4、细胞质中进行mRNA 的稳定性也收到 lncRNA 的调节。通过结合 mRNA 的 3UTR 端来诱导降解，这就很像 miRNA 了，居然也把 miRNA 的活给；lncRNA 也能结合蛋白再靶向结合 mRNA，来促进 mRNA 的稳定性。好厉害哈，正反都能干。促进稳定，诱导降解。lncRNA 结合 mRNA 的 5UTR，促进翻译过程；也可以结合蛋白靶向抑制翻译过程。翻译后修饰调节蛋白的细胞在酸谈4 种依据lncRNA 套路课程里面，作用模式的机制模型讲了一套 signal、decoy、signal 信号lncRNA 因为是 RNA，所以可以一转录出来就起到作用，效率比蛋白调控转录高RNA

5、因为一转录出来就在胞核里面，所以一下子就可以调控了lncRNA 就是去结合的 DNA，这样就能调控表达这种自产自销的形式有个专有名词，称为顺式调控，cis Regulationdecoy 诱骗女神被其他男神约走了，你说这叫 decoy，我微微一笑，仿佛看穿了一切你约不到女神不就是穷和丑吗，关 decoy 什么事情上一讲 ceRNA，就是 lncRNA 发挥 decoy 的典型，lncRNA 也能 decoy 蛋白比如转录因子，让它误认为在苦苦等待被翻牌呢。已经结合到了 DNA 序列了，其实并没有，人家还我有个非常男权的思想，因为我就是这么一个性格残缺的人，下我觉得男人忠贞就是收到的 decoy

6、 不够，因为从遗传学的角度来讲，只有把这套交换出去才能延续的遗传信息，而且散播的越广泛对于的抵抗更强。这个观点直到我遇到了，原来这世间也有道德高尚、情操斐然的谦谦君子。有时候学员给我发信息我没有及时回复，不是我很高傲，其实我是被迷人的女学员decoy 了guideguide 是拉着转录因子，另结合 DNA 来引导转录这种三元变量就包括 RNA 和 DNA 结合、以及 RNA 和蛋白结合的两种结合形式lncRNA 算是之前说的那个伴侣，没有它就不能正常进行转录调控出口外销，chains，反式调节，lncRNA 转录出来后去调控另外一个位置的不同于之前说的自产自销。到底怎么区分 cis 和 cha

7、ins 呢？启动子、增强子属于顺式原件，因为它们和 DNA 是在同一条序列上；如果是蛋白来调控那就是反式，因为蛋白是翻译后产生的，不是在一个位置上；lncRNA 可以在附近作用也可以跑到很远一般认为是 1mbps，就是一百万个碱基对距离内的属于顺式调控，cisRegulation。在于是个三结构，所以性距离上距离几千、几万个 BP 可能因为空间结构相互接近。实际研究中一百万个碱基还是太多了，会人为缩小范围。邻近位置的调控也是可以招募蛋白的；同样 signal 一般是调控邻近的，但是位置远就叫反式。lncRNA 充当蛋白骨架，连接多个蛋白。从类型上看属于 RNA 和蛋白结合的范畴，与 guide

8、 的区别就是 guide 需要连接 DNA。20 策，IP、coIP、pulldown16 策，研究蛋白和 DNA 相互作用的染色质 ChIP，染色质免疫共沉淀，把这些实验原理了解后就可以非常容易理解 RNA 和蛋白之间怎么研究，总的来说分为两种情况已知 lncRNA 找互作蛋白已知 lncRNA 找互作蛋白称为 RNA pulldown。捕获 RNA 可以用一根与之互补的探针，探针上人为加上 biotin labeled用 Streptavidin（链酶亲和素） beads 去结合 biotin，这样 RNA 的 bate?就做好了接下来就做亲和层析、换溶液洗脱，结合蛋白再去打质谱鉴定，和蛋

9、白-蛋白相互作用大同小异已知互作蛋白去找 lncRNA用 RIP，就是 RNA 的免疫沉淀，其实就是 RNA 版本的 ChIP，染色质免疫共沉淀用 protein A 的 beads，偶联抗体，抗体结合蛋白，蛋白把 RNA 沉淀下来，然后分析，找到候选结合的蛋白。不做用去做高通量分析也是可行的，这两种技术是筛选也可以做，验证也可以做。用在做验证的时候 RIP 沉淀下来的 RNA 就用定量 PCR 来鉴定； 而 RNA pulldown 下来的蛋白就用 western 鉴定RNA-蛋白结合是目前 lncRNA 的非常重要的方向，而且是高分文章的标配背后的实验原理都是生物素标记 RNA，捕获蛋白然

10、后文章中也会有以下的技术：CLIP（UV crosslinking and immunoprecipitation）或者质谱分析蛋白。ChIRP(chromatin isolation by RNA purification)CHART（capture hybridization analysis of RNA targets）另外一种常用的核酸和蛋白结合的检测方法：EMSA（electrophoretic mobility shift assay）凝胶迁移实验主要原理是：蛋白和核酸探针复合物在凝胶中迁移更慢，我们设计了特异性的同位素探针，把探针和样品蛋白混合孵育，这样就使得蛋白和核酸探针形成

11、蛋白-核酸复合物即 RNA-protein complex，量大迁移变慢，没有结合蛋白的探针跑得快，这样就可以通过条带20 策，提到蛋白组探针与蛋白之间是不是发生了作用。一款蛋白组有预置好的大概两万种全长的蛋白，只需要把 lncRNA 用化学合成的办法或者是体外转录的方法给获取提纯出来，标记上荧光后，和去孵育杂交，这样根据上的探针荧光信号去识别出 lncRNA 的结合蛋白；如果是研究蛋白-蛋白，那就把样品蛋白与进行杂交，原理是一致的。蛋白是商业化，好用不太贵但是这是纯粹的体外结合体系，可能会和胞内不太一样，后续验证的时候会有假阳性的风险做 lncRNA-蛋白，RIP 和 RNA pulldow

12、n 是标配实验，所以用蛋白降低是个假象。lncRNA 和蛋白互作数据库：catRAPID： group实验难度做转录因子启动子的数据库：JASPAR，根据 DNA motifcatRAPID omix 用来某个 RNA 的结合蛋白，或者某个蛋白的结合 RNAlncRNA 基本都来源与筛选，猜几乎不可能，筛选是第一步把筛选出来有差异表达，并且在细胞株验证过、检测过细胞接下来进行一正一反的功能验证，细胞之后是动物。做完 gain of function 和 loss of function 的细胞、动物实验间接机制靠明星通路和蛋白直接机制怎么来做呢？首先看下 lncRNA 的来源类型，其次是亚细胞如果是在细胞核内，先考虑附近的表达有没有受到影响signal 模式lncRNA 的表达差异与哪些邻近的 mRNA 表达有相关性筛选的时候一般是 lncRNA 和 mRNA 一起做的，后面分析 ceRNA 都需要用到如果顺式作用没有找到，核内的 lncRNA 就要考虑反式作用机制，关键是要找到转录因子，去套 guide 或者 decoy 模式，来研究蛋白-RNA