第二章尖孢镰刀菌的生物学特性

1、是不是课题？如果是，请按顺序写出（1）项目来源；（2）具体名称；（3）编号。请写出试验/研究的时间和地点；请按上述意见在原稿上修改您的论文，以便编辑修改！植物保护科学 审稿费已收到项目来源：国家863计划项目资助“茄科作物青枯病和枯萎病生防菌剂的研究与应用”(2006AA10A211)；福建省自然基金资助“黄瓜枯萎病内生生防菌短短芽孢杆菌GFP基因标记及其生防机理的研究”(2006J0068).第一作者简介：肖荣凤，女，1977年出生，福建泰宁人，助理研究员，硕士，主要从事植物病理学及生物防治研究；通信地址：350003 福州市五四路247号，福建省农科院生物技术研究所，Tel：0591-87

2、848933，E-mail: rongfengxiao。通讯作者：刘波，男，1957年出生，福建省惠安人，研究员，博士，从事病虫害生物防治研究，通信地址：福州市五四路247号，E-mail：laeptb。收稿日期：2007-11-26 修回日期：2007-12-07。黄瓜尖孢镰刀菌的营养特性肖荣凤，朱育菁，蓝江林，林抗美，刘 波（福建省农业科学院生物技术研究所，福州 350003）摘 要：【研究目的】研究黄瓜尖孢镰刀菌生长对营养的需求及不同生长阶段的产孢差异，同时筛选一种最适产生小型分生孢子的培养基，为菌株小型分子孢子的收集及利用提供理论基础；【方法】以Bilai's培养基和VBC培养

3、基为基础设计了6种培养基配方，分别为全糖型、淀粉型、低糖型、尿素型、低氮型和VBC型，运用方差分析及聚分析研究了黄瓜尖孢镰刀菌菌落生长与产孢的营养需求及其在不同生长阶段的差异；【结果】研究表明：培养基类型对菌株的菌落生长影响不显著(p>0.05)，但是对分生孢子产量影响差异很大，不同类型培养上产孢量在（1.25-14.60）×106cfu/mL之间。全糖型培养基对菌株小型分生孢子的产生最有利，对大型分生孢子的产生最不利，而VBC型培养基则相反；【结论】促进尖孢镰刀菌小型分生孢子产生的最佳培养基为全糖型培养基，最大产孢量发生在培养11d。关键词：黄瓜；尖孢镰刀菌；营养需求；产孢量

4、中图分类号：S432.45 文献标识码：AEffects of Nutritive Components on Growth of Fusarium oxysporum f. sp. cucumeriumXiao Rongfeng, Zhu Yujing, Lan Jianglin, Lin Kangmei, Liu Bo(Biotechnology Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003)Abstract:【OBJECT】To study effects of nutritive components

5、 on growth of Fusarium oxysporum f. sp. Cucumerium and choose a the optimum medium of microconidia growth, and supply theoretics basis for the collection and utilize of strain microconidia.【METHOD】Based on Bilai's and VBC culture medium, six recipes of cultural medium were desinged. They were re

6、presented with full nutritions of Bilai's medium, Bilai's medium without sucrose and glucose nutrition, Bilai's medium contained half of sucrose and glucose, Bilai's medium substituted carbamide for KNO3 , Bilai's medium contianed half of KNO3 and VBC medium, repectively. effects

7、 of nutritive components on growth of strains by Variance analysis and Cluster analysis.【RESULTS】The resultes showed that colony of F. oxysporum f. sp. cucumerium was not significant varied on the different culture mediums (p>0.05) by Variance analysis.However, significant influence were found in

8、 the conidia yield from 1.25×106 to 14.60×106 cfu/mL. Bilai's medium was of benefit to the yield of microconidia but marcroconidia, However, it had a reverse result about VBC medium.【CONCLUSION】In terms of microconidia yield, Bilai's medium as the optimum culture medium supported h

9、igher growth rate of F. oxysporum and reached the peak on the 11th day by compared with other cultural mediums by Cluster analysis.Key words: cucumber, Fusarium oxysporum, nutritive components, conidia yield尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）是一种世界性分布的土传病原真菌1，寄主范围广泛，可引起100多种植物枯萎病 2。其无性阶段可产生三种类型孢子，包括小型分生孢

10、子，大型分生孢子和厚垣孢子。镰刀菌的研究和鉴定主要依据大型分生孢子、小型分生孢子、产孢细胞、厚垣孢子及菌落性状等3。而单细胞小型分生孢子用于基因标记，在植物生物测定的定量检测与监测中具有重要的意义4。尖孢镰刀菌的生长特性受培养基类型、温度、光照、通气量和pH等条件的影响。蓝江林等5研究了温度对几种作物尖孢镰刀菌菌株生长的影响；朱育菁等6研究了通气量对西瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌生长的影响；马国斌等7探讨了培养条件对西瓜枯萎病菌镰刀菌酸产生的影响。培养基是菌体生长繁殖的物质基础，其成份与配比对微生物的生长发育、物质代谢有关重要的影响8。碳源与氮源是培养基中最基本、最重要析两大要素，碳源主要是供给菌

11、株生命活动所需要的能量和构成菌体细胞成份和代谢物质，氮源是微生物细胞质和含氮化合物的氮素来源9。已有研究表明，Bilai's培养基和VBC培养基营养成份均较淡薄，都是较好的适宜镰刀菌产孢的合成培养基，且碳氮比对镰刀菌孢子的长度、分隔有明显的影响3,10,11。因此，该研究选择Bilai's培养基和VBC培养基为基础设计培养基配方，分析不同类型培养基上黄瓜尖孢镰刀菌（F. oxysporum f. sp. cucumerium）菌落生长特性和孢子生长特性，旨在了解黄瓜尖孢镰刀菌生长对营养的需求及不同生长阶段的产孢差异，同时筛选一种最适产生小型分生孢子的培养基，为黄瓜尖孢镰刀菌的小

12、型分子孢子的收集提供培养条件。1 材料与方法1.1 材料供试菌株：黄瓜尖孢镰刀菌菌株F-H.6.5-030318-J2和F-H.6.5-030318-J4于2003年3月采集分离自福建省漳州诏安发生枯萎病病田的黄瓜无症植株，菌株F-H.6.5-030318-B3采集分离自同时同地采集的发病植株。在培养基设计上，以Bilai's培养基和VBC为基础设计培养基配方，(A)全糖型采用Bilai's培养基，(B)淀粉型将Bilai's培养基中蔗糖和葡萄糖成份取消，(C)低糖型将Bilai's培养基中葡萄糖和蔗糖含量减半，(D)尿素型将Bilai's培养基中KNO

13、3更换为尿素，(E)低氮型将Bilai's培养基中KNO3含量减半， (F)VBC型采用 VBC培养基(表1)。表1 培养基营养成份设计类型营养成份配方(A)全糖型KH2PO4 1g；KNO3 1g；KCL 0.5g；MgSO47H2O 0.5g；淀粉 0.2g；葡萄糖 0.2g；蔗糖 0.2g；蒸馏水 1L(B)淀粉型KH2PO4 1g; KNO3 1g；KCL 0.5g；MgSO47H2O 0.5g；淀粉 0.2g；蒸馏水 1L(C)低糖型KH2PO4 1g；KNO3 1g；KCL 0.5g；MgSO47H2O 0.5g；淀粉 0.2g；葡萄糖 0.1g；蔗糖 0.1g；蒸馏水 1

14、L(D)尿素型KH2PO4 1g；尿素 1g；KCL 0.5g；MgSO47H2O 0.5g；淀粉 0.2g；葡萄糖 0.2g；蔗糖 0.2g；蒸馏水 1L(E)低氮型KH2PO4 1g；KNO3 0.5g；KCL 0.5g；MgSO47H2O 0.5g；淀粉 0.2g；葡萄糖 0.2g；蔗糖 0.2g；蒸馏水 1L(F)VBC型KH2PO4 1g；KNO3 1g；复合维生素B 1片；维生素C 1片；蒸馏水 1L1.2 方法1.2.1 黄瓜尖孢镰刀菌菌落生长特性 菌株分别于PSA平板上培养7d，用直径为6mm的打孔器切取大小均一的菌片。将菌片分别接于不同营养成份的固体平板培养基中央，每个培养皿

15、放5块菌片,每个处理重复3次。测定培养5d的菌落直径大小，用方差分析方法分析菌株在不同营养成份培养基上的菌落生长特性。1.2.2 黄瓜尖孢镰刀菌分生孢子生长特性 菌株F-H.6.5-030318-J2于PSA平板上培养7d后，刮下菌丝于100ml无菌水中，充分振匀，用双层纱布过滤两遍制成孢子悬液备用；配制上述不同成份的培养基（A-F），用250ml的三角瓶每瓶盛50ml培养液，高压灭菌，待培养基冷却后，各加入1ml已备好的尖孢镰刀菌孢子悬浮液，以不加孢子悬浮的为空白对照，25，120 r/min摇床中培养，光照控制为光暗交替12h:12h，培养至第1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d和

16、15d时，各出取3瓶检测，分别计数大型和小型分生孢子数量。分析比较黄瓜尖孢镰刀菌大、小型分生孢子生长特性。1.2.3 黄瓜尖孢镰刀菌营养需求的聚类分析 用聚类分析方法对培养基类型进行归类。以培养基类型为样本，以菌株培养天数为指标，构建矩阵，用欧氏距离为相关尺度，以类平均法进行系统聚类。分析培养基类型对黄瓜尖孢镰刀菌菌株产孢量影响。1.2.4 黄瓜尖孢镰刀菌生长阶段的聚类分析 聚类分析方法对培养时间进行归类。以培养基时间为样本，以培养基类型为指标，构建矩阵，用欧氏距离为相关尺度，以类平均法进行系统聚类。分析培养时间对黄瓜尖孢镰刀菌菌株产孢量影响。2 结果与分析2.1 黄瓜尖孢镰刀菌的菌落生长特性

17、方差分析结果表明，菌株在不同培养基之间差异不显著(p>0.05)，形成的菌落直径在4.204.67cm之间；而不同尖孢镰刀菌的菌落生长直径差异显著（P<0.05），菌株F-H.6.5-030318-J2的菌落直径为4.18cm、F-H.6.5-030318-J4为4.43cm、F-H.6.5-030318-B3为4.65cm（表2）。表2 黄瓜尖孢镰刀菌在不同类型培养基上的菌落生长特性供试培养基培养5d的菌落直径大小cm均值F-H.6.5-030318-J2F-H.6.5-030318-J4F-H.6.5-030318-B3(A)全糖型4.204.204.704.37 a(B)淀粉

18、型4.104.304.204.20 a(C)低糖型4.004.105.004.37 a(D)尿素型4.104.604.704.47 a(E)低氮型4.405.004.604.67 a(F)VBC型4.304.404.704.47 a均值4.18 b4.43 ab4.65 a注：表中同一列相同字母表示差异不显著，同一行不同字母表示差异显著。2.2 黄瓜尖孢镰刀菌分生孢子的生长特性2.2.1 不同培养基中菌株F-H.6.5-030318-J2分生孢子产生比例 在培养基A-E上，菌株F-H.6.5-030318-J2产生的小型分生孢子比例平均可达95.67-98.19%，且各差异不显著(p>0

19、.01)，说明Bilai's培养基成份中碳源、氮源的改变对不同类型分生孢子产生的比例影响不显著，但(A)全糖型培养基上小型分生孢子比例最高，(B)淀粉型培养基上最低.使用(F)VBC型培养基产生的小型分生孢子的比例较A-E培养基低，比例86.21%，说明(F)VBC型培养基更有利于大型分生孢子的形成（表3）。表3 不同培养基中黄瓜尖孢镰刀菌菌株F-H.6.5-030318-J2分生孢子产生比例供试培养基小型分生孢子比例%大型分生孢子比例%(A)全糖型98.19 A1.81 A(B)淀粉型95.67 A4.33 A(C)低糖型96.88 A3.12 A(D)尿素型95.89 A4.11

20、A(E)低氮型97.03 A2.97 A(F)VBC型86.21 B13.79 B2.2.2 黄瓜尖孢镰刀菌菌株F-H.6.5-030318-J2在不同培养基上小型分生孢子产孢量的变化 试验结果见图1。用不同类型培养基培养尖孢镰刀菌菌株F-H.6.5-030318-J2，其不同时间内产生小型分生孢子的数量差异较大。总体上随着培养时间的增加，小型分生孢子数量逐渐增加，到11d产孢量达到高峰，随后产孢量逐渐下降.从培养基看，(A)全糖型培养基最有利于小型分生孢子的产生，其数量均较其他培养基的高，在第11d达到最大值为14.60×106 cfu/ml；最差为(B)淀粉型培养基，在第11天达

21、到最大值仅为1.25×106 cfu/ml，较前者低近10倍，而这两者培养基的差异在于培养基B中取消了蔗糖和葡萄糖，其余成份与培养基A相同，表明缺乏蔗糖和葡萄糖不利于小型分生孢子的产生。图1 黄瓜尖孢镰刀菌菌株F-H.6.5-030318-J2在不同培养基上小型分生孢子产孢量的变化请把图1外框的虚线去掉用方差分析方法，分析培养基类型和培养时间对黄瓜尖孢镰刀菌菌株F-H.6.5-030318-J2小型分生孢子产生的影响.结果表明，培养基类型和培养时间对菌株小型分生孢子产孢量影响极显著（p<0.01）。从培养基类型看(表4)，(A)全糖型培养基对小型分生孢子的产孢量最佳，随后依次为

22、(E)低氮型、(D)尿素型、(C)低糖型、(F)VBC型，(B)淀粉型培养基为最差，其产孢量依次为：9.8200×106 cfu/ml、5.9375×106 cfu/ml、4.8625×106 cfu/ml、2.3813×106 cfu/ml、2.1563×106 cfu/ml和1.4438×106 cfu/ml。表4 培养基类型对黄瓜尖孢镰刀菌菌株F-H.6.5-030318-J2小型分生孢子产孢量显著性检验培养基类型均值P<0.05P<0.01(A)全糖型9.8200aA(E)低氮型5.9375bB(D)尿素型4.86

23、25bBC(C)低糖型2.3813cCD(F)VBC型2.1563cCD(B)淀粉型1.4438cD从培养时间看（表5），培养11d和13d小型分生孢子的产孢量最大，平均值分别为6.1833×106 cfu/ml和6.1267×106 cfu/ml，显著地高于培养7d、9d、15d的4.2083×106 cfu/ml、5.1917×106 cfu/ml和5.3750×106 cfu/ml，而培养时间为1d、3d、5d时最低。在测定标准培养状态下的小型分生孢子产孢量以11d为最佳。表5 培养时间对黄瓜尖孢镰刀菌菌株F-H.6.5-030318-J

24、2小型分生孢子产孢量显著性检验培养时间（d）均值P<0.05P<0.01116.1833aA136.1267aA155.3750abAB95.1917abAB74.2083abcAB53.1750bcAB32.9833bcAB12.2250cB2.3 黄瓜尖孢镰刀菌营养需求的聚类分析用聚类分析方法，对培养基类型进行归类。以培养基类型为样本，以菌株培养天数为指标，构建矩阵，用欧氏距离为相关尺度，以类平均法进行系统聚类.聚类过程见表6；培养基类型对产孢量影响聚类分析见图2。当=15.90时，可将培养基类型分为3类，第1类包括了(A)全糖型培养基，其特点是对菌株小型分生孢子产孢量最有利；

25、第2类包括了(B)淀粉型和(C)低糖型培养基，其特点是较有利于菌株小型分生孢子产孢；第3类包括了(D)尿素型、(E)低氮型和(F)VBC型培养基，其特点是不利于菌株小型分生孢子产孢。表6 聚类过程TIJ距离1540.225002640.825003321.075004423.406205216.46372培养基类型(A)全糖型(B)淀粉型(C)低糖型(D)尿素型(E)低氮型(F)VBC型=15.90 图2 培养基类型对小型分生孢子产孢量影响聚类分析请把表跟图分开，去掉外面的虚线2.4 黄瓜尖孢镰刀菌生长阶段的聚类分析用聚类分析方法，对培养时间进行归类。以培养基时间为样本，以培养基类型为指标，构

26、建矩阵，用欧氏距离为相关尺度，以类平均法进行系统聚类.聚类过程见表7；培养时间对产孢量影响聚类分析见图3。当=5.09时，可将其分为2类，第1类包括了1d、3d、5d、7d，其特点是此时菌株小型分生孢子产生量较少；第2类包括了9d、11d、13d、15d，其特点是该阶段菌株小型分生孢子产生量较大。表7 聚类过程TIJ距离1212.000802762.009173542.228694313.108735863.125106415.197977618.44637培养时间（d5.09 图2 培养时间对小型分生孢子产孢量影响聚类分析请把表跟图分开，去掉外面的虚线3 讨论培养基

27、类型对黄瓜尖孢镰刀菌的菌落生长影响不显著(p>0.05)，但是对分生孢子产量影响差异很大，不同类型培养上产孢量在（1.2514.60）×106 cfu/ml之间。(A)全糖型培养基对黄瓜尖孢镰刀菌小型分生孢子的产生最有利，而对大型分生孢子的产生最不利，而(F)VBC型培养基则相反，对大型分生孢子产生有利与王拱辰等3的研究结果一致。改变培养基的氮源和碳源都能改变小型分生孢子的产孢量。从该变氮源的结果看，将(A)全糖型培养基成份中KNO3量减半得到(E)低氮型培养基，将(A)全糖型培养基成份中KNO3用尿素替代得到(D)尿素型培养基，二者的变化趋势基本同(A)全糖型培养基，但孢子数

28、较(A)全糖型培养基低，而(E)低氮型培养基产生的孢子数在培养至第7天后，高于(D)尿素型培养基，试验结果说明产孢培养中使用KNO3作氮源优于尿素。从该变碳源的结果看，将(A)全糖型培养基成份中葡萄糖、蔗糖去除得到(B)淀粉型培养基，将(A)全糖型培养基成份中葡萄糖、蔗糖减半得到(C)低糖型培养基，二者的产孢量显著低于(A)全糖型培养基，其中(B)淀粉型培养基从第5d开始产孢量逐渐下降，可见蔗糖和葡萄糖碳源的缺乏，极不利于小型分生孢子的产生，而碳源不足也显著影响产孢量。另外使用VBC培养基培养获得的小型分生孢子产孢量结果不理想。对黄瓜尖孢镰刀菌营养需求和生长阶段的研究结果进行聚类分析，表明尖孢镰刀菌小型分生孢子产生的最佳培养基为(A)全糖型培养基，最大产孢量发生在培养11d，为14.60×106 cfu/ml。这为尖孢镰刀菌的分子标记中小型分子孢子的收集提供了培养条件。致谢：感谢福建农林大学张绍升教授对本论文研究的悉心指导.参考文献：1 Correll J C. The relationship between formae speciales, races, and vegetative compatibility groups in Fusarium oxysporum. Phytopatho