第3章 植物细胞工程的基本理论

1、 第第3章章 植物组织与细胞培养的植物组织与细胞培养的基本原理基本原理第一节第一节 植物细胞的全能性植物细胞的全能性第二节第二节 植物细胞的分化植物细胞的分化第三节第三节 器官发生与体细胞胚胎发生器官发生与体细胞胚胎发生第四节第四节 人工种子人工种子外植体外植体（explant) )：指从植物体上分离出来，用于：指从植物体上分离出来，用于离体培养的离体培养的活的活的各类组织、器官或细胞。各类组织、器官或细胞。初代培养初代培养 ( (primary culture) )：对植物外植体进行的：对植物外植体进行的第一次离体培养。第一次离体培养。继代培养继代培养 ( (subculture) )：对外

2、植体的初代培养物或：对外植体的初代培养物或增殖培养物重新切割、筛选，接种于新鲜培养基中，增殖培养物重新切割、筛选，接种于新鲜培养基中，进行连续多代移植培养的过程。进行连续多代移植培养的过程。再生植株再生植株（regenerated plant）：经过离体培养形成）：经过离体培养形成的植株。的植株。第一节第一节 植物细胞的全能性植物细胞的全能性一、一、 植物细胞全能性的建立基础植物细胞全能性的建立基础1、细胞学说（、细胞学说（cell theory） 细胞学说细胞学说是植物细胞是植物细胞工程研究的思想基础。工程研究的思想基础。 1838 1838年年 德国植物学家德国植物学家施莱登（施莱登（Sc

3、hleiden）和动）和动物学家物学家施望施望（Schwann）提出细胞学说。）提出细胞学说。细胞学说的基本论点：细胞学说的基本论点： 细胞是生物结构、功能和发育的基本单位。细胞是生物结构、功能和发育的基本单位。 细胞是生物体的基本结构单位，由它构成整细胞是生物体的基本结构单位，由它构成整个生物个体。个生物个体。如果具有与有机体内相同的条件，每个细胞都如果具有与有机体内相同的条件，每个细胞都可以独立生活和发展。可以独立生活和发展。 2、植物的再生现象：、植物的再生现象：不经过雌、雄配子的不经过雌、雄配子的结合，由母体植株的一部分重新形成其它结合，由母体植株的一部分重新形成其它器官或完整植株的现

4、象。器官或完整植株的现象。 植物的再生现象对植物细胞全能性的发现植物的再生现象对植物细胞全能性的发现起着极其重要的作用。起着极其重要的作用。 细胞学说细胞学说的建立与的建立与植物再生现象植物再生现象为植为植物细胞全能性的提出提供了理论基础。物细胞全能性的提出提供了理论基础。 1902 年，年， Haberlandt,首次提首次提出了植物细胞全能性的观点：出了植物细胞全能性的观点： 认为高等植物的体细胞可以不认为高等植物的体细胞可以不断分割，直至单个细胞。如果每个断分割，直至单个细胞。如果每个细胞都有植物个体一样的性质和能细胞都有植物个体一样的性质和能力，那么，可以通过植物细胞培养力，那么，可以

5、通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个体。使单个细胞发育成为一个新个体。二、植物细胞全能性学说的定义二、植物细胞全能性学说的定义1 1、植物细胞全能性的概念及其发展、植物细胞全能性的概念及其发展 1943年，美国科学家年，美国科学家White正式提出植物细胞具有正式提出植物细胞具有全能性全能性(totipotent)的学说的学说,给植给植物细胞全能性一个定义：物细胞全能性一个定义： 认为每个植物细胞都具有认为每个植物细胞都具有该物种的全部遗传信息，在适该物种的全部遗传信息，在适宜条件下具有发育成胚胎和完宜条件下具有发育成胚胎和完整植株的能力。整植株的能力。植物细胞的全能性植物细胞的全能性

6、(plant cell totipotency) 是指每个具有完整细胞核的植物是指每个具有完整细胞核的植物活细胞，活细胞，含含有该植物的全套遗传信息，具有在适宜条件下发有该植物的全套遗传信息，具有在适宜条件下发育成完整植株的潜在能力。育成完整植株的潜在能力。 1958年，年，Steward 培养来自胡萝卜根的悬浮培养来自胡萝卜根的悬浮细胞，并成功地诱导单个的悬浮细胞发育为成熟细胞，并成功地诱导单个的悬浮细胞发育为成熟的胚胎，完全证明了的胚胎，完全证明了Haberlandt提出的细胞全能提出的细胞全能性学说。性学说。 至今，已经能够在一千多种植物上，从各种至今，已经能够在一千多种植物上，从各种类

7、型的组织和细胞，甚至是原生质体，诱导出胚类型的组织和细胞，甚至是原生质体，诱导出胚胎和完整植株。胎和完整植株。 细胞全能性仅是一种能力或可能性，不是所有细胞全能性仅是一种能力或可能性，不是所有具有全能性的细胞都能进行全能性的表达。具有全能性的细胞都能进行全能性的表达。2、植物细胞全能性的含义、植物细胞全能性的含义 每个植物生活细胞无论是体细胞还是生殖细每个植物生活细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种全部的遗传信息。胞，均具有该物种全部的遗传信息。 每个植物生活细胞均具有发育成完整植株的每个植物生活细胞均具有发育成完整植株的潜在能力。潜在能力。 自然条件下：自然条件下：in vivo 一般

8、只有一般只有胚性细胞（胚性细胞（embryonic cell) 或分或分化程度不高的细胞才可具备发育为胚胎或植株的化程度不高的细胞才可具备发育为胚胎或植株的全能性。全能性。类似于动物的胚胎干细胞（类似于动物的胚胎干细胞（embryonic stem cells) 三、植物细胞全能性的实现三、植物细胞全能性的实现主要包括三类细胞：主要包括三类细胞：l 植物的合子及早期胚胎细胞；植物的合子及早期胚胎细胞；l 植物的顶端分生细胞；植物的顶端分生细胞；l 一些成熟器官和组织中遗留的一些胚性细胞（胚一些成熟器官和组织中遗留的一些胚性细胞（胚囊中细胞，珠心组织，叶柄或叶肉薄壁细胞，表皮囊中细胞，珠心组织，

9、叶柄或叶肉薄壁细胞，表皮细胞。）细胞。） 对于已经成熟的分化细胞，可以在离体条件下实对于已经成熟的分化细胞，可以在离体条件下实现细胞全能性，但有现细胞全能性，但有极少数类型的细胞完全失去分裂极少数类型的细胞完全失去分裂的能力，即终端分化细胞：的能力，即终端分化细胞： 细胞核已经开始解体的筛管和木质部；细胞核已经开始解体的筛管和木质部； 细胞壁超过细胞壁超过2m的纤维细胞、管胞细胞；的纤维细胞、管胞细胞； 气孔保卫细胞、腺毛细胞等。气孔保卫细胞、腺毛细胞等。离体条件下离体条件下 in vitro三、三、 植物细胞全能性的实现植物细胞全能性的实现1 1、植物细胞全能性表达的条件、植物细胞全能性表达

10、的条件2 2、实现植物细胞全能性的途径、实现植物细胞全能性的途径P37 细胞全能性是细胞分化的理论基础，而细胞细胞全能性是细胞分化的理论基础，而细胞分化是细胞全能性的具体表现。分化是细胞全能性的具体表现。植物细胞全能性表达的条件植物细胞全能性表达的条件（1 1）离体）离体（2 2）植物生长调节物质的是必备的关键物质）植物生长调节物质的是必备的关键物质（3 3）供给植物生长所必须的营养物质和环境）供给植物生长所必须的营养物质和环境条件条件 一个已分化的细胞通过脱分化向分生状态回一个已分化的细胞通过脱分化向分生状态回复可能达到的程度，取决于它已有的分化程度。复可能达到的程度，取决于它已有的分化程度

11、。离体条件下植物细胞全能性的实现途径离体条件下植物细胞全能性的实现途径 离体培养条件下，植物离体培养条件下，植物、经过、经过都可能实现细胞全能性。都可能实现细胞全能性。大量事实证明，植物细胞具有全能性。大量事实证明，植物细胞具有全能性。 离体培养条件下，离体培养条件下，一个已经分化的成熟细胞一个已经分化的成熟细胞要表现其全能性，先要通过要表现其全能性，先要通过脱分化脱分化，经过细胞分，经过细胞分裂形成愈伤组织，经过裂形成愈伤组织，经过再分化再分化形成完整植株。形成完整植株。 脱分化脱分化是细胞全能性表达的是细胞全能性表达的前提前提，再分化再分化是是细胞全能性表达的细胞全能性表达的最终体现最终体

12、现。第二节第二节 植物细胞的分化植物细胞的分化一、细胞的脱分化和再分化一、细胞的脱分化和再分化脱分化（脱分化（dedifferentiation） ：培养条件下使一个已分培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。程。愈伤组织（愈伤组织（callus）：）：脱分化后的细胞，经过分裂形成脱分化后的细胞，经过分裂形成无特定结构和功能的松散的细胞团，具有再分化的能无特定结构和功能的松散的细胞团，具有再分化的能力。力。再分化（再分化（Redifferentiation）：）： 脱分化后的分生细胞脱分化后的分生细胞在特定的条件下，重

13、新回复细胞分化能力，形成各种在特定的条件下，重新回复细胞分化能力，形成各种不同类型的细胞，并经历器官发生或胚胎发生，进一不同类型的细胞，并经历器官发生或胚胎发生，进一步发育成完整植物体的过程。步发育成完整植物体的过程。高等植物细胞脱分化和再分化示意图成熟细胞成熟细胞细胞细胞分生细胞分生细胞多细胞团多细胞团形态建成形态建成完整植株完整植株细胞细胞细胞细胞脱分化脱分化分裂分裂再分化再分化脱脱 分分 化化再再 分分 化化不同类型细胞实现全能性的能力不同类型细胞实现全能性的能力营养生长点细胞营养生长点细胞形成层细胞形成层细胞薄壁细胞薄壁细胞厚壁细胞厚壁细胞特化细胞特化细胞高高低低二、细胞脱分化和再分化

14、的过程二、细胞脱分化和再分化的过程1、诱导期（诱导期（Induction）2、分裂期（分裂期（Cell division）3、分化期（分化期（Differentiation）愈伤组织的形成经历三个时期。愈伤组织的形成经历三个时期。细胞分裂的准备期，即脱分化。细胞分裂的准备期，即脱分化。细胞脱分化（细胞脱分化（dedifferentiation） ： 培养条件下使一个已分化的细胞回复到培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。原始无分化状态或分生细胞状态的过程。 1、诱导期（诱导期（Induction）脱分化期细胞结构的变化脱分化期细胞结构的变化： 细胞内合成代谢活跃

15、，细胞质增加显著变浓；细胞内合成代谢活跃，细胞质增加显著变浓；大液泡消失；细胞核体积增加并逐渐移位至细胞大液泡消失；细胞核体积增加并逐渐移位至细胞中央；细胞器增加；细胞内核糖体增加并形成大中央；细胞器增加；细胞内核糖体增加并形成大量多聚核糖体，量多聚核糖体，RNARNA迅速合成和积累。迅速合成和积累。两个重要特征两个重要特征：这一时期细胞这一时期细胞。 细胞脱分化时间的长短：由一系列细胞脱分化时间的长短：由一系列内部因素内部因素（植（植物的种类、生理状况）和物的种类、生理状况）和外部因素外部因素（光照、外源激（光照、外源激素）决定，烟草素）决定，烟草242432h32h，胡萝卜，胡萝卜96h9

16、6h，菊芋，菊芋22h22h。细胞脱分化的条件：细胞脱分化的条件：创伤、外源激素创伤、外源激素细胞开始分裂，进入分裂期标志着脱分化的完成。细胞开始分裂，进入分裂期标志着脱分化的完成。分裂方式分裂方式：第一次分裂的方式通常是：第一次分裂的方式通常是分裂部位分裂部位：通常在：通常在启动分裂，之后影响到整启动分裂，之后影响到整个外植体细胞进入分裂周期而启动分裂。个外植体细胞进入分裂周期而启动分裂。2 2、分裂期（、分裂期（Cell division） 细胞通过脱分化的起动期而进入分裂，一般先细胞通过脱分化的起动期而进入分裂，一般先由外植体的由外植体的外层细胞外层细胞开始分裂，开始分裂，中间部分的细胞

17、不中间部分的细胞不分裂形成一个静止的芯，分裂形成一个静止的芯，迅速分裂的细胞逐渐回复迅速分裂的细胞逐渐回复到分生组织状态，并到分生组织状态，并开始形成愈伤组织开始形成愈伤组织。 尽管细胞脱分化后进入细胞分裂的结果，在大尽管细胞脱分化后进入细胞分裂的结果，在大多数情况下是形成愈伤组织，但绝多数情况下是形成愈伤组织，但绝不是说所有的细不是说所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。分裂期的主要特征：分裂期的主要特征： 被启动的被启动的细胞进行活跃分裂细胞进行活跃分裂。细胞体积变小，。细胞体积变小，数目增加数目增加，细胞分裂快。细胞分裂形成的分生细胞，细胞分裂快。细

18、胞分裂形成的分生细胞团团形成生长中心形成生长中心，细胞反复增殖，突破外层组织向，细胞反复增殖，突破外层组织向外生长，形成瘤状的愈伤。结构疏松，缺少组织结外生长，形成瘤状的愈伤。结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明。构，颜色浅而透明。from leaf tissue from vascular tissue From rootFrom embryo culture分裂期细胞的变化（分裂期细胞的变化（P40) 开始分裂期：开始分裂期：外植体外层和组织边缘的细胞开始迅速分外植体外层和组织边缘的细胞开始迅速分裂（平周分裂），细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、裂（平周分裂），细胞数目增加、体积变小、

19、核和核仁变大、有丰富的线粒体和液泡，有丰富的线粒体和液泡，RNA含量持续上升，类似于根尖或茎含量持续上升，类似于根尖或茎尖生长点的细胞。内部的细胞仍然处于静止。尖生长点的细胞。内部的细胞仍然处于静止。 分裂高峰期：分裂高峰期：细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞体积最小，细胞核和核仁最大，RNA含量最高，细胞回复到分生状态。含量最高，细胞回复到分生状态。 分裂末期：分裂末期：表层细胞的分裂逐渐减少，直至终止，内部表层细胞的分裂逐渐减少，直至终止，内部较深处细胞开始分裂，分裂面方向改变，形成愈伤组织。较深处细胞开始分裂，分裂面方向改变，形成愈伤组织。（开始进行细胞的再分化）（开始进行细胞的再分化

20、） 即形成期，是指外植体的细胞经过诱导、分即形成期，是指外植体的细胞经过诱导、分裂形成了裂形成了无序结构无序结构的愈伤组织的时期。的愈伤组织的时期。 但在细胞分裂末期，细胞内开始发生一系列但在细胞分裂末期，细胞内开始发生一系列的的形态和生理变化形态和生理变化，导致细胞在形态和生理功能，导致细胞在形态和生理功能上的分化，出现上的分化，出现形态形态和和功能各异的细胞，功能各异的细胞，出现出现组组织分化织分化。3 3、分化期（、分化期（Differentiation） 在同一愈伤组织内部，同时存在着处于分裂期在同一愈伤组织内部，同时存在着处于分裂期与分化期的细胞。与分化期的细胞。分化期的主要特征：出

21、现组织分化。分化期的主要特征：出现组织分化。（1 1）细胞分裂部位和方向发生改变；）细胞分裂部位和方向发生改变；（2 2）拟分生组织拟分生组织和和维管组织结节维管组织结节的形成；的形成；（3 3）细胞的体积不再减小，）细胞的体积不再减小，出现各种类型的细胞出现各种类型的细胞，分生细胞、薄壁细胞、厚壁细胞和管状分，分生细胞、薄壁细胞、厚壁细胞和管状分子等，出现一定的形态特征；子等，出现一定的形态特征； （4 4）各种酶的活性加强，淀粉的累积，）各种酶的活性加强，淀粉的累积，RNARNA和组和组蛋白合成速度加快。蛋白合成速度加快。 在生长的愈伤组在生长的愈伤组织中，会出现由小而织中，会出现由小而密

22、集的分裂细胞构成密集的分裂细胞构成的瘤状结构，分散地的瘤状结构，分散地分布着，不断分裂，分布着，不断分裂，分生中心周缘的细胞分生中心周缘的细胞分裂停止，成为高度分裂停止，成为高度液泡化的薄壁细胞。液泡化的薄壁细胞。 拟分生组织拟分生组织 （meristemoid)拟 分 生 组 织 （ 分 生 组 织 结 节 ）拟 分 生 组 织 （ 分 生 组 织 结 节 ） 这些瘤状结构的拟分生组织可以成为这些瘤状结构的拟分生组织可以成为愈伤组织的愈伤组织的“生长中心生长中心”或者进一步分化或者进一步分化为为“维管组织结节维管组织结节”。 经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，经过起动、分裂和分化期产生的

23、愈伤组织，其中虽然其中虽然发生了细胞分化和组织分化发生了细胞分化和组织分化，但是，但是并没有并没有器官发生器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织才会发生只有满足某些条件，愈伤组织才会发生器官再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。器官再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。 离体条件下，细胞再分化是从离体条件下，细胞再分化是从细胞分化、组织细胞分化、组织分化、器官分化分化、器官分化到形成到形成完整植物体完整植物体的逐级递进的分的逐级递进的分化过程。多数情况下发生在愈伤组织中。化过程。多数情况下发生在愈伤组织中。 细胞分化（细胞分化（differentiation）：）：是指导致细胞形成是指导致细

24、胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程程 。细胞分化的结果，导致植物体中形成多种类型的细细胞分化的结果，导致植物体中形成多种类型的细胞。分化是一种持久性的变化，发生在生物体的整胞。分化是一种持久性的变化，发生在生物体的整个生命过程中。个生命过程中。细胞再分化的实质就是细胞分化细胞再分化的实质就是细胞分化。（1 1）细胞分化）细胞分化极性与不均等分裂在细胞再分化中的作用。极性与不均等分裂在细胞再分化中的作用。极性：极性：是指在植物的器官、组织甚至单个细胞中不是指在植物的器官、组织甚至单个细胞中不同轴向上存在的形态结构及生理生化上的差异。极

25、同轴向上存在的形态结构及生理生化上的差异。极性在低等植物与高等植物中都普遍存在。性在低等植物与高等植物中都普遍存在。极性极性是植物细胞分化中的一个基本现象。是植物细胞分化中的一个基本现象。 细胞的不均等分裂细胞的不均等分裂是细胞内极性产生的结果，对细是细胞内极性产生的结果，对细胞分化途径有明显的影响。胞分化途径有明显的影响。 （2 2）组织分化）组织分化 TE细胞细胞 ( (tracheary element) ) ：作为维管作为维管系统的主要成分，在维管系统的形成中具有中心作系统的主要成分，在维管系统的形成中具有中心作用，是维管发生的一个标志。用，是维管发生的一个标志。 植物在植物在自然生长

26、条件下自然生长条件下，由根和芽的原形成层，由根和芽的原形成层或次生形成层细胞分化形成。或次生形成层细胞分化形成。 在在离体培养条件离体培养条件下，下，TETE细胞由愈伤组织薄壁细细胞由愈伤组织薄壁细胞分化形成，胞分化形成，TE细胞的出现标志着组织开始分化细胞的出现标志着组织开始分化。 导管分子在离体培养物中较导管分子在离体培养物中较易发生，易于染色和辨认，是易发生，易于染色和辨认，是离体条件下研究细胞分化的一离体条件下研究细胞分化的一个模式系统。个模式系统。导管细胞的分化导管细胞的分化TE细胞的分化可以划分为细胞的分化可以划分为3个阶段：个阶段：脱分化脱分化脱分化的细胞向脱分化的细胞向TE细胞

27、的转分化细胞的转分化 转分化是指细胞不经过分裂而直接通过分化转转分化是指细胞不经过分裂而直接通过分化转变为另一种类型细胞的过程。变为另一种类型细胞的过程。TE 细胞的特化阶段细胞的特化阶段外植体表面产生的愈伤组织细胞外植体表面产生的愈伤组织细胞导管分子的分化导管分子的分化 愈伤组织生长过程中不同类型的管状分子存在愈伤组织生长过程中不同类型的管状分子存在方式与活体植株组织中的存在方式相同：方式与活体植株组织中的存在方式相同： 幼嫩的环纹式管状分子幼嫩的环纹式管状分子大都以单独的或少数聚集的方大都以单独的或少数聚集的方式存在，以适应细胞延长；式存在，以适应细胞延长； 网纹和孔纹管状分子网纹和孔纹管

28、状分子次生壁坚固，大量成团，出现在次生壁坚固，大量成团，出现在生长缓慢的部分。生长缓慢的部分。 管状分子大多存在于愈伤组织块与培养基相管状分子大多存在于愈伤组织块与培养基相连接的部位，是分生细胞中心与培养基之间的输导连接的部位，是分生细胞中心与培养基之间的输导通道。通道。 在植物的个体发育中，各种组织都是由在植物的个体发育中，各种组织都是由分生分生组织组织（meristematic tissue) )产生的细胞经过生产生的细胞经过生长和分化而形成的，它们的功能与植物的生长有长和分化而形成的，它们的功能与植物的生长有直接的关系。直接的关系。 在离体培养的条件下，在离体培养的条件下，拟分生组织拟分

29、生组织（meristemoid) )和和维管组织维管组织( (vascular tissue) )是是联结细胞分化和器官分化的桥梁。在细胞分化的联结细胞分化和器官分化的桥梁。在细胞分化的基础上，离体培养物一旦分化出这两种组织，就基础上，离体培养物一旦分化出这两种组织，就可能导致可能导致器官原基器官原基的形成，进一步分化成器官。的形成，进一步分化成器官。 （3 3）器官分化）器官分化 在组织分化的基础上会产生器官原基，将分在组织分化的基础上会产生器官原基，将分化成不同的器官（不定芽、不定根和花芽等），化成不同的器官（不定芽、不定根和花芽等），最终导致完整植株的形成。也称为最终导致完整植株的形成。

30、也称为形态建成形态建成。拟分生组织拟分生组织维管组织结节维管组织结节维管组织维管组织根原基根原基芽原基芽原基不定芽不定芽不定根不定根再生植株再生植株 在培养条件下，植物细胞经过器官分化形在培养条件下，植物细胞经过器官分化形成完整个体有成完整个体有两种途径两种途径：一是一是器官发器官发生（生（organogenesis）二是二是体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）三、愈伤组织的继代三、愈伤组织的继代愈伤组织愈伤组织外植体外植体原生质体原生质体再生植株再生植株悬浮细胞悬浮细胞二次诱导二次诱导愈伤组织愈伤组织悬浮细胞系悬浮细胞系次生代谢物次生代谢物转基因受体转基

31、因受体愈伤组织在离体培养体系中的地位愈伤组织在离体培养体系中的地位1 1、愈伤组织愈伤组织的类型的类型外观上外观上：旺盛生长的愈伤组织其质地有显旺盛生长的愈伤组织其质地有显著差异著差异，可分为可分为松脆型松脆型及及坚硬型坚硬型两类两类，两两者且可以互相转化。者且可以互相转化。再生能力上再生能力上：胚性愈伤胚性愈伤、非胚性愈伤非胚性愈伤。来源于不同植物或同一植物的不同部位的来源于不同植物或同一植物的不同部位的愈伤在颜色、结构和生长习性上都可能存愈伤在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异。即便是在同一块愈伤上也会由于在差异。即便是在同一块愈伤上也会由于各种因素的作用存在颜色和结构上的差异各种因素的

32、作用存在颜色和结构上的差异。P41P41 由于外植体细胞遗传组成的差异、细胞间互作、由于外植体细胞遗传组成的差异、细胞间互作、营养和水分供应及生长调节物质的刺激等作用，造营养和水分供应及生长调节物质的刺激等作用，造成愈伤组织块中不同区域组织结构的不同，进而表成愈伤组织块中不同区域组织结构的不同，进而表现出细胞增殖速度、器官分化能力和分化程度的不现出细胞增殖速度、器官分化能力和分化程度的不同。同。因此，愈伤组织的结构是不均一的，同时还具因此，愈伤组织的结构是不均一的，同时还具有生理和遗传上的嵌合性和变异性。有生理和遗传上的嵌合性和变异性。2 2、愈伤组织的结构、愈伤组织的结构 从愈伤组织与培养基

33、接触处开始向外，可以看从愈伤组织与培养基接触处开始向外，可以看到三层结构：到三层结构： 第一层（内层）：以管状分子为主；第一层（内层）：以管状分子为主； 第二层（中层）：以分生细胞中心为核心，由第二层（中层）：以分生细胞中心为核心，由大量的薄壁细胞包围而成，分生细胞区域为圆形或大量的薄壁细胞包围而成，分生细胞区域为圆形或冠形，可以发育为几个分生细胞中心；冠形，可以发育为几个分生细胞中心； 第三层（外层）：以薄壁细胞为主，由少量厚第三层（外层）：以薄壁细胞为主，由少量厚壁细胞，此层细胞均为死细胞。壁细胞，此层细胞均为死细胞。P42P42继代培养时期继代培养时期培养方法培养方法培养方式：培养方式：

34、培养基：培养基：3 3、继代方法、继代方法4 4、长期培养物形态发生潜力的丧失的原因、长期培养物形态发生潜力的丧失的原因u 生理学说：生理学说：培养组织或细胞中的内源激素失衡。培养组织或细胞中的内源激素失衡。 遗传学说：遗传学说：遗传物质在培养继代过程中由于变异遗传物质在培养继代过程中由于变异等原因而发生了改变或是突变。等原因而发生了改变或是突变。 竞争学说：竞争学说：细胞对于生长素抑制全能性表达的作细胞对于生长素抑制全能性表达的作用变得比较敏感；反复的继代培养中，非胚性细胞用变得比较敏感；反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会逐步增加，而胚性成分则逐渐减少。的群体将会逐步增加，而胚性成分则逐

35、渐减少。P44P44四、影响植物细胞脱分化和再分化的因素四、影响植物细胞脱分化和再分化的因素1 1、培养基、培养基2 2、外植体、外植体3 3、激素的作用、激素的作用4 4、培养条件的影响、培养条件的影响P45-48P45-48创伤的作用创伤的作用：植物细胞植物细胞形成机械隔离形成机械隔离和和生理隔离生理隔离，由切，由切割而造成的机械和生理隔离对细胞脱分化、再割而造成的机械和生理隔离对细胞脱分化、再分化是十分重要的，也可以说是植物细胞全能分化是十分重要的，也可以说是植物细胞全能性表现的重要措施。性表现的重要措施。植物激素的作用：植物激素的作用： 植物个体的发育是受植物体内的全部遗传信植物个体的

36、发育是受植物体内的全部遗传信息中部分信息的息中部分信息的“开开”和和 “ “关关”所控制的。而控所控制的。而控制这一过程的制这一过程的“效应子效应子”就是植物激素。就是植物激素。 植物激素中的植物激素中的生长素生长素和和细胞分裂素细胞分裂素是启动细胞是启动细胞脱分化、分裂和再分化的关键性激素。脱分化、分裂和再分化的关键性激素。 所以在离体培养条件下，由于所以在离体培养条件下，由于切割创伤切割创伤和和外源外源激素激素的作用下，使部分遗传信息开放。从而改变了的作用下，使部分遗传信息开放。从而改变了植物的代谢路线，使之朝着胚性细胞的方向发育。植物的代谢路线，使之朝着胚性细胞的方向发育。第三节第三节

37、器官发生与体细胞胚胎发生器官发生与体细胞胚胎发生一、器官发生（一、器官发生（organogenesisorganogenesis）1 1、概念、概念 器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定芽（愈伤组织）分化形成不定芽（adventitious adventitious budsbuds）、不定根（）、不定根（adventitious rootsadventitious roots）等器）等器官的过程。官的过程。2 2、器官发生的方式、器官发生的方式（P49P49）先芽后根先芽后根先根后芽先根后芽根芽同步根芽同步三种方式三种方式两种

38、途径两种途径直接发生途径直接发生途径间接发生途径间接发生途径外植体外植体脱分化脱分化再分化再分化外植体外植体脱分化脱分化愈伤组织愈伤组织再分化再分化2 2、培养基成分、培养基成分 激素（激素（Skoog-Miller模式）、有机及无机成分模式）、有机及无机成分1 1、起始材料、起始材料母体植株的遗传基础母体植株的遗传基础外植体的类型外植体的类型生理状态、取材方式等生理状态、取材方式等3 3、影响器官分化的因素、影响器官分化的因素（P49-51P49-51）3 3、培养条件、培养条件 光照、温度、湿度等光照、温度、湿度等二、二、体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生1 1、概念、概念体细胞胚胎发生体细胞胚

39、胎发生（somatic embryogenesis) )：从植物体细胞培养物中分化胚胎或胚状体的从植物体细胞培养物中分化胚胎或胚状体的过程。过程。体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生和和器官发生器官发生是植物细胞再分是植物细胞再分化形成再生植株的两种不同的发育过程。化形成再生植株的两种不同的发育过程。： 离体培养下离体培养下，但经过了，但经过了所形成的胚的类似物（不管培养的所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）。细胞是体细胞还是生殖细胞）。体细胞胚的含义：体细胞胚的含义：在在离体培养离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；范围使用，以区别于无融合生殖胚；体细胞胚起源于体细胞胚起源于非

40、合子细胞非合子细胞，以区别于合子胚；，以区别于合子胚；体细胞体细胞经过了胚胎发育过程经过了胚胎发育过程，以区别与离体培养，以区别与离体培养中器官发生形成个体的途径。中器官发生形成个体的途径。2、体细胞胚发生的特点、体细胞胚发生的特点具有明显的具有明显的双双极性极性：即在发育的早期阶段，从其方即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，具有向相反的两端分化出茎端和根端，具有根、芽两极根、芽两极分化的特性；分化的特性； 存在生理隔离现象存在生理隔离现象：胚状体与母体组织或与外植体：胚状体与母体组织或与外植体的维管组织的维管组织无无解剖结构上的解剖结构上的直接联系直接联系，处于相对独，处

41、于相对独立的状态；立的状态；遗传的遗传的相对相对稳定性稳定性：单细胞起源；：单细胞起源；发生数量大发生数量大，增殖率高增殖率高：可再生次级胚。：可再生次级胚。 胚状体与不定芽的区别胚状体与不定芽的区别体细胞胚体细胞胚不不 定定 芽芽来来 源源单细胞单细胞较复杂，多细胞，单细胞较复杂，多细胞，单细胞分化特性分化特性根芽两极分化根芽两极分化单极性分化，根或芽单极性分化，根或芽维管组织维管组织独立的独立的V V型型与外植体有联系与外植体有联系遗传稳定性遗传稳定性相对较稳定相对较稳定不稳定，易变异，出现嵌合体不稳定，易变异，出现嵌合体胚状体与合子胚的比较胚状体与合子胚的比较 胚状体胚状体合子胚合子胚质

42、量质量萌发率低，质量差萌发率低，质量差萌发率高，质量好萌发率高，质量好来源来源体细胞体细胞受精卵受精卵胚柄胚柄很少有，即使有也不明显，很少有，即使有也不明显， 有，明显，给顶细胞有，明显，给顶细胞发育时提供营养发育时提供营养形态形态复杂，与相同植物比较，体复杂，与相同植物比较，体积小于合子胚。积小于合子胚。固定，子叶规范固定，子叶规范变异率变异率高，各种类型畸形胚高，各种类型畸形胚低低休眠期休眠期无休眠期，却有一个静止期无休眠期，却有一个静止期有有营养供应营养供应培养基培养基种皮、胚乳、子叶种皮、胚乳、子叶3 3、体细胞胚发生的途径、体细胞胚发生的途径直接发生：直接发生： 一般认为是由原先就存

43、在于外植体中的一般认为是由原先就存在于外植体中的胚性胚性细胞细胞培养后直接进入胚胎发生而形成体胚。培养后直接进入胚胎发生而形成体胚。间接发生（愈伤组织、悬浮培养细胞）：间接发生（愈伤组织、悬浮培养细胞）： 外植体已分化的细胞先脱分化，并外植体已分化的细胞先脱分化，并诱导出胚诱导出胚性细胞性细胞，进而形成体细胞胚。，进而形成体细胞胚。胚性细胞胚性细胞和和胚性愈伤组织的形成胚性愈伤组织的形成是体胚发生的关键。是体胚发生的关键。植物胚状体产生的方式植物胚状体产生的方式由外植体表面细胞直接产生由外植体表面细胞直接产生由外植体或愈伤组织内产生由外植体或愈伤组织内产生由愈伤组织表层细胞产生由愈伤组织表层细

44、胞产生由胚性细胞团表面产生由胚性细胞团表面产生由单个游离细胞产生由单个游离细胞产生P53-54P53-544 4、体细胞胚的发育过程、体细胞胚的发育过程胚性细胞胚性细胞原胚原胚球型胚球型胚心型胚心型胚鱼雷型胚鱼雷型胚子叶型胚子叶型胚 体细胞胚一般起源于体细胞胚一般起源于一个胚性细胞一个胚性细胞，胚性细，胚性细胞经过首次分裂形成胞经过首次分裂形成二细胞原胚二细胞原胚，再经分裂形成，再经分裂形成多细胞原胚多细胞原胚。进而发育为。进而发育为球形胚球形胚、心型胚心型胚等过程等过程。双子叶植物的体胚双子叶植物的体胚单子叶植物的体胚单子叶植物的体胚 在同一块愈伤组织或一个胚性细胞复合体上可以观察到在同一块

45、愈伤组织或一个胚性细胞复合体上可以观察到多个不同发育时期的体细胞胚，从多个不同发育时期的体细胞胚，从单个原始细胞单个原始细胞到到多细胞的多细胞的原胚、球形胚、鱼雷胚原胚、球形胚、鱼雷胚直至具直至具子叶的胚状体子叶的胚状体，这是由体细胞，这是由体细胞胚发生和分裂的不同步所致。胚发生和分裂的不同步所致。 香蕉心形体细胞胚 可可心形胚A和球形胚B AB（1）外植体类型与发育阶段）外植体类型与发育阶段 距活体胚胎发育较近的组织；距活体胚胎发育较近的组织； 成熟及未成熟的成熟及未成熟的胚胎在离体条件下可能更有利于体细胞胚的诱导。胚胎在离体条件下可能更有利于体细胞胚的诱导。 胡萝卜和毛茛属一些胡萝卜和毛茛

46、属一些植物几乎植株植物几乎植株的所有部分都有高的体的所有部分都有高的体细胞胚形成潜力，胡萝卜细胞胚形成潜力，胡萝卜主根、胚、花梗、叶柄、幼根和下主根、胚、花梗、叶柄、幼根和下胚轴等组织都可以诱导体细胞胚的发生；胚轴等组织都可以诱导体细胞胚的发生； 在禾本科植物中，幼穗和幼胚易分化产生体细胞胚；在禾本科植物中，幼穗和幼胚易分化产生体细胞胚； 棉花等一些双子叶植物的下胚轴、豆科植物的子叶组织上棉花等一些双子叶植物的下胚轴、豆科植物的子叶组织上可诱导体细胞胚的产生。可诱导体细胞胚的产生。5、影响体细胞胚胎发生的因素、影响体细胞胚胎发生的因素表皮下细胞表皮下细胞 根发生区细胞根发生区细胞 芽发生区细胞

47、芽发生区细胞 产生胚状体产生胚状体 胡萝卜子叶不同部位外植体示意图胡萝卜子叶不同部位外植体示意图 （2）氮源）氮源 诱导培养基中还原态氮的存在非常重要，通常诱导培养基中还原态氮的存在非常重要，通常较高的氨态较高的氨态氮氮有利于胚状体的形成。有利于胚状体的形成。 添加添加水解酪蛋白或酵母提取物水解酪蛋白或酵母提取物有利于胚状体的发生。有利于胚状体的发生。 添加添加谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、精氨酸、脯氨酸、等对胚状体的发生有重要作用。等对胚状体的发生有重要作用。其它天然的有机复合物如椰乳、未成熟的玉米胚乳、水稻胚其它天然的有机复合物如椰乳、未成熟的

48、玉米胚乳、水稻胚乳、小麦胚乳等对胚状体的发生和发育都有很重要的作用。乳、小麦胚乳等对胚状体的发生和发育都有很重要的作用。（3 3）生长素类）生长素类 生长素是诱导体细胞胚的主导因子。生长素是诱导体细胞胚的主导因子。体细胞胚体细胞胚胎发生中，外源生长素的使用规律，在大多数植物胎发生中，外源生长素的使用规律，在大多数植物中是相似的。中是相似的。 诱导愈伤组织或胚性愈伤组织，均需要诱导愈伤组织或胚性愈伤组织，均需要高浓度高浓度的生长素的生长素；当球型胚形成后，则需要；当球型胚形成后，则需要降低生长素水降低生长素水平平才能完成体细胞胚的继续发育；才能完成体细胞胚的继续发育； 生长素的这一应用规律与胚胎

49、发育过程中内源生长素的这一应用规律与胚胎发育过程中内源激素的变化是一致的激素的变化是一致的。几乎所有的单子叶植物和几乎所有的单子叶植物和57.5的双子叶植物胚的双子叶植物胚性细胞形成中使用性细胞形成中使用2,4-D。 外源外源2,4-D对内源生长素具有重要的调节和平衡对内源生长素具有重要的调节和平衡作用，提高了细胞对作用，提高了细胞对IAAIAA的敏感性，诱导胚性细胞的的敏感性，诱导胚性细胞的发生。发生。 2,4-D的作用具有阶段性，在诱导胚性愈伤组织的作用具有阶段性，在诱导胚性愈伤组织阶段通常起促进作用，而在体细胞胚分化发育阶段一阶段通常起促进作用，而在体细胞胚分化发育阶段一般起抑制作用般起

50、抑制作用。 6、体细胞胚胎发生的实际应用、体细胞胚胎发生的实际应用无性繁殖：合子胚的无性繁殖、增加林木无性繁殖：合子胚的无性繁殖、增加林木的体细胞无性系变异；的体细胞无性系变异；人工种子的制备；人工种子的制备；分离可再生的原生质体的材料；分离可再生的原生质体的材料；遗传转化；遗传转化；代谢产物合成；代谢产物合成；遗传资源的保存。遗传资源的保存。第四节第四节 人工种子人工种子一、人工种子的概念及意义一、人工种子的概念及意义 人工种子技术是人工种子技术是20世纪世纪80年代中期发展起来的年代中期发展起来的技术，植物人工种子（技术，植物人工种子（artificial seeds）的概念最）的概念最早

51、由美国生物学家早由美国生物学家Murashige于于1977年提出，年提出，1978年年Redenbaugh 制造第一批人工种子（苜蓿和芹制造第一批人工种子（苜蓿和芹菜）。菜）。 人工种子又称合成种子人工种子又称合成种子 （ synthetic seeds）或体细胞）或体细胞种子种子 （ somatic seeds）：）： 是指将植物离体培养中产生的是指将植物离体培养中产生的体细胞胚体细胞胚，或，或能发能发育成完整植株的分生组织育成完整植株的分生组织（不定芽、愈伤组织、胚状不定芽、愈伤组织、胚状体、原球茎、小鳞茎、微型薯等体、原球茎、小鳞茎、微型薯等）包埋在含有营养物）包埋在含有营养物质和具有

52、保护功能的外壳形成的适宜条件下能够发芽质和具有保护功能的外壳形成的适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。出苗的颗粒体。 1 1、概念、概念 2 2、人工种子的典型构成、人工种子的典型构成 胚胚 状状 体体（繁殖体）（繁殖体）人工种皮人工种皮人工胚乳人工胚乳3 3、人工种子的研制意义、人工种子的研制意义（1 1）人工种子能代替试管苗快速繁殖，开创了种苗生产的又）人工种子能代替试管苗快速繁殖，开创了种苗生产的又一新途径。与试管苗相比是一种一新途径。与试管苗相比是一种高效快速的繁殖方法高效快速的繁殖方法，避，避免移栽困难，易于实现机械化操作，便于储运。免移栽困难，易于实现机械化操作，便于储运。（2 2）对

53、优异杂种种子、自然条件下不结实或制种困难的植物）对优异杂种种子、自然条件下不结实或制种困难的植物可以可以不通过有性制种而快速获得大量种子。不通过有性制种而快速获得大量种子。（3 3）在人工种子的包裹材料里加入各种生长调节物质、菌）在人工种子的包裹材料里加入各种生长调节物质、菌 肥、农药等，可肥、农药等，可人为地影响控制人为地影响控制作物生长发育和抗性。作物生长发育和抗性。其它类型繁殖体：其它类型繁殖体： 微型营养变态器官繁殖体的培养；微型营养变态器官繁殖体的培养； 茎尖、微芽、不定芽等芽繁殖体的培养。茎尖、微芽、不定芽等芽繁殖体的培养。 获得体细胞胚是生产人工种子的基础，获得体细胞胚是生产人工

54、种子的基础，大量的、高质量的体胚大量的、高质量的体胚是人工种子制作的是人工种子制作的前提。前提。二、体细胞胚发生的同步化控制二、体细胞胚发生的同步化控制 采用采用化学方法化学方法或或物理学的方法物理学的方法控制体细胞胚控制体细胞胚的同步化发育。的同步化发育。 作为种子使用的繁殖体，首先必须要有较高作为种子使用的繁殖体，首先必须要有较高程度的一致性。这种一致性除了程度的一致性。这种一致性除了遗传上的一致性遗传上的一致性外，外，还包括还包括生理上的一致性生理上的一致性。1 1、化学抑制法：、化学抑制法： 在细胞培养初期加入在细胞培养初期加入DNADNA合成抑制剂。合成抑制剂。2 2、低温抑制法：、

55、低温抑制法： 低温处理抑制细胞分裂。低温处理抑制细胞分裂。3 3、渗透压选择法、渗透压选择法： 不同发育阶段的胚具有不同的渗透压要求，不同发育阶段的胚具有不同的渗透压要求，调节渗透压可以控制胚性细胞的同步发育。调节渗透压可以控制胚性细胞的同步发育。4 4、机械过筛选择法：、机械过筛选择法： 用不同孔径的尼龙网选择不同发育阶段的胚或采用不同孔径的尼龙网选择不同发育阶段的胚或采用密度梯度离心来选择不同发育阶段的胚。用密度梯度离心来选择不同发育阶段的胚。5 5、通气法：、通气法： 乙烯的产生与细胞分裂密切相关，在细胞分裂达乙烯的产生与细胞分裂密切相关，在细胞分裂达到高峰前，有一个乙烯合成高峰。在培养

56、基中通到高峰前，有一个乙烯合成高峰。在培养基中通入乙烯或氮气，每入乙烯或氮气，每10h10h或或20h20h通一次，每次通一次，每次3-4s3-4s，控制细胞同步分裂。控制细胞同步分裂。三、人工种子包埋技术与贮存三、人工种子包埋技术与贮存1 1、繁殖体的处理：、繁殖体的处理：脱水、休眠、老化等。脱水、休眠、老化等。2 2、繁殖体的包埋、繁殖体的包埋（1 1）包埋介质：）包埋介质：水凝胶水凝胶思考：包埋介质有什么要求？思考：包埋介质有什么要求？ 用于包被体细胞胚的几种水凝胶用于包被体细胞胚的几种水凝胶水凝胶名称水凝胶名称浓度浓度（重量（重量/ /体积）体积）络合剂络合剂浓度浓度（mmol/L）海

57、藻酸钠海藻酸钠海藻海藻酸钠及明酸钠及明胶胶角叉藻聚糖角叉藻聚糖洋槐豆胶洋槐豆胶0.505.02.05.00.20.80.41.0钙盐钙盐钙盐钙盐KClKCl或或NHNH4 4ClClKClKCl或或NHNH4 4ClCl3010030100500500 人工胚乳主要成分人工胚乳主要成分： 无机盐混合物无机盐混合物 碳水化合物（淀粉、糖）碳水化合物（淀粉、糖） 蛋白质。如藻酸盐中的蛋白质。如藻酸盐中的“海藻海藻”副产品除蛋白质外，副产品除蛋白质外，还含有碳水化合物。还含有碳水化合物。人工胚乳研制途径人工胚乳研制途径：直接法直接法凝胶囊中直接加入大量元素和碳水化合物及防病用抗生素，以保证种胚基本营养和碳源。微型包裹法微型包裹法首先将碳水化合物和大量元素包裹在微型胶囊内，然后再把微型胶囊和种胚一起包裹在海藻酸钙（人工种皮）中。目的使人工胚乳在人工种子内有控制的释放。 （2 2）常用的人工胚乳）常用的人工胚乳（3）包埋方法：）包埋方法： 经研究认为藻酸盐所形成的胶囊是目前经研究认为藻酸盐所形成的胶囊是目前最好的凝胶包埋材料，所采用的主要方法最好的凝胶包埋材料，所采用的主要方法是是滴注法滴注法和和装膜法装膜法两种。两种。 滴注法滴注法包埋的操作程序包埋的操作程序