小鼠PARP1基因RNAi表达载体对Lewis细胞株的影响

1、小鼠PARP1基因RNAi表达载体对Lewis细胞株的影响 作者：王铁君 邹永巍 刘林林 杨海山【摘要】 目的 观察PARP1基因RNAi表达载体对Lewis肺癌细胞的抑制及凋亡情况。方法 以脂质体Lipofectimine? 2000介导，将PARP11308的siRNA表达载体转染Lewis肺癌细胞株，将其分为空白对照组、错义序列组、siRNA组，2Gy照射组、2Gy照射+错义序列组、2Gy照射+siRNA组。应用MTT法检测转染细胞抑制率、流式细胞术分析转染siRNA后细胞的凋亡，并应用RTPCR检测转染细胞Parp1 mRNA表达水平。结果 siRNA转染组及2Gy照射组的吸光度值与空

2、白对照组比较差异有显著意义；2Gy照射组+ siRNA组的吸光度值与2Gy照射组、siRNA组比较差异有显著意义。错义序列组与正常对照组比较无显著差异；2Gy照射组+错义序列组与2Gy照射组比较无显著差异。2Gy照射组+ siRNA组对Lewis肺癌细胞的抑制率最高。RTPCR检测结果显示转染细胞Parp1 mRNA表达水平降低。siRNA转染、2Gy照射可诱导Lewis肺癌细胞凋亡，与正常对照组比较差异显著(P0.05)，并且siRNA转染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌细胞凋亡。结论 针对PARP1的RNAi可以提高Lewis肺癌细胞的抑制率及放疗引起的肿瘤细胞的凋亡。 【关键词】 P

3、ARP；RNAi；细胞凋亡；肿瘤细胞 聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶1（PARP1）在DNA修复、细胞死亡、增殖分化等方面发挥着重要作用1，2，研究表明通过抑制PARP1活性可抑制PARP1介导的DNA修复机制，提高放疗和化疗对肿瘤细胞DNA的损伤效果3，4，且肿瘤治疗效果满意。但阻断剂技术本身存在诸多缺陷，这极大地限制其应用于临床肿瘤治疗。而小片段干扰核糖核酸(small interference RNA，siRNA)技术能较好地解决应用阻断剂所带来的问题，从而可为肿瘤放射基因治疗研究提供新途径。本文应用PARP11308的RNAi载体转染小鼠Lewis肺癌细胞株，观察PARP1的RNAi对小鼠L

4、ewis肺癌细胞株凋亡的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 TRIzol Raegent、脂质体LipofectimineTM2000、DMEM培养基、胎牛血清，Invitrogen公司；MTT，Sigma公司。Lewis肺癌细胞株，本室保存。pGPU6/GFP/NeoParp11308，本室构建、鉴定、筛选5。 1.2 方法 1.2.1 pGPU6/GFP/NeoParp11308转染Lewis肺癌细胞株 取对数生长期的Lewis肺癌细胞，调整细胞浓度为6×107/L，取100 l接种于96孔板。设空白对照组、错义序列组（错义序列组序列与Parp1基因的siRNA序列有相同的GC

5、组成，但与小鼠的 mRNA没有明显的同源性，作为阴性对照）、siRNA组，2Gy照射组、2Gy照射+错义序列组、2Gy照射+siRNA组，每组3复孔，接种24 h后弃去上清，以脂质体LipofectimineTM 2000介导，将siRNA表达载体转染Lewis肺癌细胞株，具体操作按说明书进行。置于37、5% CO2、无血清培养基中继续培养6 h，更换完全培养基继续培养。 1.2.2 细胞抑制率检测 在各组细胞转染24 h后分别加入MTT 20 l，培养箱中4 h，弃上清加入DMSO，振荡15 min，酶标仪检测吸光度（A）值。计算细胞抑制率。 1.2.3 转染siRNA后细胞凋亡的检测 各组

6、细胞以1.5×105/L密度接种于25 cm2培养瓶，转染后继续培养48 h，胰酶消化、离心收集并悬于PBS中，4、70%乙醇固定30 min，用含RNase及碘化丙锭（PI）的染色液染色30 min。应用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。 1.2.4 转染细胞Parp1 mRNA表达水平的检测 各组细胞以1.0×105/L密度接种于6孔板，24 h后 弃去上清，转染siRNA，24 h后胰酶消化，离心收集。TRIzol提取各组细胞总RNA，取1 g总RNA进行RTPCR扩增。以Parp1的引物5TCCCAAGGACTCCCTCCGCATGG3、5CTTTGCCTGCCACGCC

7、TCCAGCC3进行RTPCR，扩增片段为210 bp，检测Parp1 mRNA的表达情况。以actin （5GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT3，5AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT3）为内参照。将PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳。 2 结 果 2.1 siRNA对Lewis肺癌细胞生长的抑制作用 siRNA转染组及2Gy照射组的吸光度值与空白对照组相比差异有显著意义(P0.05)；2Gy照射组+ siRNA组的吸光度值与2Gy照射组、siRNA组比较差异有显著意义（P0.05)。错义序列组与正常对照组比较差异无显著性；2Gy照射组+错义序列组与2Gy照射

8、组比较差异无显著意义。2Gy照射组+ siRNA组对Lewis肺癌细胞的抑制率最高。 2.2 siRNA对Lewis肺癌细胞凋亡的影响 siRNA转染、2Gy照射可诱导Lewis肺癌细胞凋亡，与正常对照组比差异显著（P0.05），并且siRNA转染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌细胞凋亡（P0.05）。 2.3 转染细胞Parp1 mRNA表达水平 见图1。各组210 bp处均可见清晰条带，siRNA和2Gy照射组+ siRNA组条带明显减弱，各组内参照actin条带一致。 3 讨 论 PARP是一类存在于多数真核细胞(酵母除外)中的蛋白质翻译后修饰酶6，在DNA 的损伤修复、DNA复制、

9、细胞增殖分化调控、细胞凋亡、基因组的稳定方面发挥着重要的作用7。PARP1活性抑制是辐射敏感性增高的主要原因，采用PARP1抑制剂可增强几种抗肿瘤因子杀伤肿瘤细胞的效能。但是由于PARP是一个多成员的蛋白质家族，化学抑制剂可能会带来非特异性抑制效果，给特定PARP成员功能的研究带来不便。而且PARP1特异性阻断剂还处于实验阶段，毒副作用仍不清楚。 siRNA是一种简单的、有效的代替基因敲除的工具，其作用机制是通过活化的小干扰RNA靶向降解目的mRNA，从而使目的基因表达沉默。2123nt的短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA。RNA干扰技术已经广泛用于基

10、因功能的研究以及多种疾病的治疗，如乙型肝炎、丙肝、流感、艾滋病等810。本研究利用RNA干扰技术，将构建的针对PARP1的RNAi裁体转染小鼠Lewis肺癌细胞株，结果表明siRNA转染组及2Gy照射组吸光度值与空白对照组比较差异显著；2Gy照射组+ siRNA组的吸光度值与2Gy照射组、siRNA组比较差异显著。错义序列组与正常对照组比较无显著差异；2Gy照射组+错义序列组与2Gy照射组比较无显著差异，2Gy照射组+ siRNA组对Lewis肺癌细胞的抑制率最高，RTPCR检测结果显示转染细胞Parp1 mRNA表达水平降低。表明RNAi沉默PARP1基因的表达，针对PARP1的RNAi可以

11、提高Lewis肺癌细胞的抑制率。 PARP具有保持染色体结构完整、参与DNA复制和转录的功能，在维持基因组稳定和细胞凋亡过程中发挥作用。PARP在DNA损伤断裂时被激活，作为DNA损伤的分子感受器，识别、结合到DNA断裂处，激活、催化受体蛋白的聚ADP核糖基化作用，参与DNA的修复。PARP与组蛋白H1结合，影响核小体的正常结构，使染色体形成开放、松散结构，有利于DNA修复11。本研究中siRNA转染、2Gy照射可诱导Lewis肺癌细胞凋亡，与正常对照组比较差异显著，并且siRNA转染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌细胞凋亡。表明针对PARP1的RNAi可以提高放疗引起的肿瘤细胞的凋亡。R

12、NAi不仅克服了PARP1抑制剂的毒副作用，还具有高度特异性，为肿瘤治疗治疗提供了实验依据，同时也探索了一条新的治疗途径。【参考文献】 1 Rouleau M,Aubin RA，Poirier GG.Poly(ADPribosyl)ated chromatin domains：access grantedJ.J Cell Sci，2004；117：81525.2 Haince JF，Rouleau M，Hendzel MJ,et al.Targeting poly(ADPribosyl)ation：a promising approach in cancer therapyJ.Trends M

13、ol Med，2005；11：45663.3 Farmer H，McCabe N，Lord CJ,et al.Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategyJ.Nature，2005；434：91721.4 Bryant HE，Schultz N，Thomas HD,et al.Specific killing of BRCA2deficient tumours with inhibitors of poly(ADPribose) polymeraseJ. Nature，2005；43

14、4：9137.5 王铁军，韩成敏，李星花，等.小鼠PARP1基因RNAi表达载体的构建与筛选J.中国生物制品学杂志，2009；22：1436.6 Beneke S，Bürkle A.Poly(ADPRibosyl)ation，PARP，and agingJ.Sci Aging Knowl Environ，2004；2004：15962.7 Affar EB，Dallaire AK，Castonguay V，et al.Role of poly(ADPribose) polymerase in rapid intracellular acidification induced by a

15、lkylating DNA damageJ.Proc Natl Acad Sci USA，2002;99：24550.8 Kapadia SB，BrideauAndersen A，Chisari FVInterference of hepatitis C virus RNA replication by short interfering RNAsJProc Natl Acad Sci USA，2003；100：20148.9 Qin XF，An DS，Chen IS,et alInhibiting HIVl infection in human T cells by lentiviralmediated delivery of small interfering RNA against CCR5JProc Natl Acad Sci USA，2003；100：1838.10 Ying C，De CE，Neyts JSelective inhibition of hepatitis B