生物分离工程 沉淀法

1、生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程原料液原料液细胞分离细胞分离( (离心，过滤离心，过滤) )细胞胞内产物细胞胞内产物路线一路线一路线二路线二细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离路线一路线一A A路线一路线一B B清液胞外产物清液胞外产物粗分离粗分离( (沉淀沉淀/ /超过滤超过滤/ /萃取萃取) )纯化纯化( (层析、离子交换、吸附层析、离子交换、吸附) )脱盐脱盐( (凝胶过滤、超滤凝胶过滤、超滤) )浓缩浓缩( (超滤超滤) )精制精制( (结晶、干燥结晶、干燥) )包含体包含体溶解溶解( (加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲) )复性复性1.什么是沉淀法？什么是沉淀法？2.沉淀法纯化蛋白质

2、的优点有哪些？沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？3.常用的沉淀方法包括哪些？常用的沉淀方法包括哪些？4.何谓盐析？其原理是什么？何谓盐析？其原理是什么？5.常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？6.有机溶剂沉淀法的原理是什么？有机溶剂沉淀法的原理是什么？7.影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？8.等电点沉析的工作原理是什么？等电点沉析的工作原理是什么？通过本章学习应掌握以下内容通过本章学习应掌握以下内容沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。

3、而形成无定形固体沉淀的过程。沉淀法的目的：沉淀法的目的：(通过沉淀达到浓缩的目的；通过沉淀达到浓缩的目的；(沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步成分，初步 纯化纯化 ；(将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。步处理。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。前仍广泛应用在工业上和实验室中。16.1 概述沉淀法的原理：沉淀法的原理：(生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，生物分子在水中形成稳定的

4、溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。(沉淀法基本原理沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，离的目的，(溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的液的pHpH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产

5、生明显的改变。度产生明显的改变。16.1 概述n 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。品。n操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：通常按三步进行： 概述概述沉淀法操作步骤沉淀法操作步

6、骤 ：首先加入沉淀剂，首先加入沉淀剂，沉淀剂的陈化，促进粒子生长；沉淀剂的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉淀物。离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响收率和沉淀物的形状都有很大影响。 概述概述沉淀生成动力学溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：为相互碰撞由下面几种运动引起：热运动，热运动，BromnianBromnian运动；运动；

7、对流运动，由机械搅拌产生；对流运动，由机械搅拌产生；差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。为了简化沉淀过程动力学，为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过程分成下述个步骤：可把沉淀过程分成下述个步骤：n(1) (1) 初始混合初始混合n(2) (2) 新相生成新相生成n(3) (3) 布朗运动凝集布朗运动凝集n(4) (4) 机械碰撞凝集机械碰撞凝集n(5) (5) 聚集体陈化聚集体陈化n(6) (6) 聚集体沉淀聚集体沉淀沉淀生成动力学沉淀生成动力学沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生

8、产的制备过程，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。时最常用的方法。 概概 述述沉淀法的分类沉淀法的分类根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1 1）盐析法；）盐析法；（2 2）等电点沉淀法；）等电点沉淀法；（3 3）有机溶剂沉淀法；）有机溶剂沉淀法；（4 4）非离子型聚合物沉淀法；）非离子型聚合物沉淀法；（5 5）聚电解质沉淀法；）聚电解质沉淀法；（6 6）复合盐沉淀法等）复合盐沉淀法等 （7 7）亲和沉淀法）亲和沉淀法（8 8） 选择性沉淀法。

9、选择性沉淀法。16.1 16.1 蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解特性n蛋白质是两性高分子电解质（蛋白质是两性高分子电解质（amphotericamphoteric polymerpolymer），主要由疏水性各不相同的），主要由疏水性各不相同的 20 20 种氨基种氨基酸组成。酸组成。n在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性水性氨基酸含量高的蛋

10、白质的疏水区大，疏水性强。强。n亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。外表面。n因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成荷电区、亲水区和疏水区构成。蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解特性n蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周围溶液性质所决定。分子周围溶液性质所决定。n蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分以其大

11、部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。是疏水的。n一般而言，小分子蛋白质比起在化学上一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。类似的大分子蛋白质更易溶解。防止蛋白质凝聚沉淀的屏障防止蛋白质凝聚沉淀的屏障u蛋白质周围的水化层蛋白质周围的水化层（hydration shell)hydration shell)，使蛋白使蛋白质形成稳定的胶体溶液。质形成稳定的胶体溶液。u蛋白质蛋白质分子间静电排斥作用。分子间静电排斥作用。（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身

12、基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。离子的电荷构成双电层。16.16.盐析盐析盐析盐析盐析是可逆的，而变性是不可逆的盐析是可逆的，而变性是不可逆的早在早在18591859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。级中使用，得到了比较满意的结果。 盐析法机理盐析法机理（1 1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子

13、有很强的水化盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2 2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。易沉淀。（3 3）中和电荷，减少静电斥力，）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度

14、降低，使蛋白质分子之间聚集降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。而沉淀。1）盐析用盐的选择）盐析用盐的选择在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱用较强，半径大的低价离子作用较弱阴离子盐析效果阴离子盐析效果 ：柠檬酸柠檬酸POPO4 43- 3- SOSO4 42-2- CHCH3 3COOCOO- - ClCl- - NONO3 3- -SCNSCN- -阳离子盐析效果：阳离子盐析效果：NHNH

15、4 4+ + K K+ +NaNa+ + 高价阳离子高价阳离子阴离子的影响大于阳离子阴离子的影响大于阳离子盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂u（1 1） 价廉价廉 ；u（2 2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；u（3 3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，u（4 4）不易引起蛋白质变性。）不易引起蛋白质变性。 盐析用盐的选择盐析用盐的选择n缺点：缺点：n（1）水解变酸；）水解变酸；

16、n（2）高）高pH 释氨，腐蚀；释氨，腐蚀；n（3）残留产品有影响。）残留产品有影响。盐析操作(加盐方式）硫酸铵的加入有以下几种方法：硫酸铵的加入有以下几种方法：1 1）加入固体盐法）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；2 2）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；的情况

17、；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。u一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。低。u在进行分离的时候，

18、一般从低离子强度到高离在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。子强度顺次进行。u每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。使另一种蛋白质组分盐析出来。 u组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。沉淀。2 2）盐浓度对盐析效果的影响）盐浓度对盐析效果的影响 S=-S=-s sS S蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度，

19、g/L; g/L; I I离子强度，离子强度， I=1/2mI=1/2mi iz zi i2 2 m mi i离子离子 i i的摩尔浓度；的摩尔浓度；ZiZi所带电荷所带电荷常数，图中常数，图中截距截距KsKs盐析常数，图中直线斜率盐析常数，图中直线斜率CohnCohn经验式经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系蛋白质溶解度与盐浓度的关系 和和Ks的物理意义的物理意义代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、与蛋白质种类、温度、pHpH值有关，值有关，与盐无关；与盐无关；KsKs盐析常数，盐析常数，代表

20、图中直线的斜率；代表图中直线的斜率；从一些实验结果表明，从一些实验结果表明，KsKs与温度和与温度和pHpH无关，但和蛋白质无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，铵作为沉淀剂时，KsKs值对不同的蛋白质来说，其变化值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过不会超过1 1倍。倍。用盐析法分离蛋白质的二种方法用盐析法分离蛋白质的二种方法盐析法分为两类，盐析法分为两类，第一类叫第一类叫KsKs分段盐析法，分段盐析法，在一定在一定PHPH和温度下和温度下通过改变离子强度实现，通过改变离子强度实现，（固定固定pH, pH,

21、温度，温度，改改变盐浓度变盐浓度），），由于蛋白质对离子强度的变化非由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提用于早期的粗提液；液；第二种叫第二种叫分段盐析法，分段盐析法，在一定离子强度下在一定离子强度下通过改变通过改变PHPH和温度来实现，（固定离子强度，和温度来实现，（固定离子强度，改变改变pHpH及温度及温度），），由于溶质溶解度变化缓慢，由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进用于后期进一步分离纯化和结晶。一步分离纯化和结晶。n虽然虽然CohnCohn公式能够描述盐析状态下蛋白公式

22、能够描述盐析状态下蛋白质的溶解度，但它不能体现低盐浓度质的溶解度，但它不能体现低盐浓度（盐溶状态）下蛋白质的溶解度。（盐溶状态）下蛋白质的溶解度。nMelanderMelander和和HorvathHorvath根据根据 SinanogluSinanoglu有关有关蛋白质盐析时溶剂和溶质相互作用理论蛋白质盐析时溶剂和溶质相互作用理论（空腔理论），（空腔理论）， 提出了不同盐浓度下的提出了不同盐浓度下的蛋白质溶解度的计算方程式：蛋白质溶解度的计算方程式：盐析用盐量的确定盐析用盐量的确定- -饱和度：饱和度：u目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或

23、饱和浓度可通过实验确定。铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。u对多数蛋白质，当达到对多数蛋白质，当达到85%85%饱和度时，溶解度饱和度时，溶解度都小于都小于 0.l mg0.l mgL L，通常为兼顾收率与纯度，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在饱和度的操作范围在40%-60%40%-60%之间。之间。硫酸铵盐析过程最适饱和度是30%，55%204060800100总蛋白总蛋白目标蛋白质目标蛋白质上清液蛋白浓度上清液蛋白浓度l由于不同的蛋白质溶解度由于不同的蛋白质溶解度不同，沉淀时所需的离子不同，沉淀时所需的离子强度也不相同，强度也不相同，l如果需要先除去些杂蛋白，如果需要先除去些杂蛋白，

24、然后在较高的饱和度下，然后在较高的饱和度下，沉淀目标蛋白质，则可采沉淀目标蛋白质，则可采用分段盐析用分段盐析改变盐的浓度，可将混合改变盐的浓度，可将混合液中的蛋白质分批盐析分液中的蛋白质分批盐析分开。开。l如半饱和硫酸铵可沉淀血如半饱和硫酸铵可沉淀血浆球蛋白，饱和硫酸铵则浆球蛋白，饱和硫酸铵则可沉淀包括血浆清蛋白。可沉淀包括血浆清蛋白。 分段盐析(fractional salting out)盐析的影响因素：3）pH值u一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。

25、度最小。u为提高盐析效率，多将溶液为提高盐析效率，多将溶液PHPH值调到目的蛋白的值调到目的蛋白的等电点处。等电点处。 u注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液溶液PHPH值，以达到最好的盐析效果。值，以达到最好的盐析效果。pH值PH两种蛋白质的相对溶解两种蛋白质的相对溶解度会随度会随pHpH而变化很大；而变化很大；随随pH pH 变化变化（1 1）对数关系）对数关系（2 2） 等电点附近有极小值等电点附近有极小值lgS在进行盐折时，必在进行盐折时，必须控制须控

26、制pHpH图中直线都相互平图中直线都相互平行行KsKspH值盐析影响因素：4）温度的影响u在低离子强度或纯水中，蛋白在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。增加而增加。u但在高浓度下，蛋白质、酶和但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。升而下降。u在一般情况下，蛋白质对盐析在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在感的酶要求在0-40-4进行。进行。u随温度升高减小，热促失水随温度升高减小，热促失水

27、膜膜uKsKs不随温度而变不随温度而变盐析的影响因素：5）蛋白质浓度 沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度有关。浓度有关。Z高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。Z在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。作用比较少，但回收率会降低。Z因此需要在两者之间进行适当选择。因此需要在两者之间进行适当选择。Z分

28、步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。Z一般认为一般认为2.5%-3.0%2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于的蛋白质浓度比较适中。相当于25 25 mg/mLmg/mL30mg/mL30mg/mL。u对起始浓度为对起始浓度为 30g/L30g/L的的COMbCOMb溶液，大部分蛋白质在硫溶液，大部分蛋白质在硫酸铵饱和度为酸铵饱和度为 58-6558-65之间沉淀出来；之间沉淀出来；u但对稀释但对稀释1010倍的倍的 COMbCOMb溶液，饱和度达到溶液

29、，饱和度达到66%66%时才开始时才开始沉淀，而相应的沉淀范围为沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%66-73%饱和度。饱和度。盐析注意事项盐析注意事项(选择适宜饱和度选择适宜饱和度(采用分步盐析采用分步盐析(盐析的成败决定于溶液的盐析的成败决定于溶液的pHpH值与离子强度，稳定值与离子强度，稳定pH pH 用磷酸用磷酸缓冲液缓冲液(在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。解后再

30、加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。(盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。(为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。(盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤一般可用超滤盐析注意事项盐析注意事项硫酸铵的使用硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前用敏感作用，使用前用H2SH2S处理处理 高浓度的硫酸铵溶液

31、一般呈酸性（高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0PH=5.0左右），使左右），使用前也需要用氨水调节至所需用前也需要用氨水调节至所需PHPH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意固体硫酸铵加入后体积变大固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；已考虑在表中； 盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法

32、需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。低浓度硫酸铵溶液。盐析法特点：盐析法特点：1.成本低，不需要特别昂贵的设备。成本低，不需要特别昂贵的设备。2.操作简单、安全。操作简单、安全。3.不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。到保持生物活性的纯化蛋白质。4.分离效果不理想，通常只是作为初步的分离分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。纯化，还需要结合其它的纯化方法。 16.等电点沉淀法等电点沉淀法 isoelectric

33、 point 等电点沉淀法等电点沉淀法在低的离子强度下，调在低的离子强度下，调pHpH至等电点，使蛋白质至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，能使分子间相互吸引，形成沉淀形成沉淀的操作称为等的操作称为等电点沉淀电点沉淀不同的两性电解质具有不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为不同的等电点，以此为基础可进行分离。基础可进行分离。生产胰岛素时，在粗提生产胰岛素时，在粗提液中先调液中先调PH8.0PH8.0去除碱性去除碱性蛋白质，再调蛋白质，再调PH3.0PH3.0去除去除酸性蛋白质。酸性蛋白质。pH=pI图图16-1

34、0表示大豆蛋白的溶解度随表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。的变化情况。等电点沉淀法等电点沉淀法n利用脂肪酶和淀粉酶的热敏感性不同， 在40(2温度下处理2.5h(pH=3.4)， 可将黑曲霉发酵液中90 以上的淀粉酶去处， 从而可以制备较纯的脂肪酶。n超氧化物歧化酶热稳定性很好， 对提取n液在60oC进行短时间热处理可沉淀20 杂蛋白。等电点沉淀法等电点沉淀法n细胞色素细胞色素C洗脱液（离交）洗脱液（离交）+ 硫酸胺（饱和度硫酸胺（饱和度86%） n调调pH5.0-5.5，低温离心，低温离心 上清液调上清液调pH4.8- 5.1产物产物n 沉淀（杂蛋白）沉淀（杂蛋白）等电点沉淀法注意事项等

35、电点沉淀法注意事项F本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。等电点时能形成粗大的凝聚物。F但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，调子强度的溶液中，调 pHpH在等电点并不产生沉淀。在等电点并不产生沉淀。F在调节等电点时，如果采用盐在调节等电点时，如果采用盐 酸、氢氧化钠等酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使了使pHpH缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱

36、碱。酸钠等弱碱。F中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。时最低溶解度会有所增大。16.16. 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法organic soventorganic sovent precipitationprecipitationl有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。淀方法之一。l优点在于：优点在于：1 1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只

37、在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2 2）沉淀不用）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；脱盐，过滤较为容易；l缺点是缺点是1 1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，活，2 2）操作要求在低温下进行。）操作要求在低温下进行。3 3）成本高）成本高l总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。法普遍。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法机理 *A 降低溶剂介电常数降低溶剂介电常数（介电常数（介电常数D有机有机 D水）水） ，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂

38、分子与蛋白质减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。淀。*B 破坏水化膜：破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。质沉淀。*C 相反力：相

39、反力：疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层合形成疏水层有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法机理降低介电常数破坏水化膜选择依据：选择依据：(水溶性要好水溶性要好(介电常数要小介电常数要小(致变性作用要小（致变性作用要小（甲醇甲醇）(毒性要小、挥发性适中毒性要小、挥发性适中(容易获取容易获取沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂乙醇是最常用的沉淀剂(乙醇：乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于沉析作用强，挥发性

40、适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；(丙酮丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；范围不广；1 1、温度、温度使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，u有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。要缓缓加入，防止溶液局部升温。u温度还会影响有机溶剂对蛋白

41、质的沉淀能力，一般温度越低，温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。沉淀越完全。因此，因此，所用的有机溶剂须预先冷却到所用的有机溶剂须预先冷却到-10-10-20-20；在使用有机在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行 。有机溶剂沉淀法的影响因素有机溶剂沉淀法的影响因素 2 2、pHpH值：值： pHpH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。多控制在待沉蛋白质的等电点附近。 3 3、样品浓度：、样品浓度：样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用样

42、品太浓会增加共沉作用 。一般认为蛋白质的初浓度以。一般认为蛋白质的初浓度以0.50.52 2为好，粘多糖则以为好，粘多糖则以1 12 2较合适。较合适。4 4、中性盐浓度：、中性盐浓度：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0.010.010.05mol/L0.05mol/L为好，常为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。 5 5、某些金属离子：、某些金属离子：一些金属离子如一些金属离子如CaCa2+2+、ZnZn2+2+等可与某些成阴等可与某些成阴离子

43、状态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低而离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。有机溶剂沉淀法的影响因素有机溶剂沉淀法的影响因素 举例：固体发酵生产举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶（米曲霉）菌体淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水水 过滤过滤 水抽提清液水抽提清液 加乙醇（加乙醇（70%）搅拌）搅拌 -淀粉酶淀粉酶 * pH影响影响 收率收率% 酶酶活活 收率收率 酶活酶活 6.5 pH * 适宜的适宜的pH 5.6 6.0 * 温度影响温度影响

44、 收率收率% 酶活酶活 酶活酶活 收率收率 10 20 T * 适宜的温度适宜的温度10 20 16.非离子型聚合物非离子型聚合物用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶解度，有用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶解度，有选择性的沉淀蛋白质。选择性的沉淀蛋白质。机理：机理：与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白质的水化与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白质的水化膜。膜。常用非离子性聚合物为常用非离子性聚合物为Polyethylene glycol (PEG)Polyethylene glycol (PEG)： 是一是一种水溶性的高分子聚合物，分子量种水溶性的高分子聚合物，分子量

45、4,000 4,000 以上的以上的 PEG PEG 可以可以用来沉淀蛋白质。用来沉淀蛋白质。优点：优点：1. 1. 室温室温 2. 2. 颗粒大，易于收集颗粒大，易于收集 3. 3. 提高蛋白质的稳定性提高蛋白质的稳定性 4. PEG 4. PEG 难去除，幸而难去除，幸而 PEG PEG 通常一般不影响下一步的分离。通常一般不影响下一步的分离。16.聚电解质沉淀 机理：架桥与静电n离子型多糖聚合物，酸性多糖羧甲基纤维素、海藻酸钠，食品蛋白的沉淀。n合成的离子聚合物：n聚丙烯酸（pH 2.8 90%蛋白沉淀）n聚苯乙烯季胺盐（pH 10.4, 95% pH 10.4, 95% 蛋白沉淀）蛋白

46、沉淀）n聚甲基丙烯酸n聚乙烯亚胺n此类沉析剂有以下三种：此类沉析剂有以下三种：（1）高价金属盐：）高价金属盐：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+与酸性基团结合；与酸性基团结合；（2）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基 团结合团结合（3）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等n缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性，缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性，需采用较温和的条需采用较温和的条件，有时还需加入一定的稳定剂。件，有时还需加入一定的稳定剂。） 金属离子沉淀金属离子沉淀n金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子金属离子的沉淀作

47、用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。例如锌易与組胺酸中的特殊部位起反应造成的。例如锌易与組胺酸残基中咪唑基结合，从而降低蛋白质的溶解度。残基中咪唑基结合，从而降低蛋白质的溶解度。n金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到19051905年，真正的认识是后来从金属离子与纯血浆年，真正的认识是后来从金属离子与纯血浆蛋白的特异相互作用的研究中得到的。蛋白的特异相互作用的研究中得到的。Zn2+Zn2+用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。Ca2+Ca2+（CaCO3CaCO3）用于分离乳酸，血清蛋白和柠檬酸。）用于分

48、离乳酸，血清蛋白和柠檬酸。硫酸钡在柠檬酸生产中用以去除重金属高于，硫酸钡在柠檬酸生产中用以去除重金属高于，MgSO4MgSO4用以去除用以去除DNADNA和其他核酸；和其他核酸； 金属离子沉淀蛋白质金属离子沉淀蛋白质n一般可分三类：一般可分三类：n能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如：结合的一些金属离子，如：MnMn2+2+、 FeFe2+ 2+ 、 o o2+2+、 NiNi2+ 2+ 、 u u2+2+、 ZnZn2+ 2+ 、 CdCd2+ 2+ ; ;n能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，能与

49、羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如：如：CaCa2+2+ 、 BaBa2+2+、 MgMg2+2+ 、 PbPb2+ 2+ ; ;n能巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：能巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：g g2+ 2+ 、 AgAg2+ 2+ 、 PbPb2+ 2+ 。n实际应用时，金属离子的浓度常为实际应用时，金属离子的浓度常为0.02mol/L0.02mol/L。复合物中。复合物中金属离子的去除，可用离子交换法或金属离子的去除，可用离子交换法或EDTAEDTA金属螯合剂。金属螯合剂。例：例： 调调pH4.2 上清液上清液胰岛素粗品溶液胰岛素粗品溶液 30 % 丙酮丙酮

50、 沉淀（杂蛋白）沉淀（杂蛋白）调调pH6.0 上清液上清液Zn2+ 胰岛素锌盐胰岛素锌盐2 2有机盐法有机盐法含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。功能团形成复合物而沉淀析出。 但此法常发生不可逆的沉淀反应，故用于制备蛋白质时，但此法常发生不可逆的沉淀反应，故用于制备蛋白质时，3 3无机复合盐法：无机复合盐法：如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。l若沉淀为金属复合盐，可通以若沉淀为金属复合盐，可

51、通以H2SH2S使金属变成硫化物而除去；使金属变成硫化物而除去；l若为有机酸盐或磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃取，把若为有机酸盐或磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃取，把有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去，或用离子交换法除去。有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去，或用离子交换法除去。16.16. 亲和沉淀亲和沉淀affinity precipitation u亲和沉淀是分离过程的一部分，但是其沉淀原亲和沉淀是分离过程的一部分，但是其沉淀原理与通常的沉淀方法有很大的不同。理与通常的沉淀方法有很大的不同。u它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位体、基质、辅酶等）

52、之间高度专一的相互配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。u所以所以其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据而是依据“吸附吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。解度的大小。亲亲 和和 沉沉 淀淀 n亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单一产品的有效方法。单一产品的有效方法。初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配位体络和形成沉淀；载体上的亲合配

53、位体络和形成沉淀；所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质；洗去可能存在的杂质；用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。解出来。16.9 选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法n选择性变性沉淀法：选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液中选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。目的物分开。n原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使某些物理或化学因

54、素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。n方法可分为：方法可分为：1）利用表面活性剂）利用表面活性剂(三氯乙酸三氯乙酸)或有机溶剂引起变性；或有机溶剂引起变性；2）利用对热的不稳定）利用对热的不稳定性性,加热破坏某些组分，而保存另一些组分；加热破坏某些组分，而保存另一些组分；3）酸碱变性。酸碱变性。选择性变性沉淀法是使选择性变性沉淀法是使杂质杂质变性沉淀，又变性沉淀，又对目的物没有明显影响，所以在操作之前对目的物没有明显影响，所以在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂质的种要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理化学性质等有比较

55、全面类、含量及其物理化学性质等有比较全面的了解。的了解。例如对于例如对于-淀粉酶等热稳定性好的酶，可淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去受热变性沉淀而被除去。选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法u在核酸提取液中加入氯仿在核酸提取液中加入氯仿- -戊醇或氯仿戊醇或氯仿- -辛醇，振荡一辛醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿段时间、使蛋白质在氯仿- -水的界面上形成沉淀而被除水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。去，核酸仍然留在水溶液中。u在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，用苯酚在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在

56、下，用苯酚- -水溶水溶液提取核酸，在液提取核酸，在DNADNA、RNARNA在水溶液中，而蛋白质在苯在水溶液中，而蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去；酚层中形成沉淀而被除去；u在在DNADNA、RNARNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀DNADNA，而而RNARNA留在溶液中。留在溶液中。选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法各种沉淀方法应用范围各种沉淀方法应用范围盐析法：盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸产品

57、的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。等电点沉淀法等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。但单独应用较少，多与其它方法结合使用。沉淀。但单独应用较少，多与其它方法结合使用。非离子多聚体沉淀法：非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。用于分离生物大分子。生成盐复合物沉淀：生成盐复合物沉淀：用于多种化合物，特别是小分用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。子物质的沉淀。选择性沉淀（热变性或酸碱变性沉淀）选择性沉淀（热变性或酸碱变性沉淀）：多用于除：多用于除去某些不耐热的和在一定去某些不耐热的和在一定pHpH值下易变性的杂蛋白

58、。值下易变性的杂蛋白。思考题：思考题：1 .1 .理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶，理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶， 盐析盐析2 .2 .沉淀与结晶有何不同？沉淀与结晶有何不同？3 .3 .有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？用乙醇有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？用乙醇 沉淀蛋白质时应注意哪些事项？沉淀蛋白质时应注意哪些事项？第二讲沉淀法的分类沉淀法的分类 （1）盐析法；）盐析法； （2）等电点沉淀法；）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法；）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法；）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法；）聚电解质沉淀法； （6）复合盐沉淀法等。）复合盐沉淀法等。16.等电点

59、沉淀法等电点沉淀法 isoelectric point precipitation等电点沉淀法等电点沉淀法在低的离子强度下，调在低的离子强度下，调pHpH至至等电点，使蛋白质净电荷为等电点，使蛋白质净电荷为零，降低了静电斥力，而疏零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。形成沉淀。不同的两性电解质具有不同不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进的等电点，以此为基础可进行分离。行分离。生产胰岛素（生产胰岛素（pI5.4pI5.4）时，）时，在粗提液中先调在粗提液中先调PH8.0PH8.0去除去除碱性蛋白质，再调碱性蛋白质，再调PH3.0PH3.0去

60、去除酸性蛋白质。除酸性蛋白质。pH=pI图图16-10表示大豆蛋白的溶解度随表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。的变化情况。等电点沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法注意事等电点沉淀法注意事项项F本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。点时能形成粗大的凝聚物。F但对一些亲水性强的蛋白质。则在低离子强度的溶液但对一些亲水性强的蛋白质。则在低离子强度的溶液中，调中，调pHpH在等电点并不产生沉淀。在等电点并不产生沉淀。F在调节等电点时，如果采用强酸强碱，要注意防止酶在调节等电点时，如果采用强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性