实验12小麦成熟胚愈伤组织诱导

1、 实验目的实验目的 实验原理实验原理 实验材料与药品实验材料与药品 实验方法实验方法 注意事项注意事项 实验作业实验作业 掌握无菌操作技术，了解组织培养的一般掌握无菌操作技术，了解组织培养的一般程序，将小麦成熟胚培养成愈伤组织。程序，将小麦成熟胚培养成愈伤组织。 指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。实验原理实验原理植物细胞全能性：植物细胞全能性： 任何具有完整细胞核的植物细任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必须胞，都拥有形成一个完整植株所必须的全部遗

2、传信息和发育成完整植株的的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。能力。 外植体外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的从植物体上分离下来的用于离体培养的那部分材料。那部分材料。 愈伤组织愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则薄壁细胞，中形成的具有分生能力的一团不规则薄壁细胞，多在植物体切面上产生。多在植物体切面上产生。 脱分化脱分化：已分化好的组织细胞在人工诱导条件下，：已分化好的组织细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过

3、程。或恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。或者说是由高度分化的植物组织或器官产生愈伤组者说是由高度分化的植物组织或器官产生愈伤组织的过程。织的过程。 再分化再分化：脱分化后具有分生能力的细胞再经过与：脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。或者说是由愈伤组织再生出小植株的过的过程。或者说是由愈伤组织再生出小植株的过程。程。 植物体的任何一个细胞都具有全能性植物体的任何一个细胞都具有全能性。分。分化了的植物根、茎、叶等组织器官化了的植物根、茎、叶等组织器官在一定在一定的条件下进行离体培养，给于一定的营养的条

4、件下进行离体培养，给于一定的营养和激素，可以和激素，可以脱分化脱分化为为愈伤组织愈伤组织。愈伤组。愈伤组织在不同的营养和激素的作用下，又可以织在不同的营养和激素的作用下，又可以再生再生出完整的小植株出完整的小植株。植物的。植物的脱分化脱分化和和再再分化分化培养，证明分化了的植物细胞仍具有培养，证明分化了的植物细胞仍具有形成完整植株所需要的形成完整植株所需要的全套基因全套基因。 快速繁殖快速繁殖 一株葡萄一年繁殖到一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花一年繁殖到万多株，一株兰花一年繁殖到500万株左右。万株左右。 种苗脱毒种苗脱毒 通过组织培养可以培育出大量的无毒种苗。已取得成通过组织培养可以培育

5、出大量的无毒种苗。已取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。 远缘杂交远缘杂交 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这种方从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。法获得苹果与梨的杂交种。 突变育种突变育种 组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。中国林科院获得了耐盐的杨氨酸、高蛋白等优良性状的品种。中国林科院获得了耐盐的杨树株系。树株系

6、。 基因工程基因工程 基因工程主要研究基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。过组织培养途径才能实现植株再生。 生物制品生物制品 如抗癌首选药物如抗癌首选药物-紫杉醇等。近年国内在红豆杉组织紫杉醇等。近年国内在红豆杉组织培养中获得生长量很高的细胞系，每升细胞培养物中紫杉醇的培养中获得生长量很高的细胞系，每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达产量可达0.25mg。 愈伤组织愈伤组织利用外植体能培养出完整植株 从高等植物的幼胚、根、茎、叶、花和果实等不同器官的组织中分离的单个细胞，经过特殊培养形成愈伤组织，并可进一步诱导生成完整的植株。完

7、全在于高等植物细胞具有全能性蝴蝶兰蝴蝶兰红豆杉红豆杉培养条件可以人为控制培养条件可以人为控制 摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。年培养生产。 生长周期短，繁殖率高生长周期短，繁殖率高 往往往往20-30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且

8、能及时提供规格一致的优质种苗或故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。脱病毒种苗。 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。 培养基：是植物组织培养的重要基质。培养基：是植物组织培养的重要基质。 没有一种培养基能够适合一切类型的植物组没有一种培养基能够适

9、合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。成功。 培养基的种类：培养基的种类：MS, B5, N6, White, KM-8P等。等。 无机营养无机营养： 大量元素大量元素：N、P、K、S、Ca、Mg 微量元素微量元素：Fe、Mn、Cu、Co、Mu、B等等 有机营养有机营养： 碳源碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖：蔗糖、葡萄糖、果糖 氮源氮源：氨基酸类：氨基酸类 活性物质活性物质：维生素、肌醇等：维生素、肌醇等 植物激素植物激素： 生长素类生长素类：2,4-D 、IAA

10、、NAA、IBA等等 细胞分裂素类细胞分裂素类：6-BA 、激动素、玉米素等、激动素、玉米素等 其它类其它类：赤霉素、脱落酸、乙烯：赤霉素、脱落酸、乙烯 支持物支持物： 琼脂等琼脂等 生长素与细胞分裂素的比例生长素与细胞分裂素的比例决定着外植体的发育方决定着外植体的发育方向，是形成愈伤组织、长根还是长芽。向，是形成愈伤组织、长根还是长芽。大量实验结果表明，大多数植物组织或器官的大量实验结果表明，大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论植物激素控制理论，即当生长素与细胞分裂素的比例高时，即当生长素与细胞分裂素的比例高时，愈伤组织仅形成根；生长素与细胞分裂

11、愈伤组织仅形成根；生长素与细胞分裂素的比例小时则产生苗；而两种激素的素的比例小时则产生苗；而两种激素的比例适中时，则产生无结构的愈伤组织。比例适中时，则产生无结构的愈伤组织。 为了使用方便和用量准确，常将为了使用方便和用量准确，常将大量元素大量元素、微量元微量元素、铁盐、有机物类和激素类素、铁盐、有机物类和激素类分别配制成比培养基分别配制成比培养基浓度大若干倍的母液。当配制培养基时，只需按预浓度大若干倍的母液。当配制培养基时，只需按预先计算好的量吸取母液稀释即可。先计算好的量吸取母液稀释即可。 母液应保存在冰箱中备用，保存时间不可过长，当母液应保存在冰箱中备用，保存时间不可过长，当母液出现沉淀

12、或霉菌团时，则不能使用。母液出现沉淀或霉菌团时，则不能使用。(1)(1)大量元素母液大量元素母液 可配成浓度可配成浓度10倍母液。倍母液。 (2)(2)微量元素母液微量元素母液 可配成浓度可配成浓度100倍的母液。倍的母液。(3)(3)铁盐母液铁盐母液 可配成可配成100倍的母液，倍的母液，(4)(4)有机物母液有机物母液 可配成可配成1 100倍的母液。倍的母液。(5)(5)激素母液的配制激素母液的配制 每种激素必须单独配成母液，每种激素必须单独配成母液，浓度一般配成浓度一般配成0.20.2mgml。用时根据需要取用。因。用时根据需要取用。因为激素用量较少，一次可配成为激素用量较少，一次可配

13、成50ml50ml或或100ml100ml。 1).各化合物必须充分溶解后才能混合。各化合物必须充分溶解后才能混合。 2).混合时注意先后顺序，特别要将钙离子与混合时注意先后顺序，特别要将钙离子与硫酸根离子，磷酸根离子错开，以免产生硫硫酸根离子，磷酸根离子错开，以免产生硫酸钙、磷酸钙等不溶性化合物沉淀。酸钙、磷酸钙等不溶性化合物沉淀。 3).混合时要慢，边搅拌边混合。混合时要慢，边搅拌边混合。培养基的配制、消毒与分装培养基的配制、消毒与分装100倍微量元素母液倍微量元素母液(10ml)10倍大量元素母液倍大量元素母液(100ml)调调pH到到5.8100倍铁盐母液倍铁盐母液(10ml)培养基培

14、养基100倍有机物质母液倍有机物质母液(10ml)定容到定容到1000ml2,4-D 2mg/L 6-BA 0.5mg/L琼脂粉琼脂粉g溶解溶解 分装（每瓶分装（每瓶30ml)高压灭菌高压灭菌 蔗糖蔗糖g 小麦籽粒小麦籽粒 MS培养基培养基+2mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA 70%酒精酒精 2.5%NaCLO 无菌水无菌水 培养基的配制。培养基的配制。 小麦籽粒用无菌水浸泡小麦籽粒用无菌水浸泡10小时。小时。 取材、消毒和接种。取材、消毒和接种。正式接种前正式接种前30min30min，打开超净工作台上的紫外灯和风，打开超净工作台上的紫外灯和风机，机，30min30min后接种

15、；后接种；上超净台的第一件事是关闭紫外灯并打开照明灯；上超净台的第一件事是关闭紫外灯并打开照明灯；把解剖刀、镊子、解剖针等器械浸泡在把解剖刀、镊子、解剖针等器械浸泡在7575酒精中；酒精中；点燃酒精灯；点燃酒精灯；用用7575的酒精棉球擦拭双手；的酒精棉球擦拭双手；外植体的消毒外植体的消毒：把麦粒置于：把麦粒置于70 %70 %乙醇中浸泡乙醇中浸泡5min5min，之，之后在后在2.5%NaClO2.5%NaClO中消毒中消毒15min15min，然后用无菌水冲洗，然后用无菌水冲洗3 3次。次。 超净台上操作超净台上操作（）用酒精棉球擦手，然后点燃废酒精棉球擦拭超净（）用酒精棉球擦手，然后点燃

16、废酒精棉球擦拭超净台工作台面。取出一张无菌滤纸，放在面前。台工作台面。取出一张无菌滤纸，放在面前。（）用酒精灯火焰烧灼刀柄、刀片、镊子等，自然冷（）用酒精灯火焰烧灼刀柄、刀片、镊子等，自然冷却后置于无菌滤纸上。却后置于无菌滤纸上。（）取一瓶培养基，除去橡皮筋，揭开封口膜，把培（）取一瓶培养基，除去橡皮筋，揭开封口膜，把培养基放在紧靠酒精灯火焰无菌区的后方。养基放在紧靠酒精灯火焰无菌区的后方。（）用酒精棉球擦手，尤其是左手拿麦粒的二个手指（）用酒精棉球擦手，尤其是左手拿麦粒的二个手指和指甲边缘。和指甲边缘。（）剥离成熟胚并接种，盾片一面向上。注意无菌操（）剥离成熟胚并接种，盾片一面向上。注意无菌操作，均匀接种作，均匀接种10个即可。个即可。（）盖好封口膜，缠好皮筋，用记号笔在培养瓶封口（）盖好封口膜，缠好皮筋，用记号笔在培养瓶封口膜上写好班级姓名。膜上写好班级姓名。 放入培养箱，放入培养箱，25培养培养7-10天后观察记录。天后观察记录。培养基消毒、外植体消毒、超净台消毒和操作者无菌操作是培养基消毒、外植体消毒、超净台消毒和操作者无菌操作是否符合规范，是防止菌类污染的关键；否符合规范，是防止菌类污染