扶正治标法对青少年花粉症患者相关基因表达的影响

1、扶正治标法对青少年花粉症患者相关基因表达的影响【摘要】 目的： 研究中药治疗花粉症的作用机理。方法： 选择50例花粉症患者，口服敏康片，治疗6个月后观察疗效及FcRI,IL-4R,IL-5R,HLA-A基因表达情况，并以20例变应性皮炎和19例正常人为对照，用Northern blot检测FcRI,IL-4R,IL-5R的变化。用RT-PCR 法检测HLA-A，计算相对光密度值。结果： 花粉症组患者症状有明显改善（P<0.05），治疗前后血清总IgE比较差异有统计学意义（P<0.01），花粉症组4个基因的表达治疗前与正常人比较，差异均具有统计学意义(P&lt

2、;0.01)，治疗后与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.01)。变应性皮炎组治疗前FcRI,IL-4R与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)，治疗前后FcRI比较，差异有统计学意义(P<0.05)。鼻炎组、皮炎组HLA-A相对光密度值均较正常组高，两组治疗前后也有不同程度的改善(P<0.05)。结论： 中药可以调整花粉症患者相关基因表达，改善患者过敏体质，缓解临床症状。 【关键词】 花粉症； 敏康片； 基因表达； Northern blot； 中医药疗法Abstract Objective: To evaluate the eff

3、icacy of Minkang tablet on gene express in the patients with hay fever. Methods： The trial involved 50 patients with hay fever,20 patients with atopic dermatitis, Minkang tablet(three capsule, twice a day, 6 months) was given to patients with hay fever(50)，also 19 as normal as control. Results： The

4、symptom and IgE after medication had difference highly statistically significant before medication. The FcRI,IL-4R,IL-5R,HLA-A related with atopy before and after medication, FcRI,IL-4R,IL-5R,HLA-A in the patients with hay fever and in normal were different highly statistically significant(P<

5、0.01) before medication; and genes express improved significantly(P<0.01) after medication. FcRI,IL-4R of the patients with atopic dermatitis and in normal were statistically significant(P<0.05) before medication, FcRI improved significantly(P<0.05) after medication. Conclusion：

6、 Minkang tablet was effective in controlling gene express on patients with hay fever.Key words hay fever; herb; gene express; northern blot; TCM花粉症是一种常见的变态反应性疾病，临床以鼻塞、流涕、喷嚏、鼻痒等为主要症状,全球平均发病率在 10%25%左右1。近年来，我国的发病率也有逐渐上升趋势。西医学的治疗多采用对症处理，能够较好地控制临床症状，但容易复发，副反应大。中医治疗从调整患者过敏体质着手，有标本同治的效果，但作用机理却不清楚。2002年1月2

7、005年12月，我们就中药对花粉症患者相关基因表达的影响做了初步研究，现报告如下。1 对象与方法1.1 研究对象1.1.1 临床资料 全部患者和正常人均来自我们2004年3月2004年12月在河南林州进行的临床调查。花粉症组50例，男性33例，女性17例，年龄1218岁，平均（14.5±1.2）岁。变应性皮炎组20例，男性13例，女性7例，年龄1217岁，平均（14.2±1.3）岁。正常组19例，男性13例，女性6例，年龄1317岁，平均（15.8±1.1）岁。经统计，各组基本情况差别无统计学意义。1.1.2 纳入和排除标准 花粉症诊断标准根据1997年中华医学会

8、在海口修订的变应性鼻炎诊治标准2。变应性皮炎诊断参照Williams标准3。患者需同意进入治疗观察，在此期间坚持服用待试药物，每周记录症状，停止其他一切治疗手段。排除以下病例：同时使用相应激素或其他药物；合并有影响判定疗效的鼻病如鼻息肉、鼻窦炎等；合并有心、脑血管，肝、肾和造血系统等严重原发性疾病。1.2 方法1.2.1 药物及服法 花粉症组和变应性皮炎组患者口服敏康片（灵芝、虫草菌丝体等），每日2次，每次3片。正常组口服金施尔康（中美施贵宝有限公司生产）每日1次，每次2片。各组均治疗6个月。1.2.2 主要仪器和试剂 Trizol(Invitrogen公司)，Invitrogen胶回收试剂盒

9、，Beckman DU7500紫外分光光度计（美国 Beckman 公司），电泳仪（Bio-Rad公司）。1.2.3 检测项目 两组均采用北京海奥公司IVT过敏原试剂检测总IgE。用Northernblot法检测FcRI,IL-4R和IL-5R基因表达水平。地高辛标记探针(FcRI,IL-4R,IL-5R引物均由Sangon公司合成)。FcRI引物序列参照文献4；IL-4R引物序列参照文献5；IL-5R引物序列参照文献6。用RT-PCR 法检测HLA-A，HLA-A 引物由Sangon 公司合成,引物序列参照文献7：5-GACGACACGCAGTTCGTGC-3，5-CATGTCCGCCGCG

10、GTCCAA-3，目的片段331 bp，内参-actin 引物5-CACCATGTACCCTGGCATTG-3，5-TAACGCAACTAAGTCATAGT-3。采用英国Syngene公司凝胶分析系统(GDS 8000, Gene Tools from Syngene software)检测计算各组光密度值。1.3 统计学方法 应用SPSS统计软件,两样本均数差异采用t检验（方差不齐进行t检验）,取0.05为检验水准。2 结果2.1 临床疗效 参照中华医学会在海口修订的“变应性鼻炎诊治标准及疗效评定标准”2判断疗效。花粉症组显效22例，有效19例，无效9例，总有效率82，治疗前症状积分为9.8

11、6±1.44，治疗后为4.04±1.38，治疗前后差异有统计学意义（P<0.05）。2.2 免疫学指标比较 经过敏原试剂检测总IgE，花粉症组与变应性皮炎组患者治疗前后血清总IgE的比较见表1。 表1 两组治疗前后血清总IgE比较（略）Tab 1 Comparison of serum total IgE betweendifferent groups#: P<0.05，#: P<0.01，与治疗前比较 2.3 基因表达水平比较 花粉症组和变应性皮炎组IL-4R治疗前与正常组比较差异有统计学意义（花粉症组t=34.820 3，P&a

12、mp;lt;0.01；皮炎组t=18.466 8，P<0.01）。花粉症组IL-4R治疗前后比较,差异有统计学意义t=44.565 1, t(0.050 0)=2.0117, P<0.05。花粉症组IL-5R治疗前与正常组比较,差异有统计学意义（t=33.624 4，P<0.01），治疗前后比较差异有统计学意义t=41.184 6, t(0.050 0)=2.011 7，P<0.05。 FcRI两组治疗前与正常组比较,差异有统计学意义花粉症组t=52.831 9，P<0.01；皮炎组t=22.232 2, t(0.050 0

13、)=2.108 6, P<0.05，治疗前后组内比较,差异亦有统计学意义花粉症组t=55.105 7,P<0.01；皮炎组t=17.999 1, t(0.050 0)=2.109 8, P<0.05。详见表2。 用RT-PCR 法检测HLA-A，通过计算各组相对光密度值（目的条带光密度内参-actin 条带光密度），结果花粉症组、变应性皮炎组HLA-A 均较正常组表达高，而两组治疗前后均有不同程度的改善（见表3）。直接从各组电泳结果也可看出，相关基因表达情况与以上处理结果一致（图1）。表2 各组治疗前后光密度值比较（略）Tab 2 Comparison

14、 of D value between three Groups#：P<0.05，#:P<0.01，与治疗前比较; *:P<0.05，* :P<0.01,与正常组比较（4例抽提DNA失败） 图1 各组电泳图（略）Fig 1 Electrophoregram in different Groups表3 各组HLA相对光密度（略）Tab 3 Comparatively D value of HLA-A betweenthree Groups#: P<0.05，#:P<0.01，与治疗前比较； *:P<

15、0.05，*: P<0.01，与正常组比较（4例抽提DNA失败） 3 讨论 花粉症是发生在鼻粘膜的变态反应性疾病，属I型变态反应。变应原初次被吸入后, 刺激机体产生特异性IgE,T淋巴细胞和巨噬细胞等。特异性IgE结合在鼻粘膜上皮细胞和表面的肥大细胞、嗜碱细胞的细胞膜上，此时鼻粘膜便处于致敏状态。当再次吸入变应原时，变应原即与肥大细胞、嗜碱细胞表面的IgE 发生桥连，同时激发T 淋巴细胞和巨噬细胞，继而发生一系列生化反应，导致以组胺为主的多种介质释放。这些介质通过鼻粘膜血管、腺体、神经末梢上的受体等,引起机体(系统)和鼻粘膜上皮细胞局部明显的组织反应而发病。 目前大多数学者认为，

16、花粉症是一种多基因疾病。其发病除与环境、免疫等因素有关外，还有明显的遗传倾向, 但其遗传基因尚不清楚。鉴于过敏者在遗传学上有结构和功能上的特征和缺陷，而现代基因技术又为探讨这种特征和缺陷，弄清中医药对相应基因表达的调控作用提供了可能，因此，本项研究将从体质之本先天（遗传）因素出发，研究花粉症（过敏体质患者）的基因表达特点以及治本中药对相关基因表达的影响，并以特应性皮炎为平行对照，正常人为参照。由于变态反应炎症中有很多细胞因子参与，且相应有高水平表达，所以在相关细胞因子及其受体的基因位点寻找特应症的候选基因也是一个研究的方向。目前研究主要在集中在IL-4,IL-5,IgE等。现已证明，IL-4为

17、多反应性免疫调控因子，对B细胞、T细胞、巨噬细胞等的增殖、分化具有重要调控作用，能诱导B细胞产生IgE；IL-5则促进嗜酸性粒细胞增生、分化；位于嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的IgE/FcRI复合体结合相应变应原，介导型速发型超敏反应8。产生IgE 的调控基因位于HLA 区域，许多花粉症的基因研究集中在这一区域。目前国外对上述基因的研究较多，关于它们与过敏性疾病相关性的结论也较为明确9-11，故而本项研究选择了这几个基因。 花粉症属于祖国医学“鼻鼽”范畴。多数医家认为本病的病因病机是风寒之邪外袭，肺脾肾内虚。其病机中外邪固然是致病诱因，但根本还在于肺气虚。敏康片是何裕民教授的经验方，由灵芝、虫草

18、、白芷等组成，具有益肺、固本、通窍之功效。方中灵芝滋补强壮、益气固本，虫草补肺益肾，助阳填精，强壮滋补，白芷通鼻窍。现代研究提示灵芝有较强的免疫调节能力12，虫草多糖单独或协同PHA 诱导IL-2R 的表达,促进可溶性IL- 2R 的生成，对外周血淋巴细胞具有双向免疫调节作用13。服药后患者主要临床症状积分有所改善，血清总IgE也有所下降，表明体内的高致敏状态有所缓解。 我们的研究结果提示，患者的相关基因表达水平也有所改变14。IL-4R在两组患者中治疗前均较正常组高，花粉症组治疗后降低。花粉症组治疗前IL-5R较正常组高，治疗后降低。两组治疗前FcRI均较正常组高，治疗后均降低。变应性皮炎组

19、IL-4R,FcRI治疗前均较正常组表达高，治疗后只有FcRI有所降低。花粉症组、皮炎组HLA-A 均较正常组表达高，而治疗后有不同程度的改善。从以上结果可以看出，FcRI,HLA-A,IL-4R和IL-5R主要在花粉症患者中改变比较多，敏康片的疗效也相对较好。而变应性皮炎组上述基因表达改变不大，疗效也不是很明显。这主要是因为我们在立项时，主要查询了花粉症的文献，在此基础上选择上述基因作为观察项目。而敏康片的配方也主要针对花粉症，从中医理论上讲不适合皮炎病机，疗效亦一般。通过对几个基因的检测，我们可以初步看出，敏康片对花粉症等的作用，一方面是调节相关IgE调控基因，达到改善机体高敏状态的作用，

20、另一方面可以调节细胞因子相关基因，缓解机体的炎症，减轻症状。这是个多环节的调节过程。 对照药物选用金施尔康主要是从体质研究的角度考虑，同时顾及医学伦理和患者的可接受度。金施尔康作为多种维生素和微量元素的复合保健品，并没有明确的治疗变应性鼻炎的疗效，只具有安慰剂的性质。同时，有研究表明变应性鼻炎患者存在微量元素的失衡，肺气虚、脾气虚和肾气虚者，发锌含量低于常人，铜/锌值升高，同时发锰含量亦升高15,因此，从某种意义而言，金施尔康也具有治疗作用，也带有治本的性质，但不同于治疗组药物改善气虚体质的治本，它改善、调整的是患者体内可能存在的微量元素失衡的状况。【参考文献】 1 王德云.应重视对变应性鼻炎

21、的研究J.中华耳鼻咽喉科杂志,2005,40(3):163-165.2 中华医学会耳鼻咽喉科学分会，中华耳鼻咽喉科杂志编辑委员会.变应性鼻炎诊治标准及疗效评定标准J.中华耳鼻咽喉科杂志,1998,33(3):134.3 顾 恒,陈祥生,陈 菎,等.特应性皮炎诊断标准的评价J.中华皮肤科杂志,2000,33(4):222.4 Wakahara S, Fujii Y, Nakao T,et al. Gene expression profiles for Fc epsilon RI, cytokines and chemokines upon Fc epsilon RI activation in

22、 human cultured mast cells derived from peripheral bloodJ. Cytokine, 2001, 16(4):143-152.5 Saito S, Harada N, Ishii N, et al. Functional expression on human trophoblasts of interleukin 4 and interleukin 7 receptor complexes with a common gamma chainJ. Biochem Biophys Res Commun,1997,231(2):429-434.6

23、 Rizzo CA, Yang R, Greenfeder S, et al. The IL-5 receptor on human bronchus selectively primes for hyperresponsivenessJ.J Allergy Clin Immunol， 2002,109(3):404-409.7 Palmisano GL, Pistillo MP, Capanni P,et al. Investigation of HLA class I downregulation in breast cancer by RT-PCRJ. Hum Immunol. 2001,62(2):133-139.8 龙振周.医学免疫学M. 北京：人民卫生出版社，1997:22.9 Izuhara K, Yanagihara Y, Hamasaki N,et a