提取工艺川桐皮中总黄酮的提取工艺研究

1、金 华 职 业 技 术 学 院JIN HUA COLLEGE OF PROFESSION AND TECHNOLOGY毕业教学环节成果(2012届)题 目川桐皮中总黄酮的提取工艺研究学 院 制药与材料工程学院 专 业 生物制药技术 班 级 制药 093 学 号 200931100380346 姓 名 罗超超 指导教师 郑柏勤 2012年5月22日金华职业技术学院毕业教学环节成果目录摘要11 材料与设备21.1 材料 2 实验药材2 1.1.2 化学试剂21.2 仪器与设备 2 2 方法与结果3 2.1总黄酮含量的测定103标准曲线的制备32.1.2 样品液制备与样品总黄酮含量的测定32.2 提

2、取工艺研究4 2.2.1 提取溶剂对提取率的影响4 2.2.2 粉碎度对提取率的影响42.2.3 乙醇浓度对提取率的影响5 2.2.4 浸提时间对提取率的影响6 2.2.5 浸提温度对提取率的影响 6 2.2.6 液料比对川桐皮黄酮类化合物提取的影响72.2.7 正交试验83结果与讨论9 参考文献 10 谢辞11 川桐皮中总黄酮的提取工艺研究制药与材料工程学院生物制药技术专业 罗超超摘要：为充分利用川桐皮资源，对川桐皮中总黄酮的提取工艺进行研究 ，对乙醇浓度、温度、时间、料液比分别进行了单因素试验和正交试验。结果表明，乙醇提取法的最佳工艺条件为：提取温度 70 ，乙醇浓度 70，提取时间 12

3、0min，料液比1:25(g/mL)，该工艺条件下提取总黄酮含量为54.12 mg/g。关键词：川桐皮 正交试验 总黄酮 提取Study on Extraction Technology of Total Flavonoids from Cortex KalopanacisLUO Chao-chao( Major of Biopharmaceutical Technology, School of Pharmaceutical Science and Materials Engineering)Abstract：To make full use of Cortex Kalo

4、panacis resources, the extraction technology of total flavonoids from Cortex Kalopanacis was studied by single factor tests and orthogonal experiment design method. The optimized extraction technology was that the Cortex Kalopanacis were extracted by 70% ethanol at 70 with a material- liqu

5、id ratio of 1:25(g/mL) for 120 min. With this technological conditions, the concentration 54.12 mg/g of the total flavonoids extraction was obtained.Key words：Cortex Kalopanacis Orthogonal experiment Total flavonoids Extraction川桐皮为五加科植物刺楸 Kalopanaxsepteml- obus (Thunb.) Koidz.或毛刺楸 K. septem lob

6、us var. margni cus(Zabel) Hand-Mazz. 的干燥树皮。刺楸为落叶乔木，枝有粗刺。生于山地疏林中。产于安徽、湖北、湖南、广西。全年可采，以春季为好，晒干1。依照现行的四川省中药材标准（1987 年版）收载了川桐皮的性状、鉴别、炮制、性味、功能与主治、用法用量和贮藏的内容。性状为质脆，断面纤维性，略呈层片状。性味为气微，味微辛，略有麻舌感。功能与主治为具有祛风湿，通络，止痛作用。用于类风湿性关节炎、腰膝疼痛、外用跌打损伤2。树皮含黄酮、香豆素、树酯、精油及少量生物碱;根皮含刺楸毒甙（kalotoxin）、刺楸皂甙3。生物总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物。黄酮

7、类化合物是指具有C6-C3-C6基本结构的天然产物，大部分是色原酮的衍生物，根据两端苯环与中间三碳的连接方式、位置、直连或环及其氧化水平，衍生而成的一大类化合物。黄酮类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、保肝、止咳祛痰、抗氧化和雌激素样的作用4-8。黄酮类化合物广泛存在于植物中，主要有黄酮和黄酮醇、二氢黄酮和二氢黄酮醇、异黄酮和二氢异黄酮、查耳酮和二氢查耳酮类、橙酮类、花色素和黄烷醇类、其他黄酮类七大类9。由于人工合成的总黄酮存在着副作用大及价格昂贵等多方面缺陷，人们逐渐把注意力转向从植物中提取总黄酮，从天然物质中提取的总黄酮具有较好的药理作用，且毒副作用小。总黄酮的主要提取方法是有机溶剂提

8、取法、超声波辅助提取法、微波提取法、超临界 CO2萃取法、酶浸渍萃取法、超高压辅助提取法等等。比较各提取方法的优缺点和考虑到当前的实验室条件，本研究采用有机溶剂提取法。目前对于川桐皮的有关研究国内报导的比较少。鉴于此，笔者探讨川桐皮中的总黄酮提取工艺参数，旨在寻找一种提高川桐皮中总黄酮提取量的方法，也为全面开发利用川桐皮资源提供科学依据。1 材料与设备1.1 材料实验药材 川桐皮采自四川省成都市山区，经成都中医药大学中药鉴定和药用植物教研室李敏教授鉴定，为五加科植物刺楸KaIopanax septemIobus(Thunb)Koidz或毛刺楸尼septem-lobus vatmargni，ic

9、us(Zabel)Hand-Mazz的干燥树皮。1.1.2 化学试剂乙醇 甲醇 石油醚（3060）乙醚：广东汕头市西陇化工厂；乙酸乙酯：天津市北方化玻采购销售中心；丙酮：成都市联合化工试剂研究所；浓盐酸：德阳市孝泉师范化学试剂厂；氢氧化钠：重庆北碚精细化工厂；三氯化铝 亚硝酸钠：天津市科密化学试剂开发中心；硝酸铝：天津市福晨化学试剂厂；以上试剂均为分析纯。标准芦丁（98.5 ）：成都超人植化有限责任公司。1.2 仪器与设备DFT一200型手提式高速中药粉碎机：温岭市大德中药机械有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生华仪器有限公司；SHB-B95型循环水式多用真空泵：郑州市长城科工贸有限

10、公司；HH-S4数显恒温水浴锅：金坛医疗器械厂；UV-8紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；BPl21S电子天平：德国赛多利斯股份公司。2 方法与结果2.1总黄酮含量的测定10标准曲线的制备准确称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥（60 ，0.09 MPa）至恒重的芦丁标准品0.077g，用60 %乙醇溶解，定容至250 mL，摇匀，得浓度为0.292 6 mg/mL的标准液，放置于低温暗箱内，及时检测分别吸取标准应用液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，用60 %乙醇添至10 mL，加入5 %亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，再加入1

11、0 %硝酸铝溶液1.0 mL，6 min后加入4 % NaOH10 mL，混匀，再用60 %的乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后，在波长510 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，见图1。图1 芦丁与吸光度的线性关系2.1.2 样品液制备与样品总黄酮含量的测定准确称取1.0 g川桐皮粉，放入索氏抽提器中，用40mL95%的乙醇，回流浸提至回流液呈无色,用乙醇洗涤接收瓶2次3次。合并提取液与洗涤液，定容为适当浓度的样品液30 mL。准确吸取1.0 mL 样品液置于25 mL 容量瓶中，用60 %乙醇添至10 mL，其它操作同，测得吸光度A。样品的总黄酮浓度C=2.079×A+0.03

12、3样品的总黄酮含量=C×V×25/M式中：M为样品质量，g；V为定容容积，mL ；C为样品液的总黄酮浓度，（mg/mL）。2.2 提取工艺研究2.2.1 提取溶剂对提取率的影响精确称取多份2.5g 粉碎度为100 目的川桐皮粉，分别加入水、甲醇、乙醇（95%）、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（3060 ）各100 mL，在溶剂沸点温度下，回流浸提3h，抽滤、洗涤、定容，测定总黄酮含量。结果见表1、图2。表1 提取剂种类对提取率的影响溶液种类水甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯石油醚总黄酮含量（mg/g)12.4157.8650.1620.399.981.25图2 提取剂种类对提取率的影响由图2可

13、见，实验的几种溶剂对川桐皮总黄酮提取能力的大小顺序是：甲醇>乙醇>丙酮>水>乙酸乙酯>石油醚。2.2.2 粉碎度对提取率的影响 将川桐皮粉碎，筛得20、40、60、80、100、120、140目川桐皮粉备用。精确称取2.5g不同粉碎度的川桐皮粉，用100 mL95%的乙醇，在溶剂沸点温度条件下，回流浸提3h，抽滤、洗涤、定容，分别测定总黄酮的含量，结果见表2、图3。表2 粉碎度对提取率的影响粉碎粒度/目20406080100120140总黄酮含量（mg/g)5.0513.8632.4237.2636.0238.3235.86图3 粉碎度对提取率的影响由图3可以看出

14、，粉碎度不同，川桐皮中总黄酮提取量有很大的差异。粉碎度在20目80目之间时，随粉碎度的增加，总黄酮的浸提量增加；当粉碎度超过80目后，进一步提高粉碎度，总黄酮的提取量增加不明显。2.2.3 乙醇浓度对提取率的影响精确称取多份2.5g 的80目川桐皮粉，以不同浓度乙醇为提取剂，在沸点温度条件下，回流浸提3h，抽滤、洗涤、定容，分别测定总黄酮的含量，结果见表3、图4。表3 乙醇浓度对提取率的影响乙醇浓度/%（体积浓度）405060708095总黄酮含量/(mg/g)28.12 34.4242.2246.2345.4243.18图4 乙醇浓度对提取率的影响从图4可以看出，不同乙醇浓度（体积分数）条件

15、下，川桐皮黄酮类化合物的浸提率差异较大。当乙醇浓度为40%70%（体积分数）时，黄酮类化合物的浸出率随乙醇浓度的增加而提高；乙醇浓度70%（体积分数）时，提取率最高；超过70%（体积分数）时，随乙醇浓度增加黄酮类化合物浸提率略有降低。2.2.4 浸提时间对提取率的影响精确称取多份2.5g的80目川桐皮粉，以70%的乙醇溶液为提取剂，在沸点温度下，分别回流浸提不同时间，抽滤、洗涤、定容，测定黄酮类化合物的含量，结果见表4、图5。表4 浸提时间对提取率的影响浸提时间/min6090120150180210总黄酮含量/(mg/g)28.1236.2150.1451.2250.5449.82图5 浸提

16、时间对提取率的影响从图5可以看出，浸提时间在120min以内，随提取时间的增加，总黄酮的浸出量也随之增加。当浸提时间超过120min后，川桐皮总黄酮的浸出量增加不明显。浸提超过150min后，总黄酮量略有降低。2.2.5 浸提温度对提取率的影响精确称取多份2.5g的80目川桐皮粉，加入70%（体积分数）乙醇为提取溶剂，分别在25（室温）、40、50、60、70、80、90条件下回流浸提，抽滤、洗涤、定容，分别测定黄酮类化合物的含量，结果见表5、图6。表5 浸提温度对提取率的影响浸提温度/25405060708090总黄酮含量/(mg/g)10.1422.2138.1250.4550.9849.

17、8647.16图6 浸提温度对提取率的影响从图6可以看出，温度低于70后，随温度的升高，黄酮类化合物的浸出率提高；25（室温）时川桐皮黄酮类化合物浸出率最低，70 时黄酮类化合物的浸出率最高。当温度超过70后，其浸出率随温度升高而略有下降。2.2.6 液料比对提取率的影响精确称取2.5g的80目川桐皮粉，分别按料液比/(g/mL)为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30加入70%（体积分数）乙醇，在70条件下回流浸提120min，抽滤、洗涤、定容，测定黄酮类化合物的含量，结果见表6、图7。表6 液料比对提取率的影响料液比/(g/mL)1:101:151:201:251:30总黄酮含量

18、/(mg/g)28.1836.7650.5554.1256.34 图7 液料比对提取率的影响从图7可以看出，随料液比/(g/mL)从1:10（g/mL）增加为1:25（g/mL），总黄酮的浸出率明显增加；超过1:25（g/mL）后浸出率增加缓慢。2.2.7 正交试验在乙醇浓度、液料比、浸提温度、浸提时间的实验结果中，选择单因子试验结果较好的参数，设计了正交试验，结果见表7、表8。表7 四因素三水平表A料液比/(g/mL)B乙醇浓度/%C时间/minD温度/11: 20601206021: 25701507031: 308018080表8 正交试验结果试验号A料液比/(g/mL)B乙醇浓度/%C

19、时间/minD温度/黄酮含量/(mg/g)1111132.012122244.093133339.604212342.575223149.466231252.137313245.288321351.679332143.94K1115.70119.86135.81125.41/K2144.16145.22130.60141.50/K3140.89135.67134.34133.84/R9.4868.4541.7375.364/从正交试验结果可以看出，极差RA>RB>RD>RC，液料比对川桐皮中总黄酮浸出率的影响最大，其次是乙醇的浓度,提取的温度值，提取时间对总黄酮浸出率的影响最

20、小。乙醇回流浸提川桐皮中总黄酮的最佳浸提条件为A2B2C1D2 即料液比为1:25(g/mL)，提取温度为70 ，提取时间为120 min，乙醇浓度为70 % 在此条件下，3次重复实验，川桐皮中总黄酮的含量为54.12 mg/g。3结果与讨论（1）提取溶剂对提取率的影响的实验可以看出甲醇和乙醇是较好的川桐皮中总黄酮提取剂。分析原因可能与川桐皮中总黄酮的结构及存在状态有关。因为苷和苷元、单糖苷、双糖苷或三糖苷等在不同的溶剂中有不同的溶解度。从川桐皮总黄酮在甲醇、乙醇中浸出率较高，在丙酮、乙酸乙酯、石油醚中浸出率较低的事实，结合黄酮、黄酮醇、查耳酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇等的性质，可以推测，川桐皮总

21、黄酮中黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类的含量相对较高。虽然甲醇的浸出率略高于乙醇，但由于甲醇有毒，考虑到试剂的价格和安全性，所以，本研究后续实验选择乙醇作为提取剂。（2）粉碎度对提取率的影响的实验可以看出川桐皮粉碎到过80目筛是总黄酮提取时适宜的粉碎度。分析原因，可能与总黄酮存在于川桐皮的特定组织有关。随粉碎度的增加，更多的组织结构被破坏，其总黄酮能被溶剂更多地提取出来，但当粉碎达到一定程度后，进一步提高粉碎度，提取量不表现为继续增加。（3）乙醇浓度对提取率的影响的实验可以看出不同乙醇浓度（体积分数）条件下，川桐皮总黄酮的浸提率差异较大。分析原因，可能与川桐皮黄酮类化合物中既含有苷，又含有一定量

22、的苷元有关。因为在不同浓度的乙醇溶液中水和乙醇的相对含量是不同的，苷和苷元在不同浓度的乙醇溶液中有不同的浸出特性；在乙醇浓度为 70%（体积分数）左右时，苷和苷元被浸提出的总量较高。提高乙醇浓度，浸提率因苷的溶解度降低而降低。鉴于此，后续研究选择了70%乙醇溶液为提取剂。（4）浸提时间对提取率的影响的实验可以看出不同时间段下，川桐皮总黄酮的浸提率差异较大。分析原因可能与总黄酮中的某些组分在试验温度下分解损失，或与浸提时间延长，淀粉糊化量增加而阻碍了部分总黄酮被浸提出来有关。（5）浸提温度对提取率的影响的实验可以看出不同温度范围内，川桐皮总黄酮的浸提率差异较大。分析原因，可能与在一定温度范围内升

23、高温度有利于提高总黄酮溶解度有关；但当温度超过70后，可能因淀粉部分糊化阻碍总黄酮浸出，或因部分热不稳定成分受热被破坏有关。（6）料液比对提取率的影响的实验可以看出不同料液比条件下，川桐皮总黄酮的浸提率差异较大。分析原因可能与川桐皮中总黄酮含量较高，而在溶剂内的溶解度又有限有关。当溶剂用量在一定范围内增加时，总黄酮的浸出量增大，浸出率增加。但当溶剂用量增加到一定程度后，川桐皮中总黄酮几乎已全部溶出，此时增加溶剂用量不能进一步提高浸出率。因此，选择适当的液料比对提高川桐皮黄酮的浸出率和减少溶剂用量有着重要的意义。（7）在进行正交试验时，依照单因子试验结果较好的参数：乙醇浓度、浸提时间、浸提温度、

24、料液比。得出料液比对川桐皮总黄酮浸出率的影响最大，乙醇浓度、提取温度次之，提取时间对总黄酮的浸出率影响最小。在温度为70 条件下，以70 %（体积分数）乙醇溶液为提取剂，料液比1:25(g/mL)，回流浸提120 min，川桐皮总黄酮提取量达到54.12 mg/g。参考文献1 周长海刺楸资源的培育及开发利用林业科技开发，2005，19(2)，57-58.2 四川省卫生厅四川省中药材标准 S19873 朱玮，贾夏，张鞍灵，等刺楸属植物化学成分及生物活性研究进展 J，西北林学院学报 ,2004，19(3) ，119-124.4 匡海学.中药化学专论M.北京:人民卫生出版社,2010:339-340.5 宋晓凯.天然药物化学M.北京:化学工业