选择性环氧合酶-抑制剂尼美舒利对胃癌细胞增殖的影响

1、浙江大学硕士学位论文选择性环氧合酶-2抑制剂尼美舒利对胃癌细胞增殖的影响姓名：沈亦斌申请学位级别：硕士专业：外科学（胃肠外科）指导教师：于吉人20060401浙江大学届硕士学位论文选择性环氧合酶一抑制剂尼美舒利对胃癌细胞增殖的影响浙江大学医学院级七年制导师胃肠外科沈亦斌于吉人中文摘要近来研究表明在胃癌组织和癌前病变的腺瘤或增生性组织中，均发现环氧合酶一（一）的高表达。体外研究发现，环氧化酶抑制剂能抑制胃癌细胞生长，改变胃癌细胞周期，从而诱导其调亡。尼美舒利（），是新型的非甾体抗炎药，化学名为一硝基一一苯氧基甲磺酰苯胺，是一种选择性一抑制剂。本研究观察选择性环氧合酶一（一）抑制剂尼美舒利对人胃癌

2、细胞株一增殖的影响，并探讨其可能的机制。本实验中，培养人胃癌细胞一，在不同的时间（，）予以不同剂量（，“）的尼美舒利，采用啪汀比色法测试细胞活性，应用流式细胞技术分析胃癌细胞周期变化及凋亡。实验结果显示：不同剂量（，几）的尼美舒利对人胃癌细胞株一的增殖均有抑制作用。的尼美舒利抑制率最浙江大学届硕士学位论文低，作用不同时间（，）后的抑制率分别是：、：弘儿的尼美舒利抑制率最高，作用不同时间（，）后的抑制率分别是：、。同时尼美舒利改变了胃癌细胞一的细胞周期分布，不同浓度尼美舒利（，“几）作用小时后，期细胞所占比例分别是：、。流式图谱显示胃癌细胞一经、斗扎的尼美舒利作用后出现明显的亚二倍体凋亡峰，调亡

3、率分别为：、。以上实验结果表明：尼美舒利能显著抑制人胃癌细胞株一的增殖，其可能枫制与诱导细胞摄亡阻止细胞周期进展有关。【关键词】：尼美舒利；胃癌细胞株；凋亡浙江大学届硕士学位论文选择性环氧合酶一抑制剂尼美舒利对胃癌细胞增殖的影响浙江大学医学院级七年制导师胃肠外科沈亦斌于吉人序言流行病学资料显示：在很多胃癌组织中环氧合酶一（一，一）呈高表达状态，与胃癌的发生发展有密切的关系。】。长期服用一抑制剂可降低胃癌的发病危险性，具有一定的化学预防作用嗍。近年来，选择性环氧化酶一抑制剂的抗肿瘤作用日益引起重视。尼美舒利是一种人工合成的环氧化酶一特异性抑制剂，为磺酰胺类消炎镇痛药，能抑制炎症组织内前列腺素的合

4、成，而不抑制胃黏膜内前列腺索的合成，因而能缓解炎症症状，对胃及十二指肠等的不良反应则较轻【】。本研究通过、流式细胞仪、电镜等检查，观察体外尼美舒利对人胃癌细胞株一的作用，并探讨其可能的作用机制，为临床上开辟新的抗癌途径提供实验室依据。浙江大学届硕士学位论文材料和方法主要试剂、尼美舒利（公司），培养基、胰蛋白酶（公司）、小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）。主要仪器：恒温。培养箱（美国公司）倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；透射电镜（日立型）；流式细胞仪（，美国公司）；酶联免疫检测仪（国营华东电子管厂）一冰箱购于美国衄 埘公司。细胞培养：人胃癌细胞株购自中科院上海细胞库。细胞以培养基，加入小牛

5、血清和 青霉素及血链霉素，于、孵箱内培养，天传代一次。法检测尼美舒利对细胞抑制率的影响取对数生长期细胞制成细胞悬液，以每孑×个细胞接种于孔板。培养后分别加入不同浓度的尼美舒利（，¨儿），每种浓度设个复孔。继续培养、后，每孔分别加人（咖），继续孵育后弃上清，加入二甲基亚砜（）¨，振荡分钟，用酶标仪测定波长处的吸光值（埘 时，值）。浙江大学届硕士学位论文结果倒置显微镜观察尼美舒利作用后，胃腺癌细胞形态学的变化透射电镜检测可见未加药的对照组细胞核仁清楚，细胞外布满丝状微绒毛，经尼美舒利处理后，不贴壁的细胞数增多，细胞出现皱缩、变小、变圆、细胞器肿胀、染色质聚集于核膜下、

6、细胞内颗粒状物增多等变化，胞浆内可见凋亡小体形成。检测尼美舒利对细胞增殖的影响不同浓度尼美舒利加入培养基，培养一细胞、，用法测定细胞生长。如图所示：不同浓度的尼美舒利对胃腺癌细胞一的增殖均有抑制作用，呈时间一剂量依赖性抑制细胞生长。儿的尼美舒利抑制率最低，作用不同时间（，）后的抑制率分别是：、；“的尼美舒利抑制率最高，作用不同时间（，）后的抑制率分别是：、。浙江大学届硕士学位论文表尼美舒利对细胞周期的影响浙江大学届硕士学位论文图（无尼美舒利作用后的细胞周期分析）图（“尼美舒利作用后的细胞周期分析）浙江大学届硕士学位论文图（尼美舒利作用后的细胞周期分析）图（儿尼美舒利作用后的细胞周期分析）浙江大

7、学届硕士学位论文图（尼美舒利作用后的细胞周期分析）图（尼美舒利作用后的细胞周期分析）浙江大学届硕士学位论文讨论是一种诱导型酶，在正常生理状态下多数组织内检测不到。而在许多肿瘤组织和转化细胞中存在着的高表达。有研究表明，在胃癌组织、癌前病变的腺瘤或增生性组织中，发现的表达明显增高【】胁曲等【研究发现的贲门癌及的胃体癌呈阳性表达。等研究也同样证实在胃癌组织中表达明显升高。同时，发现一具有过氧化物酶活性，可使致癌剂发生氧化反应，从而导致致癌剂激活导致肿瘤发生【】；它的过度表达与肿瘤新生血管形成有关¨】：它还会促进肿瘤细胞增殖，抑制其凋亡【】以及提高肿瘤发生及转移的潜能，增加肿瘤细胞的侵袭力

8、【】等。因此，一有望成为成为肿瘤防治的一个新靶点。尼美舒利，是新一代选择性一抑制剂。有研究【】认为尼美舒利通过选择性抑制环氧化酶一的活性，导致生成减少，削弱其对细胞、自然杀伤细胞活性的抑制，起动细胞免疫监视作用，帮助清除新生细胞。在体外研究¨】中发现，环氧化酶抑制剂能抑制胃癌细胞生长，诱导其调亡，存在剂量和时间的依赖关系，对细胞周期无影响。但有研究【”认为：体外尼美舒利对肿瘤细胞的作用不是诱导细胞凋亡，而是通过阻滞细胞周期的进展，使细胞在期或期堆积，在高浓度时直接导致细胞死亡，并认为这与肿瘤细胞体外长时间接触环氧化酶抑制剂有关。本研究经试验，证实体外尼美舒利对一的增殖有明显的抑制作用

9、，其抑制率与尼美舒利的浓度和作用时间有相关性。结果显示，不同浓度的尼美舒利作用后一均表现出明显的抑制作用，“尼美舒利作用天后抑制率可达。抑制率与尼美舒利的浓度和作用时间呈依赖浙江大学届硕士学位论文方式。这为临床上使用选择性一抑制剂作为抗癌药物提供了实验室的依据，从而避免长期使用非选择性抑制剂所导的胃肠道副作用。流式细胞仪显示，经尼美舒利作用后，的细胞周期发生了明显的变化，期细胞相对减少，期细胞明显增多，提示尼美舒利对胃腺癌细胞一增殖的抑制主要作用于期、阻滞细胞周期的进程，从而诱导其凋亡。应用流式细胞术检测细胞凋亡具有很高的灵敏性，并能进行凋亡细胞的定量分析。本研究结合流式细胞技术对细胞周期和凋

10、亡的分析：发现尼美舒利能诱导一细胞凋亡，其可能机制与改变胃癌细胞周期有关，使细胞堆积在期，从而诱导细胞的凋亡。本实验证实，尼美舒利在体外能有效抑制胃癌细胞株增殖，这无疑将开拓选择性一抑制剂的应用前景。因而深入研究其作用机理和体内抗癌理想剂量，以求提高疗效，减少药物的副作用，将有重大的临床意义。浙江大学届硕士学位论文，：】，眦 ， 印衄砒 锄 ，：】吴开春，吴汉平，韩英，等一在胃癌细胞中的相关信号传导胃肠病学，（增刊）：【】， 丘趾一、曲 锄 印 。 ，：【】聪皿， ，孤 ，趾 锯 加；（）：【】）（， ，枷 芏 帆缸 们雠 ；（）：浙江大学帅届硕士学位论文环氧合酶一（一）与胃癌（综述）环氧合酶

11、一（一）是炎症过程中的一个重要的诱导酶，炎症过程中前列腺素的产生主要由它来催化合成。但近年来，国内外诸多研究表明，一参与了肿瘤的发生，是肿瘤防治的一个新靶点“。现将一与胃癌的关系做综述。，环氧合酶一（一）在胃癌中的表达国外有学者报道胃癌组织中蛋白阳性表达率在。等“检测了贲门腺癌例，胃体腺癌例及邻近的正常上皮组织中一的表达，结果发现的贲门癌及的胃体癌呈阳性表达。 的过度表达主要见于大部分胃体腺癌和少部分贲门腺癌组织中。等“用法研究了例胃腺癌（例早期胃癌，例进展期胃癌）邻近正常胃粘膜组织中一一表达水平。结果发现，有，（）病例胃癌组织中表达水平明显升高。但例早期胃癌和例中的例进展期胃癌呈弱表达水平或

12、与癌旁组织有相同表达水平。胃癌组织一过表达与癌细胞中淋巴管浸润、淋巴结转移和分期密切相关，但与组织病理分级、肿瘤大小、静脉瘤栓不相关。提示一过表达可能增强胃癌的淋巴浸润及转移潜能，且预后不佳。一在胃癌及癌旁组织中表达无明显差异。国内对食管癌的研究也得到类似的结果。皿等“采用免疫印记方法分析了例胃癌组织和个胃癌细胞系，发现过表达与淋巴管浸润、淋巴结转移及临床分期密切相关。微卫星不稳定（）阳性胃癌组织中一明显低于阴性的病例，同时无表达的一些胃癌细胞阳性胃癌组织中一明显低于阴性的病例，同时无表达的一些胃癌细胞浙江大学届硕士学位论文系中可见不同程度的一表达，而有表达的胃癌细胞系中无一表达。以上说明一在

13、胃癌的发展过程中起重要作用，而阳性与阴性病例可能具有不完全相同的癌变机制。等采用 法检测了例胃腺癌新鲜标本的和一，结果发现胃癌组织一 水平明显高于正常胃粘膜，而一水平在胃癌组织中未升高。免疫组化检测发现一蛋白局限于细胞质和过度增殖的腺体，但在周围间质细胞及胃粘膜的正常腺管未见表达。等“报道不同胃癌细胞系一表达水平不同，如（细胞系（高分化腺癌）和（细胞系（印戒细胞癌）一表达较弱，而姬 细胞系（分化差的腺癌）表达增强。因一过度表达与胃炎程度无关，推测炎细胞刺激不大可能增强癌组织一的过表达。，环氧合酶一（一）致肿瘤的机制一的过表达可以促进肿瘤细胞增殖，抑制其凋亡一的活性增高可提高凋亡抑制基因卜的表达

14、水平，降低介导凋亡的转化生长因子一（）型受体水平，降低介导细胞间粘附的一钙粘蛋白（）活性，从而抵抗各种刺激诱导的细胞凋亡，并且能提高细胞与细胞外基质蛋白的粘附能力，增加肿瘤细胞的侵袭力。前列腺素作为一种血管渗透性因子在肿瘤生长增殖及肿瘤组织血管渗透性中发挥着重要的生物学作用，一高水平表达，合成大量，导致肿瘤细胞增生“。另外，一表达上调可通过对表皮生长因子受体的诱导使细胞对生长的敏感性增加从而发挥促使细胞增殖作用“。浙江大学届硕士学位论文促进肿瘤血管生成资料表明一的过度表达能促进肿瘤的新生血管生成，为肿瘤生长和转移提供必需的营养“。等“通过对例原发性胃腺癌患者的研究发现，例（）有卜蛋白的过度表达

15、，且一过度表达的患者微血管密度（）较一表达不增加者明显增加。将转染一基因的结肠癌细胞株一和人脐静脉内皮细胞株（）联合培养，发现一细胞在过度表达的同时，促血管生成因子、和等均明显上调，并能促进在型胶原凝胶中增殖、变形，向肿瘤细胞迁移以及形成网状的内皮细胞索。抑制机体免疫功能有关一对肿瘤免疫影响的文献报道不多。等发现，人胃癌细胞一呈过表达时，可增强淋巴细胞浸润与转移。发现”，结肠癌细胞表达的一可抑制中性粒细胞浸润和巨噬细胞活化，从而导致抗肿瘤免疫监视机能抑制。等将淋巴细胞与高表达一的人结肠癌细胞株共同培养，发现淋巴细胞的增生指数较对照组显著降低，选择性一抑制剂可抑制这一作用，同时使的浓度降低。因而

16、，一在结肠癌的过度表达可引起局部免疫抑制。一也可通过在肿瘤免疫中发挥作用：如可抑制具有免疫调节功能的淋巴因子产生，抑制细胞和细胞增殖，细胞母细胞化及抑制细胞、细胞和的细胞毒活性。同时，。还可抑制的产生，诱导一产生。一与肿瘤的转移临床资料表明一的表达与肿瘤细胞的淋巴结转移呈正相关。一促进肿瘤细胞转移的机制除通过促进肿瘤细胞增殖和新生血管形成等间接因素外，还与其直浙江大学届硕士学位论文参考文献 ， ：、【】 ，（）：】 【 ）售 】加 ，（）：【】妇曲，浙江大学届硕士学位论文【】戤 ，址，（ 擎加 ，：【】，：舢 ，眄 ， ）（ ，：【 】 ，酗， ， 。 而 ，：】划 ， ，洲【 ， ，；：【 ， ，：；【】 ， ， ；：浙江大学届硕士学位论文致谢毕业在即，首先感谢我的导师于吉人老师，三年来在他的悉心指导、辛勤培养和亲切关怀下，使我能顺利完成学习任务。他在胃肠外科学领域中开阔的