聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯修饰阿霉素脂质体的制备和性

1、中国科技论文在线聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯修饰阿霉素脂质体的制备和性质基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（Y206534） 王文喜1，张楠1，单伟光1，高建清2，梁文权2作者简介：王文喜，男，副教授通信联系人：张楠（1985），男，硕士. E-mail: 2765508121.51.51.51.51.5Zhejiang university of technology,Hangzhou,310014;Zhejiang university of technology,Hangzhou,310014;Zhejiang university of technology,Hangzhou,3

2、10014;Zhejiang university ,Hangzhou,310058;Zhejiang university ,Hangzhou,310058浙江工业大学，杭州，310014;浙江工业大学，杭州，310014;浙江工业大学，杭州，310014;浙江大学，杭州，310058;浙江大学，杭州，310058310014;31001413666609235;057188320722;057984189823;浙江工业大学朝晖校区;浙江工业大学朝晖校区;yjw;276550812;swg;276550812;276550812王文喜，男，副教授;张楠（1985）

3、，男，硕士;王文喜;张楠;单伟光;高建清;梁文权Wang Wenxi;Zhang Nan;Shan Weiguang;Gao jianqing;Liang Wenquan张楠浙江省自然科学基金资助项目（Y206534）1.51.51.51.51.51.51.51*|*期刊*|*Liang X, Mao G, Ng KYS. Mechanical properties and stability measurement of cholesterol-containing liposome on mica by atomic force microscopy J. J.Colloid Interf

4、ace Sci,2004,278(1):53-62.<CR>2*|*期刊*|*Torchilin VP, Levchenko TS, Whiteman KR, et al. Amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidones: : synthesis, properties and liposome surface modificationJ. Biomaterials, 2001,22(22):3035-44.<CR>3*|*期刊*|*Shehata T, Ogawara K-i, Higaki K, et al. Prolongation of

5、 residence time of liposome by surface-modification with mixture of hydrophilic polymersJ. Int.J.Pharm,2008,359(1-2):272-9.<CR>4*|*期刊*|*Zhu J, Yan F, Guo Z, et al. Surface modification of liposomes by saccharides: Vesicle size and stability of lactosyl liposomes studied by photon correlation s

6、pectroscopyJ. J.Colloid Interface Sci, 2005,289(2):542-50.<CR>5*|*期刊*|*Ke W-T, Lin S-Y, Ho H-O, et al. Physical characterizations of microemulsion systems using tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS) as a surfactant for the oral delivery of protein drugsJ. J.Controlled Release,20

7、05,102(2):489-507.<CR>6*|*期刊*|*Shin S-C, Kim J. Physicochemical characterization of solid dispersion of furosemide with TPGSJ. Int.J.Pharm, 2003,251(1-2):79-84.<CR>7*|*期刊*|*Bansal T, Akhtar N, Jaggi M, et al. Novel formulation approaches for optimising delivery of anticancer drugs based

8、on P-glycoprotein modulationJ. Drug Discovery Today 2009,14(21-22):1067-74.<CR>8*|*期刊*|*Wempe MF, Wright C, Little JL, et al. Inhibiting efflux with novel non-ionic surfactants: Rational design based on vitamin E TPGSJ. Int.J.Pharm, 2009,370(1-2):93-102.<CR>9*|*期刊*|*Barenholz Y. Liposome

9、 application: problems and prospectsJ. Curr Opin. Colloid Interface Sci, 2001,6(1):66-77.<CR>10*|*期刊*|*Fritze A, Hens F, Kimpfler A, et al. Remote loading of doxorubicin into liposomes driven by a transmembrane phosphate gradientJ. BBA - Biomembranes 2006,1758(10):1633-40.<CR>11*|*期刊*|*C

10、hen C, Han D, Cai C, et al. An overview of liposome lyophilization and its future potentialJ. J.Controlled Release,142(3):299-311.<CR>12*|*期刊*|*Wang S-n, Deng Y-h, Xu H, et al. Synthesis of a novel galactosylated lipid and its application to the hepatocyte-selective targeting of liposomal doxo

11、rubicinJ. Eur J Phar Biophar, 2006,62(1):32-8|1|王文喜|Wang Wenxi|浙江工业大学，杭州，310014|Zhejiang university of technology,Hangzhou,310014|王文喜，男，副教授|浙江工业大学朝晖校区|310014|yjw|057188320722lt;CR>*|2|张楠|Zhang Nan|浙江工业大学，杭州，310014|Zhejiang university of technology,Hangzhou,310014|张楠（1985），男，硕士|浙江工业大学

12、朝晖校区|310014|276550812|057984189823lt;CR>|3|单伟光|Shan Weiguang|浙江工业大学，杭州，310014|Zhejiang university of technology,Hangzhou,310014|swg|<CR>|4|高建清|Gao jianqing|浙江大学，杭州，310058|Zhejiang university ,Hangzhou,310058|276550812|<CR>|5|梁文权|Liang Wenquan|浙江大学，杭州，310058|Zhejiang unive

13、rsity ,Hangzhou,310058|276550812|聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯修饰阿霉素脂质体的制备和性质|Preparation and characterization of TPGS-modified doxorubicin liposomes|浙江省自然科学基金资助项目（Y206534）- 7 -（1. 浙江工业大学，杭州，310014；2. 浙江大学，杭州，310058）摘要：目的 制备聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)修饰的脂质体，并对其理化性质进行考察。方法 采用硫酸铵梯度法制备阿霉素脂质体，阳离子交换树脂吸附法测定药物包封率，用透析法测定其体外释放

14、，透射电镜观察脂质体形态，激光粒度测定仪测定粒度分布和Zeta电势，并考查了脂质体稳定常数Ke、药物泄漏率以及胎牛血清对脂质体粒度的影响。结果 TPGS修饰的脂质体形态规整，药物包封率为95±2.13%（n=3）；zeta电位为-3.06mv，平均粒径为68.7nm，多分散指数为0.186；TPGS修饰后能显著提高脂质体的贮藏以及在血清中的稳定性，大大降低药物泄漏率，而体外释放快于普通脂质体。结论：TPGS修饰的阿霉素脂质体具有良好的稳定性和广阔的应用前景。关键词：脂质体；TPGS；阿霉素；稳定性中图分类号：R94Preparation and characterization of

15、 TPGS-modified doxorubicin liposomesWang Wenxi1, Zhang Nan1, Shan Weiguang1, Gao jianqing2, Liang Wenquan2(1. Zhejiang university of technology,Hangzhou,310014;2. Zhejiang university ,Hangzhou,310058)Abstract: OBJECTIVE To prepare doxorubicin liposomes modified by TPGS1000, and investigate their phy

16、sicochemical properties. METHODS Liposomes were prepared by thin-film ultrasonic technology, the doxorubicin was remotely loaded by (NH4)2SO4-gradiend method.The encapsulation efficiency of doxorubicin was determined via cationic resin absorption. Drug release in vitro was carried out with dialysis

17、bag; the morphological characterization of liposomes was observed by transmission electron microscopy; particle size distribution and zeta potential were determined by laser nanoparticles size analyzer; stability constant(Ke), drug leakage and the influence of fetal bovine serum on the particle size

18、 distribution was also investigated. RESULTS TPGS-modified liposomes exhibited uniform shape with high drug encapsulation efficiency of 95±2.13%(n=3). The Zeta potential was about -3.06 mv and mean diameter was 68.7nm with polydispersity index of 0.186. Compared to conventional doxorubicin lipo

19、somes, the modified liposomes exhibited significant stability during storage as well as in serum. TPGS reduced drug leakage from liposomes during storage in spite of enhancing the release in vitro. CONCLUSION Doxorubicin liposomes modified by TPGS showed favorable stability and good prospect.Key wor

20、ds: liposome; TPGS; doxorubicin; stability0 引言脂质体由于具有良好的靶向性、缓释性、细胞亲和性等优点，已广泛用于抗肿瘤药物、抗寄生虫药物、抗结核、抗菌药物、激素类、蛋白多肽以及基因治疗药物等的载体。然而由磷脂和胆固醇组成的脂质体为热力学不稳定体系，在体内外的稳定性很差，严重限制了其临床应用和工业化生产1。为此，近年来很多学者采用各种高聚物来修饰脂质体以提高其稳定性，取得了良好的效果2 3 4。本文拟采用维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS）来修饰脂质体，考察其对阿霉素脂质体理化性能的影响。TPGS是一种维生素E的水溶性衍生物，由维生素E琥珀酸和

21、聚乙二醇酯化而成，是一种性能优良的非离子型表面活性剂，在制剂中可作为增溶剂、吸收促进剂、乳化剂、增塑剂以及固体分散体的载体5 6。近年来发现其对P-gp有抑制作用，可有效地逆转肿瘤细胞的多药耐药性7 8，已广泛用于抗肿瘤药物的传递系统中。1 仪器和试剂SpectraMax M2e多功能酶标仪(美国分子仪器公司)；JEM透射电子显微镜（日本电子公司）；RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-IIIA循环水式多用真空泵（河南省太康科教器材厂）；JY92超声细胞粉碎机(宁波新芝科技研究所)； DelsaNano激光粒度测定仪（Beckman公司)；TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪

22、器厂)；大豆卵磷脂 S100（德国Lipoid公司）；胆固醇(国药集团化学试剂有限公司) ；阿霉素（浙江海正药业有限公司）；TPGS（新昌制药厂）；其它试剂均为分析纯。2 方法和结果2.1 TPGS修饰的盐酸阿霉素脂质体的制备工艺精密称取卵磷脂400 mg，TPGS200 mg，胆固醇100 mg，用20 mL乙醇超声溶解，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜（温度32），加入0.3 M硫酸铵溶液10mL，剧烈震摇使膜脱落，50 水化2h，冰浴下用细胞破碎仪探头超声200次（工作功率450 w，工作时间3 s，间隔时间3 s），室温冷却并放置4 h后，转移至透析袋中，在1000 mL含10%蔗糖水溶液中

23、室温透析24h，用10%蔗糖的水溶液稀释至25 mL，与2 mg·mL-1盐酸阿霉素的10%蔗糖溶液等体积混合，40孵育1.5h，即制得含TPGS修饰的阿霉素脂质体。2.2 包封率的测定2.2.1 标准曲线绘制精密吸取0.750，0.625，0.500，0.375，0.250，0.125 mL盐酸阿霉素标准贮备液（1 mg·mL-1）于25 mL量瓶中，加80%的酸性乙醇（含0.1M HCl）至刻度，配成浓度分别为30，25，20，15，10 ，5g·mL-1标准溶液，以80%酸性乙醇为空白，在495 nm处测其吸光度，以吸光度对浓度作图，求得标准曲线方程为A=0

24、.0224C-0.0014，相关系数r=0.9998。2.2.2 方法精密度试验精密配制10，20，30 g·mL-1 3个浓度，每一浓度配制3份，测定其日内精密度，计算RSD分别为1.09%，0.15%，0.37%(n=3)。同法测定其日间精密度，RSD分别为0.77%，0.6%，0.47%(n=3)。2.2.3 加样回收率试验精密吸取1 mg·mL-1盐酸阿霉素标准贮备液，并加入0.5 mL空白脂质体，用酸性乙醇溶液溶解稀释成10，20，30 g·mL-1溶液，每一浓度配制3份，以酸性乙醇溶液为空白，在495 nm测定吸收度，计算回收率分别为100.4%，10

25、0.6%和100.3%；RSD分别为0.9%，0.22% 和0.3% (n=3)。 2.2.4 阳离子交换树脂柱测包封率精密移取阿霉素脂质体1 mL，滴入阳离子交换树脂柱中，缓慢放出柱里面的部分水，使脂质体与阳离子柱充分接触，放置5 min，用去离子水洗脱，收集10 mL洗脱液于50 mL容量瓶中，加入0.45 mL浓盐酸并用无水乙醇至刻度，以80%酸性乙醇为空白，在495 nm测定波长，记作AE。另取脂质体1mL于50mL容量瓶中，加入80%的酸性乙醇至刻度。以80%酸性乙醇为空白，在495 nm测定波长，记作AT ，按下式计算包封率：Encapsulation(%)=（AT-AE）/AT1

26、00%结果测得普通的阿霉素脂质体的包封率为98±1.33%（n=3）；TPGS修饰的阿霉素脂质体的包封率为95±2.15%（n=3）2.3 粒径、形态和Zeta电势2.3.1 阿霉素脂质体粒径和Zeta电位：取制备的阿霉素脂质体用激光粒度测定仪测定其粒径分布和Zeta电位，测定条件和参数设置如下：测定温度为20 ，平衡时间5 min，介质折光率为1.3478，粘度为1.336 mPas。TPGS修饰的阿霉素脂质体平均粒径为68.7nm（图1），聚分散指数为0.186，Zeta电位为-3.06mv；普通阿霉素脂质体平均粒径为107.5nm，聚分散指数为0.176，Zeta电位

27、为-2.84mv。 A B图1阿霉素脂质体的粒径分布（以光强计) A TPGS修饰阿霉素脂质体 B 普通阿霉素脂质体Fig.1 Size distribution of TPGS-modified and conventional doxorubicin liposomes counted by intensity A TPGS-modified doxorubicin liposomes B Conventional doxorubicin liposomes2.3.2 阿霉素脂质体的形态取脂质体滴加于铜网上，用滤纸从铜网边缘吸去多余液体，滴加3%的磷钨酸溶液进行负染，吸干负染液，自然风干，

28、置于透射电镜下观察脂质体的形态并拍照。结果见图2，从图2中可看出本法所制得的阿霉素脂质体形态规整，几呈球形，采用TPGS修饰后，脂质体的粒径明显变小，与激光粒度测定仪测定的粒径结果基本一致。 A B图2阿霉素脂质体的投射电镜照片(×50000倍数)A TPGS修饰阿霉素脂质体 B 普通阿霉素脂质体Fig.2 Transmission electron microgram of TPGS-modified and conventional doxorubicin liposomesA TPGS-modified doxorubicin liposomes B Conventional

29、doxorubicin liposomes2.4 稳定常数的测定 采用离心法测定脂质体悬液的稳定常数Ke值。阿霉素脂质体悬液以5000 r·min-1离心30 min，离心后的悬液在590 nm下测定吸光度，记作A1；取未离心的阿霉素脂质体，在590nm下测定吸光度，记作A0；按下式计算稳定常数：Ke=（A0-A1）/ A1×100%Ke值越小，脂质体越稳定。结果测得TPGS修饰的阿霉素脂质体和普通阿霉素脂质体的Ke值分别为28.7±1.6%和40.2±1.1%(n=3)，表明TPGS修饰后可提高脂质体的物理稳定性。2.5 阿霉素脂质体释放度2.5.1

30、阿霉素荧光标准曲线精密配置100 g·mL-1的阿霉素HEPES 缓冲液（HBS， pH7.4），分别移取3，1.5，0.75，0.45，0.15 mL用HBS定容到50mL，配成6，3，1.5，0.9，0.3 g·mL-1的标准溶液，取标准溶液5 mL，加10 mL酸性乙醇混匀，用荧光分光光度计测定荧光强度（Ex为480 nm，Em为590 nm），以荧光强度对浓度作图，求得阿霉素的荧光标准曲线方程为F=237.11C+7.8463， r=0.9994，表明在0.12g/mL浓度范围内，阿霉素的荧光强度和浓度间的线性良好。2.5.2 阿霉素脂质体的体外释放取脂质体1mL放

31、入透析袋内两头夹紧，置于含200 mL pH7.4的HBS缓冲液的锥形瓶中，于37 的恒温振荡器中振荡，于规定时间点取透析液5mL，用2倍体积的酸性乙醇(80% 0.1M HCL)稀释，测定荧光强度，计算阿霉素脂质体的累积释放量。结果发现制成脂质体后，阿霉素的体外释放大大降低，TPGS修饰脂质体的体外释药速率明显快于普通的脂质体（图3）。图3 阿霉素脂质体体外释放曲线1：TPGS修饰的阿霉素脂质体() 2：普通的阿霉素脂质体(×)Fig.3 Release profile in vitro of TPGS-modified and conventional doxorubicin l

32、iposomes1：TPGS-modified doxorubicin liposomes() 2：Conventional doxorubicin liposomes(×)2.6 阿霉素脂质体在胎牛血清中的稳定性将脂质体和胎牛血清1:1(V:V)混合，两天后观察其变化，结果发现普通的阿霉素脂质体浊度变大，而TPGS修饰的阿霉素脂质体依旧透亮。按2.3.1测定其粒径分布，发现普通阿霉素脂质体在6001700nm出现了一个新的峰(图4)，平均粒径从107.5nm增大到124.6nm，说明普通阿霉素脂质体在胎牛血清中发生了聚集，而TPGS修饰的脂质体在血清中几无改变，表明TPGS修饰后能

33、显著提高脂质体在血清中的稳定性。图4阿霉素脂质体在胎牛血清中的粒径分布Fig.4 Size distribution of TPGS-modified and conventional doxorubicin liposomes counted by intensity in fetal calf serum 1 TPGS-modified doxorubicin liposomes(×) 2 Conventional doxorubicin liposomes()2.7 阿霉素脂质体的渗漏率把制好的脂质体置于冰箱4保存，分别于0.5，1，2，3个月后重新测定阿霉素的包封率，方法同2

34、.2.4。结果发现2个月后，普通脂质体中阿霉素的包封率急剧下降，渗漏非常严重，而TPGS修饰的脂质体中阿霉素的包封率几无改变，表明TPGS能显著提高阿霉素的稳定性（图5）。图5阿霉素脂质体的泄漏率比较1：TPGS修饰的阿霉素脂质体() 2：普通的阿霉素脂质体(×)Fig.5 comparison of leakage profile of TPGS modified doxorubicin liposome and conventional doxorubicin liposomes1：TPGS modified doxorubicin liposomes() 2：Conventio

35、nal doxorubicin liposomes(×)3 结果讨论硫酸铵梯度法制备阿霉素脂质体的原理：由于NH3的渗透系数1.3×10-1 cm·s-1较H+（10-310-8 cm·s-1）和SO42 （约1012 cm·s-1)大9，在脂质体内外硫酸铵的浓度梯度下，NH3不断外流，使得脂质体内部酸化，形成“质子池”，阿霉素透膜进入脂质体内水相后质子化并与SO42形成胶质沉淀，减少向外水相的扩散，并驱使重新平衡的外水相阿霉素继续扩散进入脂质体内部10，使得阿霉素的包封率可达90%以上。TPGS可改变磷脂双分子层的排布，降低其相变温度，使得通

36、透性增加，因此在制备过程中若透析时间过长或者温度过高，都能使内水相硫酸铵的泄漏和内外pH梯度差的减小，而使得包封率的下降,如本研究中发现60下孵育1.5h的包封率为88.3±2.2%(n=3)。本研究过程中还发现外水相介质对阿霉素脂质体的稳定性有较大的影响，当选用pH7.4的HBS作为外水相介质时，一星期内的泄漏率超过40%，而用10%蔗糖作为外水相时，其渗漏率大大减小，这可能是与蔗糖溶液的粘度，密度,“水置换”等作用有关。另外蔗糖可作为脂质体的冻干保护剂,可将制得的脂质体直接冻干，而无需加入其它保护剂，减少冻干添加剂对脂质体性能的影响11。脂质体包封率的测定方法有分子排阻法（凝胶柱

37、分离法），超速离心法，超滤法，透析法等。葡聚糖凝胶柱分离法存在药品稀释大、耗时长等缺点，冷冻超速离心法需要设备要求高，而超滤法对于易变形或小粒径的脂质体也有不同程度的滤过。本实验采用阳离子交换树脂吸附游离药物，使含药脂质体和游离药物有效分离而测得药物包封率，具有操作简单、耗时短、成本低等优点12，可用于弱碱性药物脂质体包封率的测定，但需要注意的是所用的磷脂必须是中性或负电性，不可用于阳离子型脂质。TPGS是由美国Eastman公司最先开发出来的一种水溶性维生素E，已被美国药典收载，在国外已广泛应用于各种制剂研究，但将其作为脂质体的修饰材料尚未见报道。本研究结果表明TPGS修饰后能显著减少贮存期

38、间的药物渗漏，提高脂质体在血清稳定性的稳定性，这可能是因为TPGS有聚乙二醇的亲水链增加脂质体亲水性，避免了或减少了血清中蛋白质结合。至于TPGS对脂质体的体内循环时间和组织分布的影响需要进一步的研究。参考文献 (References)1 Liang X, Mao G, Ng KYS. Mechanical properties and stability measurement of cholesterol-containing liposome on mica by atomic force microscopy J. J.Colloid Interface Sci,2004,278(1)

39、:53-62.2 Torchilin VP, Levchenko TS, Whiteman KR, et al. Amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidones: : synthesis, properties and liposome surface modificationJ. Biomaterials, 2001,22(22):3035-44.3 Shehata T, Ogawara K-i, Higaki K, et al. Prolongation of residence time of liposome by surface-modification w

40、ith mixture of hydrophilic polymersJ. Int.J.Pharm,2008,359(1-2):272-9.4 Zhu J, Yan F, Guo Z, et al. Surface modification of liposomes by saccharides: Vesicle size and stability of lactosyl liposomes studied by photon correlation spectroscopyJ. J.Colloid Interface Sci, 2005,289(2):542-50.5 Ke W-T, Lin S-Y,