多糖分离及结构研究

1、多糖分离纯化的基本原则和方法多聚糖(polysaccharide)，简称多糖，常由一百个以上甚至几千个单糖基通过糖苷键连接而成的，其性质已大不同于单糖，如甜味和强的还原性已经消失，广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一，与生命功能的维持密切相关。近年来，大量研究表明多糖除了有增强免疫功能、抗肿瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系统保护作用的生物学效应外，还有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等作用。 1、基本原则 在不破坏多糖活性的前提下进行多糖的分离纯化。尽量不引入新的杂质，或引入的新杂质易于除去，如小分子盐类可经过透析作用除去，铵

2、根离子可通过加热挥发除去等1。 2、分离纯化方法 多糖的生物活性倍受关注，但不少多糖的提取方法和工艺尚未成熟，基于效率、成本多方面的考虑，各种方法的开发、比较、分析是研究工作的焦点之一。目前多糖提取方法主要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、超临界流体萃取法。首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同，决定在提取之前是否做预处理：提取时需注意对一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在用水提取前，应先加入甲醇或l：l的乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂，而对含色素较高的根、茎、叶、果实类，需进行脱色处理。 2.1多糖的提取与分离方法 

3、;    由于各类多糖的性质及来源不同，所以提取方法也各有所异，主要归纳为以下几类：     第一类  难溶于水，可溶于稀碱液的主要是胶类，如木聚糖及半乳糖等。原料粉碎后用0.5mol/L NaOH水溶液提取，提取液经中和及浓缩等步骤，最后加入乙醇，即得粗糖沉淀物。     第二类  易溶于温水，难溶于冷水的多糖，可用7080热水提取，提取液用氯仿：正丁醇（4:1）混合除去蛋白质，经透析、浓缩后再加入乙醇即

4、得粗多糖产物2。 第三类  粘多糖的提取。在组织中，粘多糖与蛋白质以共价键结合，故提取时需设法破坏粘多糖与蛋白质之间的结合键。通常使用蛋白酶水解蛋白部分或碱处理，使粘多糖与蛋白质之间的结合键断裂，以促进粘多糖的释放以便于提取3。 （1）碱液提取法：本法的主要依据是蛋白聚糖的糖肽键对碱不稳定。原料经预处理后用0.5mol/L NaOH溶液4提取，提取液用酸中和。蛋白质可用调pH、加热、或用白陶土吸附法除去。最后以乙醇沉淀即可获得成品。从软骨中提取软骨素即用此法。 （2）蛋白水解酶消化法：从组织中释放出粘多糖的方法，经常使用的是蛋白水解酶进行消化。一般应用专一性低的蛋

5、白酶如木瓜蛋白酶及链霉素以进行广泛的蛋白质水解。经酶消化后的提取液中主要还有低分子量得蛋白消化产物及残存蛋白等杂质。蛋白质可用5%三氯醋酸沉淀去除，小分子的杂质可用透析法去除。最后加入乙醇可得粘多糖沉淀。 2.2多糖的除杂质 蛋白质的去除，通过水提所获得的粗多糖常含有较多的蛋白质。采用醇沉 或其它溶剂沉淀得到的粗多糖中常含有较多的蛋白质，需要除蛋白。除蛋白的方法传统上有sevage法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等。三氯乙酸法去除蛋白率高, 但多糖在三氯乙酸中不稳定，糖苷键易断裂，故多糖损失率也较高。鞣酸法蛋白去除率较低，但是此种方法是利用鞣酸与蛋白质的特异性反应, 不会造成多糖的损失。

6、Sevag 法蛋白去除率最高,但是由于此法使用的试剂是氯仿和正丁醇,而氯仿是有毒物质,容易造成多糖活性下降和溶剂残留。另外, 有机溶剂与去蛋白酶结合的除蛋白法也常被用在实验研究中，其效率更高，更加节省试剂和资金。为了避免使用有机溶剂可采用反复冻融的方法除蛋白。 色素的去除，植物多糖提取物中含有酚类化合物,在多糖提取过程中由于氧化作用会有色素生成，色素的存在会影响多糖的色谱分析和性质测定。常用的脱色方法有：吸附法(DEAE纤维素、硅藻土、活性炭等)、氧化法(过氧化氢)、离子交换法。除小分子杂质，小分子杂质如低聚寡糖的残留往往影响多糖的生物活性， 需要进一步脱除，提高纯度。传统的方法是透析法，该法

7、操作简单、技术成熟，但周期长，往往需要2 d-3 d，常温下操作有可能造成多糖的霉变，必要时需加入少量防腐剂或需在低温条件下进行。随着膜分离技术的发展，纤维滤器透析法已经发展起来了，它利用不同孔径的膜使大小不同的分子分级，这种方式可缩短生产周期，而且条件温和，无疑是多糖脱除杂质的一条新途径。 2.3多糖的纯化方法 多糖的纯化方法很多，须根据条件适当选择。必要时可使用多种方法以达到理想的分离结果 1.分级沉淀法 用乙醇进行分级分离是分离多糖混合物的经典方法，并 且适用于大规模分离。该法往往需要多次重复进行才能达到较好的效果。如从肝素生产废弃物中分离纯化硫酸皮肤素4。分级沉淀有机试剂的筛选有机试剂

8、沉淀法作为纯化生物大分子物质的一种经典方法，选择有机溶剂时应能和水混溶，使用较多的有机溶剂如乙醇、丙醇、丙酮等，为避免生物活性大分子变性失活，沉淀应在低温下进行。分别选取乙醇、丙醇和丙酮作为沉淀剂，取预处理后的样品按固液比110 溶解于去离子水中，加入0.1V 体积的沉淀剂，摇匀20min，4 密封静置24h。离心12000r /min，20min，4 ，取出沉淀并用20mL 去离子水冲洗、冻干。再向上清液中加入0.1V 原溶液体积的沉淀剂，重复上述操作，直至加入沉淀剂时连续5 次无沉淀产生。取各次沉淀溶解后进行醋酸纤维素薄膜电泳检测。 2.季铵盐络合法 粘多糖的聚阴离子与某些表面活性物质，如

9、十六烷 基三甲基溴化铵中的季铵基阳离子结合生成季铵络合物。这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解。当离子强度增大时，这些络合物可以解离并溶解。本法的优点是既适用于实验室又适用于生产。季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离。当溶液的pH值增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高，也会与中性多糖形成沉淀。常用的季铵溴化物(cetyltrimethyl ammonium bmmide，cTAB)及其氢氧化物(cetyl t methyl amm0nium hydr(Jxiode，CTA一0H)和(certylpyridium hydroxide，CP一0H)，其浓度

10、一般为1 10 (WV)，它们可在酸性、中性、微碱性和碱性中分级沉淀分离出酸性多糖。 3. 柱层析法 3.1凝胶柱层析法：常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，使各种多糖得以分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。 3.2离子交换层析 常用的交换剂为DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖凝胶(DEAESephadex)、DEAE-琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose)，此法适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。最常用的是DEAE-纤维素在pH为6时酸性多糖吸附于交换剂上，中性多糖不吸附，然后用逐步提高盐浓度的洗脱液进行洗脱

11、进而达到分离。它一方面可纯化多糖，另一方面还可分离各种多糖。如川芎多糖的分离纯化5：纤维素柱水平衡后，取200mg粗多糖样品溶解于蒸馏水中上样，蒸馏水洗脱70ml后，以03mol/l NaCl溶液梯度洗脱，流速1.0ml/min，每管收集2ml，硫酸苯酚法显色检测。 凝胶柱层析和离子交换层析往往在分离纯化过程中交替使用，以达到更好的分离纯化效果。如灰树花多糖GFP75-2-2B6的分离：4.超滤法 采用中空纤维超滤膜，对多糖去蛋白质后的提取液通过超滤 去除小分子杂质5.色谱法 色谱法是常用的纯化多糖的方法，包括离子交换色谱和凝胶 色谱，色谱法是利用填料对不同种类的糖吸附作用的差异，使混合物中各

12、糖分达到彼此分离的方法。逆流色谱（Countercurrent chromatography，CCC）技术是一种无固体载体的连续液液分配色谱技术，其固定相通过重力场和离心力场作用被保留在分离柱内，流动相与固定相在色谱仪内进行分配，而达到物质的分离。逆流色谱与传统色谱相比具有无死吸附、进样量大、分离纯度高等显著的优势，在食品、生物化工、制药等领域具有广阔的应用前景。在海带多糖7的分离纯化中使用了该技术。用泵把固定相从进口注入HSCCC分离柱中，待固定相充满后，开动主机，调节转速达到预定转速并稳定后，用20ml固定相溶解0.15g精制多糖，用恒流泵将样品溶液以一定流速注入HSCCC，部分收集器收集

13、。分离完成后，停止转动。用气泵使HSCCC中的液体流出。使用了逆流色谱分离多糖的双水相系统，在PEG1000浓度为12%，KH2PO4浓度为8%，K2HPO4 浓度为8%，转速在400r/min时，可以使海带多糖达到很好的分离。下图为逆流色谱仪示意图。6.制备性区带电泳 根据各种多糖的分子大小，形状及其所带电荷的不 同可用电泳法进行分离。 7.固定化凝集素的亲和层析法 近年来根据凝集素能专一地、可逆地与游离的和复合糖中的单糖和寡糖结合的性质，利用固定化凝集素亲和层析作为分离纯化糖蛋白的方法。这一方法简单易行，在温和条件下进行不破坏糖蛋白活性。固定化的刀豆凝集素（concanavalin A，C

14、on A）是应用最普遍的固定化凝集素。Con A能专一地与甘露糖基结合，各种的酶如-和-半乳糖苷酶、过氧化氢酶、干扰素等都可用固定化Con A纯化。 8.膜分离法 膜分离具有无相变及化学变化、可常温操作、选择性高与能 耗低等优点。如马尾藻多糖就采用了膜分离纯化技术。海藻多糖是一类组成相当复杂的生物大分子，使用膜分离技术对海藻多糖8进行分级可达到初步纯化的目的。在压力05MPa， 温度20条件下， 将脱蛋白之后的提取液稀释至1 L， 先用孔径01 m 的微滤膜过滤，分成浓缩液和透过液，将透过液依次用截留分子量为100、50、10、3kD 的超滤膜进行超滤，分别收集浓缩液和透过液。 近20 年来,

15、 由于分子生物学的发展, 人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能, 快速高效、节省能源、简便易行的提取与纯化工艺对多糖的研究有重要意义。多糖在自然界植物中广泛存在，但由于其种类的多样性、结构组成的复杂性以及多糖分子量大、极性大等特点，给植物多糖提取、分离带来很大困难，要想获得较高的多糖提取率，用单一的提取方法不一定能取得理想的效果，将2种或者多种提取方法结合可能得较好的提取效果9。 在多糖的分离、纯化中常用分级沉淀法、纤维素柱色谱法和凝胶色谱法相结合的方法进行分离、纯化，使多糖的分离、纯化能达到理想的效果。目前较为常用的提取与纯化技术比较成熟, 但存在溶剂、能源消耗大且效率不高的

16、问题, 合理使用一些新技术可以有效改善提取与纯化效果, 使多糖制备向高效节能的方向发展; 不断探索和完善的提取与纯化技术, 将会使多糖制备向绿色、现代化的方向发展。多糖的提取分离纯化方法在不断更新，在选取方法时，应当关注目标多糖的性质、特点，综合比较进行实验，才能选取最佳的方法和工艺。参考文献 1Yuanfeng Wang,Lan Yu1,Jiachen Zhang,et al.Study on the purification andcharacterization of a polysaccharide conjugate from tea flowers.JInternational J

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18、rification, characterization and antitumor activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum.JCarbohydrate Polymers.80(2010)783789. 4GuoRui1,CAO Yanping2,SHI Yu1,CAO Yang,et al.Purifying dermatan sulfate from the waste in heparin production.JScience and Technology of Food Industry.10020306(2011)030

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22、g,CAI Yong-hong,et al.Exploration of Extraction and Isolation Method of Plant Polysaccharides.JChina Pharmacy.1001-0408(2011)11-1052-04. 10吴梧桐生物化学第六版多糖纯化：a、分部沉淀法：根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为了多糖的稳定，常在pH7

23、进行，唯酸性多糖在pH7时COOH是以COO 离子形式存在的，需在pH24进行分离，为了防止苷键水解，操作宜迅速。此外也可将多糖制成各种衍生物如甲醚化物、乙酰化物等，然后将多糖衍生物溶于醇中，最后加入乙醚等极性更小的溶剂进行分级沉淀分离。b、盐析法：在天然产物的水提液中，加入无机盐，使其达到一定浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出，与其它水溶性较大的杂质分离。常做盐析的无机盐的有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。c、季铵盐沉淀法：季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离。通常季胺盐及其氢氧化物并不与中性多糖产生沉淀，但当溶液的PH增高或加入硼砂

24、缓冲液使糖的酸度增高时，也会与中性多糖形成沉淀。常用的季铵盐有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氢氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTAOH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CPOH）。CTAB或CPOH的浓度一般为110（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可从中性多糖中沉淀出来，所以控制季铵盐的浓度也能分离各种不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9，而且不能有硼砂存在，否则中性多糖将会被沉淀出来d、柱层析：纤维素柱层析：纤维素柱层析对多糖的分离既有吸附色谱的性质，又具有分配色谱的性质，所用的洗

25、脱剂是水和不同浓度乙醇的水溶液，流出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最后出柱，与分级沉淀法正好相反。纤维素阴离子交换柱层析：最常见的交换剂为DEAE纤维素（硼酸型或碱型），洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。此方法目前最为常用。它一方面可纯化多糖，另一方面还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。凝胶柱层析：凝胶柱层析可将多糖按分子大小和形状不同分离开来，常用的凝胶有葡聚糖凝胶（sephadex G）、琼脂糖凝胶（sepharose biogel A）、聚丙烯酰胺凝胶（biogel P）等，常用的洗脱剂是各种浓度的盐溶液及缓冲液，但它们的离子强度最好不低于0.02。出

26、柱的顺序是大分子的先出柱，小分子的后出柱。由于糖分子与凝胶间的相互作用，洗脱液的体积与蛋白质的分离有很大的差别。在多糖分离时，通常是用孔隙小的凝胶如sephadex G25、G50等先脱去多糖中的无机盐及小分子化合物，然后再用孔隙大的凝胶sephadex G200等进行分离。凝胶柱层析法不适合于粘多糖的分离。柱层析原理: 柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离。一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附解吸再吸附再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。硅胶柱层

27、析流动相： 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸一般都是利用极性相似相容原理，看流动相与固定相的极性，大部分是固定相的极性小于流动相，然后流动相的极性与所要洗脱的物质极性比较接近，从而将物质洗脱下来。一级结构：单糖组成、糖苷键类型：搞碘酸盐氧化、Smith降解、甲基化二级结构：侧链类型、位置三级结构：空间结构：刚果红显色扫描，X-晶体衍射分析而且每一步都要以红外光谱、C-13核磁共振谱作跟踪一级结构要搞清楚主侧链单糖组成、糖基数量、糖苷键类型，从而确定重复单位结构。主要通过酸水解后GC分析确定单糖组成、H

28、PLC（TSK柱）或凝胶色谱法测分子量以确定糖基数量，部分酸水解、高碘酸盐氧化、Smith降解、甲基化分析、核磁共振，共同确定主侧链糖苷键类型、位置。发点自己在多糖结构解析的一点心得，和大家共同讨论食（药）菌多糖的结构分析方法一般来说可以分为两大类：一类是传统的化学方法，一类是波谱学方法。2.1 化学方法化学方法是用来对一些简单的单糖、二糖和寡糖进行分析的经典方法，同时亦可应用在多糖的结构解析上。它是通过完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析和气质联用对多糖进行解析的。 水解法水解法通过完全水解将多糖链分解成单糖，这是分析多糖链组成成分的主要手段。水解法包括完全酸水解、

29、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。水解后的多糖经过中和、过滤可采用气相色谱、纸层析、薄层层析、高效液相色谱仪8和离子色谱法9进行分析。2.1.2 高碘酸氧化法高碘酸可以选择性的氧化断裂糖分子中的连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲酸，反应定量进行，每裂开一个CC键消耗一分子高碘酸，通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量，可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度和支链多糖的分枝数10。2.1.3 Smith 降解Smith 降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分水解。由于糖残基之间以不同的位置缩合，用高碘酸氧化后则生成不同的产物。根据降解产物可以推断糖苷键的位置。在降解产物中若有赤藓糖生成，则

30、提示多糖具有14结合的糖苷键；若有甘油生成，则提示有16、12结合的糖苷键或有还原末端葡萄糖残基；若能检出单糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等,则有13糖苷键结合的存在11。2.1.4 甲基化反应甲基化反应是用甲基化试剂将各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，进而将甲基化多糖水解后得到的化合物，其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接的位置。甲基化反应的关键在于甲基化是否完全，通常采用红外光谱法检测3500-1处有无吸收峰,以此来判断甲基化多糖中是否含有游离的羟基(-OH)。甲基化的方法有Purdie法、Hamorth法、Menzies法和Hakomori法等12。现在使用较多的是Ciucanu和Ke

31、rek13方法,它是将多糖样品溶解在DMSO中,加入NaOH粉末和碘甲烷，混合在密封瓶中25搅拌6min即可,方法简单,重复性好。2.2 波谱学方法食（药）用菌多糖由于结构比较复杂，仅用传统的化学方法完全解析多糖结构是十分困难的，必须利用波谱学知识进行解析。在食（药）用菌多糖中常用的波谱学方法有紫外分光光度计法、红外光谱法和核磁共振法。2.2.1 紫外分光光度计法用苯酚硫酸法（490nm）进行多糖的含量测定;280nm处有无吸收峰来检测是否含有蛋白质和在260nm处有无吸收峰来判断是否含有核酸;在620nm处有无吸收峰来判断有无色素14;在206nm处有无吸收峰来判断是否含有多糖15 。2.2

32、.2 红外光谱法红外光谱分析多糖结构，可以鉴定多糖的构型，如：构型多糖常出现844±8cm-1峰 ,而构型多糖出现891±7cm-1峰 。糖键上主要取代基的特征谱为分子间、内氢键使糖羟基在36003200 cm-1 处出现一宽峰，磷酸基在13001250cm-1 处有P=O伸缩振动峰，磺酸基在1240cm-1 处有S=O伸缩振动峰，酯胺在1650 、1550 cm-1 附近出现振动吸收。吡喃糖苷在11001010cm-1 处应有3个吸收峰，而呋喃糖苷在相应的区域只出现2个峰16。2.2.3 核磁共振法运用核磁共振技术可以在有或没有结构背景知识的情况下获得碳水化合物最完全的结

33、构信息，它突破了用化学方法测定多糖结构的局限性，为复杂的多糖结构解析提供了有利工具。通过综合考虑一维、二维图谱，互相验证，得到更为准确的多糖结构信息。核磁共振波谱的多糖结构分析方法介绍如下。2.2.3.1 糖残基数的确定4.35.9的异头氢区域，造成假象。所以对于在1H NMR谱和13C NMR谱中信号峰数目不一样时，还要通过1H-1H COSY谱和1H-13C COSY谱进行验证，进而确定多糖中的糖残基数17。d 90112之间。根据出现的信号峰来确定多糖的糖残基数。但是在1H NMR谱中，异头氢区域的信号不一定都是异头氢的信号，比如在O-乙酰基取代碳上的氢，虽然不是异头氢，但是其氢的化学位

34、移会因为O-乙酰基取代而向低场移动到d4.35.9之间；在13C NMR谱中，异头碳的化学位移一般在d多糖是由单糖以一定的连接方式组成的重复结构单元，由一种或多种单糖组成，所以确定多糖的糖残基数是很重要的。一般来说，糖残基数是根据多糖的异头氢和异头碳来确定的。在1H NMR谱中，异头氢的化学位移在2.2.3.2 单糖构型的确定8284之间有信号，也是区别呋喃糖构型和吡喃糖构型的主要依据19 ，20。吡喃糖构型大致又包括葡萄糖构型（葡萄糖和异鼠李糖）、甘露糖构型（甘露糖和鼠李糖）和半乳糖构型（半乳糖、岩藻糖）。葡萄糖构型可以通过J2,3,J3,4,J4,5在810Hz之间来判断21，还可以通过H

35、2的高场化学位移的特征来判断。或者是在TOCSY谱中，具有一个H1H6完全的自旋系统，也可以视为葡萄糖构型22。甘露糖构型可以通过J1，2(02.0 Hz)非常小和J4,5(810 Hz)大的偶合常数来确定甘露糖构型23。由于J3,4和J4,5较小（J3,4和J4,5d103112,并且呋喃糖糖醛糖的C4和呋喃糖糖酮糖的C5在d5.4左右，J1,2小于2Hz,此是呋喃糖构型区别于吡喃糖构型的主要特征18。在 13C NMR谱中，异头碳的化学位移在d组成多糖的单糖一般可以分为呋喃糖构型和吡喃糖构型。在1H NMR谱中，呋喃糖构型的异头氢的化学位移在<3 Hz）,阻碍了从H1H6的相关传递，

36、由此可以推断半乳糖构型的存在24，同时H4相对于其他单糖残基而位于低场区域26也可作为判断半乳糖构型的依据。在TOCSY谱中只能推出H1H426和在NOESY谱中的H4与H3和H5有强的NOE效应也是半乳糖构型的主要特征27。2.2.3.3 单糖组分化学位移的确定一般来说，可以通过1H NMR谱、1H-1H COSY谱和TOCSY（HOHAHA）谱推出单糖上各碳上氢的化学位移，然后根据13C NMR谱和1H-13C COSY谱（HMQC谱和HSQC谱）推出碳的化学位移。但是对于不同构型的还略微不同，比如半乳糖构型，因J3,4和J4,5较小，阻碍了交叉峰的出现，可以从1H-1H COSY谱中的交

37、叉峰推出H1，H2和H3。由于H3和H4在1H-1H COSY谱中的J3,4较小，所以没有交叉峰的出现，因此 H4可以通过TOCSY（或HOHAHA）谱得出，根据H1的相关交叉峰进行判断；H5可由NOESY谱得出，由于H3和H4与H5信号相关。H6可以通过1H-1H COSY谱和TOCSY（或HOHAHA）谱得出，由于H5和H6在此谱上有交叉峰。H5和H6与H1和H4是否在同一糖环中，还可以通过HMBC谱，H1和C5相关、H5和C4相关、H6和C5相关来证明H5、H6是同一糖残基上的氢。碳的化学位移可由HMQC谱来推断，对于未被推出的，可用HMQC-TOCSY谱进行辅助，例如：H1与C1、C2、C3和C4相关，C5与H5、H6a和H6b相关，还可以通过HMBC谱进行验证，如：H1与C3、C5，H2与C1，H4与C5和C6相关等28，29。而甘露糖构型由于J1,2较小，所以常采用DQF-COSY谱和TOCSY谱结合来确定H的化学位移30。2.2.3.4 异头构型的判断4.44.8之间，J H1,H2在68Hz之间，双峰17。但是甘露糖构型不能用此方法来判断。由于J1，2非常小，不能用J1,2间的偶合常数来确定甘露糖的或构型,需通过该单糖残基上的H524和C533的化学位移与已知单糖的H5和C5的化学位移来判断：一般来说，-甘露糖