基因芯片技术应用

1、基因芯片技术应用基因芯片技术应用1.人类基因组（测序）计划（Human genome project）的逐步实施，现（1997年底）已完成2%序列及800，000个cDNA片段(EST)的测序工作，预计2005年可全部完成；2.其它生物基因组的测定工作：11种微生物、大肠杆菌、酵母13Mb全序列，线虫71%、果蝇6%、小鼠0.2%序列得到测定。 然而，怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能，成了全世界生命科学工作者共同的课题！基因芯片技术应用速度快、效率高可同时对大量核酸序列进行检测和分析操作简便、自动化程度更高总体效率较常规杂交方法高基因芯片技术应用基因芯片(Gene

2、chip) 又称DNA芯片（DNA Chip）或生物芯片(Biological chip，不过该词尚包括肽芯片等其它类型),它是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析。基因芯片技术应用 早在八十年代初有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因组大量的遗传信息进行分析和检查，但直到光引导原位合成(light-directed in situ synthesis)高密度探针技术和激光共聚焦显微扫描问世之后才使该设想逐步成为现实，并迅速应用到分子生物学的多个领域，得到了科学界的高度重视。基因芯片技术应用 操

3、操作作自自动动化化程程度度一一次次可可检检测测的的序序列列个个数数总总体体效效率率基基因因芯芯片片技技术术简简便便很很高高极极大大很很高高传传统统杂杂交交方方法法复复杂杂很很低低很很小小很很低低 基因芯片技术从本质上说与Southern Blotting或Northern Blotting相同（所以Affymetrix曾与Southern就专利问题产生冲突），只是探针密度极高而已。不过，为此花费了大量的人力物力从事研制工作。当然，其结果也很是诱人。基因芯片技术应用1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的外观探针

4、支持物剖面图平面局部放大基因芯片技术应用硬件：序列合成设备包括：核酸或多肽合成仪（作预合成点样用）、照相平板印刷及半导体制作相应设备（作光引导原位合成）。激光共聚焦显微扫描设备：激光共聚焦显微镜或相应设备，以采集高密度点阵杂交信号并进行数字化处理分析。基因芯片技术应用软件基因序列分析及探针筛选技术（可能涉及专利等产权问题）序列合成及定位技术（光引导原位合成或微量点样技术）杂交信号的采集和分析技术（需要处理极大量的杂交信号并能由此得到所需信息）基因芯片技术应用现在全世界已有十多家公司专门从事基因芯片的研究和开发工作，而且已有较为成型的产品和设备问世。这些公司主要以美国的Affymetrix公司为

5、代表，该公司聚集有多位计算机、数学和分子生物学专家，其每年的研究经费在一千万美元以上，且已历时六七年之久，拥有多项专利。产品即将或已有部分投放市场，产生的社会效益和经济效益令人瞩目。详情如下表所示：基因芯片技术应用世界十大基因芯片研制单位简要情况一览公司公司阵列方法阵列方法杂交方式杂交方式检测检测应用领域应用领域Affymetrix（美国）（美国）20-25mer 探针光引导探针光引导合成在合成在 1.25/5.25cm2的硅片的硅片10000-260000 个个 Oligo探针与探针与 30-40 个标记样个标记样品品 cDNA/asRNA 片断片断荧光荧光表达谱检测多表达谱检测多态性分析诊

6、断态性分析诊断Brax（英国）（英国）Oligo 合成后结合于合成后结合于芯片上芯片上通用芯片上通用芯片上 100 个探针个探针与标记核酸与标记核酸质谱质谱诊断、表达谱诊断、表达谱检测及新基因检测及新基因鉴定鉴定Hyseq（美国）（美国） 500-2000ntDNA 样品样品印刷于印刷于 0.6cm2/18cm2的膜的膜预组装的预组装的 5mer-Oligo打印于打印于 1.15 的玻璃片的玻璃片64/55000 个样品个样品 cDNA点与点与 8000/300 个个 7mer探针探针通用通用 1024 个个 Oligo 点点探测探测 10kbcDNA 样品，样品，加标记的加标记的 5mer

7、探针和探针和连接酶连接酶同位素同位素诊断、表达谱诊断、表达谱检测、多态性检测、多态性分析、新基因分析、新基因鉴定及大规模鉴定及大规模测序测序IncytePharmaceticals（美国）（美国）压电打印压电打印 PCR 产物产物或芯片上合成或芯片上合成 Oligos1000 最终可达最终可达 10000个个 Oligo/PCR 片断与标片断与标记记 RNA荧 光荧 光 / 同同位素位素表达检谱测多表达检谱测多态性分析诊断态性分析诊断基因芯片技术应用续表IncytePharmaceticals（美国）（美国）压电打印压电打印 PCR 产物产物或芯片上合成或芯片上合成 Oligos1000 最终

8、可达最终可达 10000个个 Oligo/PCR 片断与标片断与标记记 RNA荧 光荧 光 / 同同位素位素表达检谱测多表达检谱测多态性分析诊断态性分析诊断Moleculardynamics（美国）美国）500-5000nt 的的 cDNA用笔打印于用笔打印于 10 cm2玻璃片玻璃片10000 个个 cDNA 点与点与200-400nt 标记标记 cDNA荧光荧光新基因鉴定新基因鉴定表达谱检测表达谱检测Nanogen（美国）（美国）预组装的预组装的 20mer 的探的探针俘获于电活化芯片针俘获于电活化芯片位点位点25/64/100/400/最终最终10000 个个 Oligo 点 与点 与2

9、00-400nt 标记标记 cDNA荧光荧光诊断及短的重诊断及短的重复序列鉴定复序列鉴定Protogene Lab（美国）（美国）通过打印于表面张力通过打印于表面张力阵 列 将阵 列 将40-50merOligo 合成于合成于 9 cm2玻璃片玻璃片8000 个个 Oligo 点与点与 200-400nt 标记核酸样品标记核酸样品荧光荧光表达谱检测表达谱检测多态性分析多态性分析Sequenom(德国，美国德国，美国)20-25mer 探针合成后探针合成后打印成阵列打印成阵列250 点，激光解吸点，激光解吸-质谱质谱分析分析质谱质谱新基因鉴定新基因鉴定诊断及作图诊断及作图Synteni（美国）（

10、美国）500-5000nt cDNA 用用滴头打印于滴头打印于 4 cm2 的的玻璃片玻璃片10000个个cDNA点与点与200标记标记 cDNA荧光荧光新基因鉴定新基因鉴定表达谱检测表达谱检测德国癌症研究德国癌症研究所所（德国）（德国）约约 1000 个个 PNA 合成合成于于 810 cm2 的芯片的芯片荧 光荧 光 / 质质谱谱表达谱检测及表达谱检测及诊断诊断基因芯片技术应用 基因芯片以其片基(substrate)的不同可以分为无机片基和有机合成物片基。前者主要包括半导体硅片和玻璃片，其上的探针主要以原位聚合的方法合成，后者主要有特定孔径的硝酸纤维膜和尼龙膜，其上的探针主要是预先合成后通

11、过特殊的微量点样装置或仪器滴加到片基上去（如下表所示）。基因芯片技术应用片基片基探针固定方式探针固定方式探针密度探针密度显色及检测方式显色及检测方式钢性片基如玻片、钢性片基如玻片、半导体硅片等半导体硅片等原位合成原位合成（in situsynthesis）高高荧光，激光共聚焦扫描、荧光，激光共聚焦扫描、定量分析；生物传感器等定量分析；生物传感器等薄膜片基如薄膜片基如 NC、Nylon 膜等膜等预先合成后点样预先合成后点样(off-chipsynthesis)低低荧光荧光基因芯片的主要类型及其简要特点 不过，也有人(Robert S. Matson)等以聚丙烯膜为支持物用传统的亚磷酰胺固相法原位

12、合成高密度探针序列。基因芯片技术应用PCRT7 promoterT7 promoter体内转录片段化1.5 小时杂交、冲洗ACGT扫描分析1 小时荧光素图 2 样品处理与检测过程简图基因芯片技术应用基本过程用生物素标记并经扩增（也可使用其它放大技术）的靶序列或样品然后再与芯片上的大量探针进行杂交用链霉亲和素(streptavidin)偶联的荧光素（常用的荧光素还有lassamine 和phycoerythrin）进行显色图象的采集用落射荧光显微镜(epifluorescence microscope)、激光共聚焦显微镜或其它荧光显微装置对片基扫描由计算机收集荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化

13、后进行分析。基因芯片技术应用由于完全正常的 Watson-Crick配对双链要比具有错配(mismatch)碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性，所以，前者的荧光强度要比后者强出5-35%。从这一点来说，该检测方法是具有一定特异性的，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。以下图为例。基因芯片技术应用基因芯片技术应用光引导原位合成 (Light directed in situ synthesis） 光 引 导 聚 合 技 术 是 照 相 平 板 印 刷 技 术(photolithography)与固相合成技术、计算机技术以及分子生物学等多学科相互渗透结果。照相平板印刷技术中可

14、用光引导形成电子线路（electrical circuits），利用类似的道理可在固相支持物上同时合成出大量不同的化合物。基因芯片技术应用操作过程（见下图）* 使支持物氨基化* 用光不稳定保护基（photo labile protecting group）将NH2基保护起来* 选择适当的挡光板（mask）使需要聚合的部位透光，不需发生聚反应的部分不透光。这样，光通过挡光板照射到支持物上，受光的部分NH2解保护* 合成所用单体分子一端按传统固相合成方法活化另一端则受光敏保护基团保护。这时，用单体分子去和支持物上解保护的氨基反应，偶联后的部位将仍旧带上保护基团。* 类似地，进行以后其它反应直至得到

15、目的寡聚体序列。基因芯片技术应用光引导原位合成技术原理图NHHNHNHNHNHXXXXX光去保护XXXXNH2X-AXXXXNHAXXXXXNHAXh挡光板 2化学偶联化学偶联X-BX-C, etc.BBACC. . . . . . . . .平板印刷用挡光板 1h固相支物物化学偶联基因芯片技术应用预合成点样技术（Off-chip synthesis) 这一方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的DNA或蛋白固相合成仪进行。多聚物合成后再用特殊的点样装置或仪器（如美国Cartesian Technologies公司的PixSys NQ/PA系列产品）将其以较高密度分布于硝酸纤维膜或经

16、过特殊处理的玻璃片上，点阵密度可达到2500spots/cm2（Yershov et al报道点阵密度最高可达20,000-30,000spots/cm2）。基因芯片技术应用点点 阵阵密密度度合合成成大大量量探探针针需需要要的的反反应应步步数数检检 测测效效率率技技 术术难难度度设设备备情情况况知知识识产产权权问问题题光光引引导导原原位位合合成成技技术术很很高高合合成成 4n 个个序序列列只只需需 4* *n步步反反应应很很高高很很高高需需要要大大型型复复杂杂设设备备有有可可能能侵侵权权*预预合合成成点点样样技技术术比比 较较低低合合成成 4n 个个序序列列需需4n个个反反应应较较高高较较低低

17、设设备备代代价价相相对对低低廉廉无无侵侵权权可可能能注：美国专利第5,744,305号说明固相表面点阵密度超过400spots/cm2 将侵犯Affymetrix 公司产权基因芯片技术应用支 持 物相 关 技 术照 射 光去 保 护 方 法 及 效 率每 步 聚 合 效 率硅 片 或 玻 片照 相 平 板可 见 光酸 去 保 护 （ 98 % ）98 %（ 需 预 处 理 ）印 刷 技 术电 子 射 线 等光 去 保 护 （ 92-94% ）92-94%影响光聚合的主要因素现列表如下：其中，保护基团类型与去保护方式严重制约着聚合点阵的密度和探针的长度。如下表所示。基因芯片技术应用不同去保护方式

18、对聚合效果的影响去去保保护护方方式式保保护护基基类类型型每每步步产产率率探探针针密密度度可可见见光光106/cm2电电子子射射线线(250 )光光 敏敏92-94%1010/cm2* 酸酸酸酸 敏敏98%可见，经典光引导聚合技术所存在的问题在于：探针密度低、分辨力差每步反应合成产率低基因芯片技术应用为此，Glenn McGall等将光引导合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相合，以酸作为保护剂，使探针密度达到16,000spots/cm2以上（有望接近106spots/cm2）。光具有波粒二象性，所以具有衍射的特性。当挡光板透光孔间的距离足够小的时候，由于光的衍射，使受光部分与非受光部分光照对比度下降，如果仍用前述光引导合成技术就会使去保护作用不够理想，受照射部分与其它部分差别不够大，聚合纯度不高，降低了检测结果的信噪比(signal-noise ratio)，从而影响了聚合点阵的密度的提高。基因芯片技术应用光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，所以当照度达到一定值时它就会解离，这样就部分地