共聚焦操作流程

1、一、 实验环境观察仪器是否有外说明显损坏，如需开启空调，一般控制在25度。拉上窗帘，防止标本荧光淬灭及杂光干扰。二、 开机查看实验记录，确认是否马上能开机注意：汞灯必须在关机20分钟以后才能再开启，一般为30分钟。确认后可执行以下操作：务必先开电源，后开钥匙！。1、 翻开PSU主电源2、 翻开激光器只开启需使用的激光器1） 、氩离子多线激光器458/488/515，应用染料：GFP/FITC/Fluo3/Alexa488/CFP/YFP等。2） MCPSU半导体综合激光器LD405应用染料：DAPI/Hoechst/BFP等；LD635应用染料：CY5/ Alexa647等。3） LD559激

2、光器注意：电源翻开后不要马上开钥匙，等待TEMP指示灯不闪烁后，再开钥匙，红色指示灯不闪烁后，可正常使用。3、 翻开显微镜电源IX2-UCB4、 翻开荧光汞灯注意：开启后，“15分钟内勿关5、 翻开电脑主机、显示器，登陆windows xp系统，双击共聚焦软件，翻开FV10-ASW应用软件。三、 取图1、 DIC微分干预差明场立体图1、插入起偏镜、检偏镜DIC滑块。2、FV10-ASW软件中点击透射光观察按钮，翻开卤素灯快门，使用TD滑块软件TD lamp项控制卤素灯的光强，倒置显微镜下观察标本，进行标本聚焦。 1、使用手控面板选择适宜倍率的物镜下观察注意假设用60×油镜时，检偏镜部

3、位要推上弯杆，并检查各物镜对应的DIC元件。2、可在检偏镜部位用旋钮进行比照度的调节。需要时可使用，一般勿调 3、FV10-ASW软件中点击透射光观察按钮，关闭卤素灯快门。翻开DIC通道，执行取图操作。 1、调节扫描速度至最快2.0us/pixel，size为512by，点击 ，进行快速预扫，寻找焦平面。步骤：适当调节HV、gain及offset参数一般为能看到图像即可，快速调节寻找焦平面，如需放大光学倍数，可适当调节。点击，停止预扫描。 2、选择AutoHV，放慢扫描速度扫描速度越慢，扫描时间越长，图像信噪比好，但耗时，易淬灭，一般为10-12.5 us/pixel，size为640by，点

4、击进行再预扫，调节HV、gain及offset参数至图象清晰锋利即可。点击，停止预扫描。 3、假设背景噪音仍过多也可选上来降低随机噪音干扰次数越多降噪越好，但扫描时间也越长，一般在HV较高时使用。4、点击进行取图，并保存。注意：原始图像一定要保存为oib格式5、去掉，将扫描速度、size恢复至初始状态扫描速度至最快，即最左端，2.0us/pixel，size为512by，为下一个标本做好准备。2、荧光图1、拉出检偏镜(DIC滑块)，翻开汞灯机械快门shutter。2、FV10-ASW软件中点击汞灯观察按钮，翻开汞灯快门，倒置显微镜下观察标本，进行标本聚焦找视野。使用手控面板，根据标本荧光探针选

5、择适宜的荧光虑色片及选择适宜的物镜下观察，WU紫外激发/蓝色荧光eg：DAPI，WB蓝色激发/绿色荧光eg：FITC、EGFP，WG绿色激发/红色荧光(eg:Texas Red，Rhodamine，DsRed)。一般要求标本在所用的各种荧光探针匹配的荧光虑色片下均能观察到所需视野，eg：DAPIFITC+ Texas Red多色荧光探针，需在WU,WB,WG下均能观察到所需视野，DAPI一般荧光较强，FITC或Texas Red下易找些。注意：更换不同倍数物镜时应适当降低物镜再更换，以免损坏物镜；假设用60×油镜时，要插入检偏镜并推上弯杆。3、FV10-ASW软件中点击汞光观察按钮，

6、关闭汞灯快门。执行取图操作。1、点击，添加荧光染料。最多为三色，多于三色需分别扫描假设标本使用的荧光染料不是染料库里的染料，可选激发光及发射光谱较接近的染料代替，这时可适当调整2、调节扫描速度至最快2.0us/pixel，size为512by，点击 ，进行快速预扫，寻找焦平面。步骤：适当调节HV、gain及offset参数一般为能看到各通道图像即可，快速调节寻找焦平面，如需放大光学倍数，可适当调节。点击，停止预扫描。 3)、选上双染以上一定要选上，可防止激发光串色，选择AutoHV AutoHV功能为自动匹配扫描速度与HV值，不选易造成图像出现强度过饱和状态，放慢扫描速度一般为10-12.5

7、us/pixel，size为640by，点击进行再预扫，调节HV、gain及offset参数至图象清晰锋利即可。点击，停止预扫描。 4、假设背景噪音仍过多也可选上来降低随机噪音干扰次数越多降噪越好，但扫描时间也越长，一般在HV较高时使用。5、点击进行取图，保存及相关图像处理。注意：原始图像一定要保存为oib格式6、去掉，将扫描速度、size恢复至初始状态扫描速度至最快，即最左端，2.0us/pixel，size为512by，为下一个标本做好取图准备。四、刻录数据图像保存后，退出FV10-ASW软件，刻录数据注意：必须用新的光盘，严禁使用U盘、移到硬盘等。五、关机务必先关钥匙后关电源！1、 关闭荧光汞灯注意：开启后，“15分钟内勿关2、 关闭激光器1、关闭LD559激光器2、关闭MCPSU半导体综合激光器3、氩离子多线激光器注意：先关钥匙，千万别马上关闭电源，要等风扇停止转动后再关闭电源3、使用擦镜纸沾擦显微镜物镜注意：一般物镜清洗液为乙醇，擦镜纸为普通擦镜纸；油镜清洗液为30