哺乳动物蛋白表达系统.docx

1、哺乳动物细胞表达系统背景简介哺乳动物细胞表达系统以哺乳动物细胞作为宿主进行蛋白表达生产，具有转录后修饰、蛋白正确折叠与装配等功能，表达的蛋白更接近天然状态，并且很多蛋白可以经哺乳动物细胞分泌到细胞外，这利于蛋白的分离。如果缺少正确的转录后修饰，可能影响蛋白质的稳定和配体结合,进而增加免疫原性，因此正确的转录后修饰对于治疗蛋白的生产非常重要。但是哺乳动物表达系统也具有细胞系生长缓慢、生长环境要求严格、易污染、费用高昂等缺点。哺乳动物细胞已经成为治疗蛋白生产的主力军，生产的治疗蛋白有上百种。非洲绿猴肾细胞（COS）适合于小规模的单抗制备，如果要大规模地生产，最常用的是中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞

2、。HostcelllineTransfectionRepeatwithincreasingdrugconcentrationsExpressionvectorTTTTTTTlllllll©SingleCellCloningorILimitingDilutionfPreliminarycloneevaluationandExpansionofselectedclones图1、哺乳动物细胞表达系统生产重组蛋白的流程示意图。转染哺乳动物细胞的转染有瞬时转染和稳定转染两种。瞬时转染不会将载体整合到宿主基因组中，可以快速生产少量的蛋白，瞬时转染还可以帮助测试比较不同的载体，这对建立稳定表达细胞

3、系非常有必要。瞬时转染方法有氮化钙法、磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、PEI法和电穿孔法等。瞬时转染适用的细胞系有COS（非洲绿猴肾细胞）、BHK（叙利亚仓鼠肾细胞）、HEK293（人胚肾细胞293）等等。这几个细胞系能进行快速转染，可以悬浮培养，还能在不含血清的培养基中生长，这有助于表达蛋白的纯化并减少污染的可能性。当用PEI法对HEK293细胞系进行瞬时转染，可以得到50-80%成功表达GFP(绿色荧光蛋白)的重组子。要想得到大量的重组蛋白，就要进行稳定的转染，适合的细胞系有中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和小鼠骨髓瘤细胞(如NS0)等，稳定转染能将目的基因整合到宿主基因组中，传代过程中不易丢失。高

4、效的稳定转染方法有磷酸钙法和电穿孔法等。而稳定转染需要长时间的筛选，耗时检达数月，以获得稳定表达的细胞株。StableexpressionMonthsTransientexpression5-7daysHigheffktencytransfectionProteinproduction以'>1图2、稳定转染和瞬时转染。载体我体的选择很关键，因为它决定了转录的效率。适合哺乳动物细胞表达系统的载体有很多种类型，包括基于质粒的载体、腺病毒载体(adenovirusvectors)牛痘病毒载体(vacciniavectors)逆转录病毒载体(retroviralvectors)、杆状病毒

5、载体(baculovirusvectors)和人类病毒等。载体通常包含多克隆位点MCS、可选标记基因SMG、启动子p、聚腺昔酸化pa、转录终止子TT等结构。pIMCSpaTTpSMGpaTTorivAmprgene图3.哺乳动物细胞蛋白表达系统通常的载体结构。可选标记的作用是筛选重组子，常用的可选标记有以下几种。图4.哺乳动物细胞表达系统可选标记实例。MarkergeneAdeninedeaminase(ada)BlasticidinSdeaminases(Bsr,ID)Bleomycin-bindingprotein(Bic)N<'<>mycinphosphotra

6、nnfernsr(tieo)Histidinoldehydrogenase(hisD)IlygromycinBphosphotransferase(Hph)Glutaminesynthetase(GS)Dihydrofolatereductase(dhfr)Cytosinedeaminase(codA)PuromycinN-acetyItransferase(Pm)ActionofmarkergeneproteinDeaminatesXyi-ADeaminatesblasticidinSBindstobleomycinPhosphcryl.itrsG-41KOxidizeshistidinol

7、tohistidinePhc>bphon4atebhygromycinBCellsthatproduceexcessglutaminesynthetasesurvive.Cellsthatproduceexcessdihydro-folatereductasesurvive.LowerscytosinelevelsinthemediumbyconvertingcytosinetouracilAcetylatespuromycin目的基因必须含有翻译控制元件，以起到增强转录和促进蛋白的分泌与纯化的作用，而5'和3'UTR可以增强目的基因翻译效率和促进mRNA的稳定性。5&#

8、39;UTRGeneofinterestKSTPSC3'UTR图5.目的基因的结构，包含一些翻录控制元件。K为Kozaksequence,S为信号序列signalsequence,T为蛋白亲和标签proteinaffinitytag,P为蛋白酶裂解位点proteolyticcleavagesite,SC为终止密码子。双载体系统可以用于蛋白质复合物的表达，即是将两个含有不同目的基因的载体同时导入宿主细胞分别合成亚基再进行蛋白质的装配。展望哺乳动物细胞表达系统在治疗蛋白生产领域具有很大潜力，2006年至2011年间，平均每年有15种治疗蛋白被FDA批准。生物信息学的发展也带动了哺乳动物细胞

9、表达系统的发展，通过获取CHO基因组中的microRNA文库并加以利用，能起到调节基因表达的作用。另外，生物信息学还可能帮助在CHO基因组中找到最适合目的基因的插入位点进行蛋白的大量表达，该项工作己经在人类基因组中得以实现。参考资料1、LaiT,YangY,NgSK.AdvancesinmammaliancelllinedevelopmenttechnologiesforrecombinantproteinproductionJ.Pharmaceuticals,2013,6(5):579-603.2、KhanKH.GeneexpressioninmammaliancellsanditsapplicationsJ.