生物技术制药复习资料 (熊宗贵)

1、其次章 生物药物概论一、生物药物生产原料选择的主要原则、生物药物的特性及种类。主要原则：有效成分含量高，原料新颖；来源丰富，易得；原料产地较近；杂质含量少；原料成本低；易提取。特性：（1）药理学特性：治疗的针对性强；药理学活性高；毒副作用小，养分价值高；生理副作用常有发生。（2）生产、制备中的特殊性：原料中的有效物质含量低；稳定性差；易腐败；注射用药有特殊要求。（3）检验上的特殊性：要有理化检验指标，和生物活性检验指标。分类：按药物化学本质和化学特性分类：（1）氨基酸及基衍生物类（2）多肽和蛋白质类（3）酶和辅酶类（4）核酸及其降解物和衍生物类（5）糖类（6）脂类（7）细胞生长因子类（8）生物

2、制品类（9）小动物制剂（10）动物器官或组织制剂。按原料来源分类：（1）人体组织（2）动物组织（3）植物组织（4）微生物（5）海洋生物来源的药物。按生理功能和用途分类：（1）治疗药物（2）预防药物（3）诊断药物（4）其他。2、 生物药物提取分别制备方法的工艺过程。在对生物药物进行提取操作时，选择提取试剂需留意的问题。 工艺流程：1、生物药物原料的选择、预处理与保存（保存方法：冷冻法，-40；有机溶剂脱水法；防腐剂保鲜，多用于液体）。2、生物药物的提取：（1）生物组织与细胞裂开：磨切法，压力法，反复冻融法，超声波震荡裂开法，自溶法，酶溶法（2）选择合适的溶剂进行提取（考虑提取剂的用量、提取时间、

3、提取次数，留意温度、变性剂等因素）。3、生物药物的分别纯化：（1）蛋白质类药物的分别纯化：沉淀法，亲和层析法，疏水层析法（2）核酸类药物的分别纯化：提取法，发酵法（3）糖类：沉淀法，离子交换层析法（4）脂类：沉淀法，吸附层析法，离子交换层析法（5）氨基酸类：沉淀法，吸附法，离子交换法。试剂的选择：1、对所需要提取的活性成分溶出度较高，对杂质较低。2、不破坏活性成分。3、利于后续预处理。4、对环境影响较小，有利于回收和处理。5、对设备要求不高。6、成本较低。7、最好对人体无害。第三章 基因工程制药一、基因工程制药的主要工艺过程。获得目的基因组建重组质粒构建基因工程菌（或细胞）培育工程菌产物的分别

4、纯化质量把握产品检验包装2、 什么是目的基因？有几种猎取方法？用于构建基因工程菌的目的基因应当达到什么要求？目的基因既是人们所需要的特定基因，一般也是接受目的基因的细胞或个体原本没有的基因。猎取方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段（4）化学合成法；逆转录（RT）-PCR法合成cDNA。基本要求:不含多余干扰成分，纯度高；片段大小适合重组操作；结构、序列正确，达到肯定数量。三、基因工程克隆细胞和表达细胞、克隆载体和表达载体其各自特点。克隆载体：

5、1、具备复制原点，在宿主细胞内必需能够自主复制。2、有一个或多个用于筛选的选择标记。3、具备合适的限制性核酸内切酶的单一识别位点。4、有较高的拷贝数。表达载体：要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将他放入带有基因表达所需要的各种调控元件的载体中，这种载体就成为表达载体。表达载体的结构比克隆载体简单，除了必需具备与克隆载体相同的复制原点，多克隆位点和筛选标记基因以外，还必需有把握目的基因表达的调控序列，包括启动子，转录终止子等。四、目的基因高效表达的方式有哪些？怎样全面提高目的基因的表达水平？有何措施？目的基因高效表达的方式：1.目的基因的不溶性高效表达。表达的蛋白质往往形成不溶性的无生物活性的包

6、涵体，需要经过溶解和复性才能获得有活性的目的蛋白。2.目的基因的高效可溶性表达。可溶性的目的蛋白本身常具有生物活性，无需简单的变性复性的后分别过程，是一种很有期望的提高目的基因表达的新策略。3.目的基因的高效分泌型表达。目的基因的分泌型表达有两种情形：目的蛋白分泌到细胞周质中和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外。对于能分泌到细胞外的表达系统，能进一步简化产物分别工艺。提高目的基因表达水平的措施：1.对基因工程宿主菌进行改造。如在上游阶段通过改造宿主的遗传性能从而削减或消退乙酸的生成；通过改造大肠杆菌使之能在贫氧条件下生长。2.提高工程菌的质粒稳定性。如在上游阶段质粒构建时插入抗生素抗性基因

7、；在质粒构建时应当加入称为par和cer的位点（par位点能够在细胞分裂过程中使质粒分布更均匀，cer位点则能够防止多聚体质粒的形成，从而能从源头上提高质粒稳定性）。在下游阶段接受细胞生长期和诱导表达时期分开的分段培育策略，另外还可接受培育条件循环把握策略和接受固定化细胞培育等。 3.选择能高密度表达的宿主菌和对重组菌进行高密度培育。如选择培育时菌体密度和表达水平能尽可能高的宿主菌。在下游阶段赐予工程菌生长和产物表达的最适环境条件。4.削减乙酸等抑制性副产物的形成。如在下游阶段设计好培育基的组成；选取合适的比生长速率 ；适当降低培育温度；限制性流加葡萄糖；将基因工程菌培育和乙酸的分别同时进行等

8、。5.选择能提高目的蛋白表达质量的宿主菌以及能提高目的蛋白表达质量的方法。如在上游阶段选择尽可能地不产生或少产生能引起蛋白质变性或降解的酶系的宿主细胞。而在下游阶段可接受将菌体生长与蛋白表达时期分开的策略。（也可以分上、下游表述为：上游-对基因工程宿主菌进行改造；提高工程菌的质粒稳定性；选择能高密度表达的宿主菌；选择能提高目的蛋白表达质量的宿主菌。下游-提高工程菌的质粒稳定性；对重组菌进行高密度培育；削减乙酸等抑制性副产物的形成；选择能提高目的蛋白表达质量的方法。）五、工程菌的稳定性及其影响因素和考察方法。基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：

9、1.结构不稳定性：重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰导致其表观生物学功能的丢失。2.安排不稳定性：整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸。影响基因工程菌稳定性的因素：遗传特性：1.载体的选择 2.宿主的选择 3.外源基因整合到宿主染色体上 发酵工艺：1.培育基 2.生长速率 3.限制性机制 4.温度 5.pH和溶氧 6.外源基因表达六、基因工程菌的常见培育方式及其各自特点有哪些？连续式发酵对基因工程产品的大规模生产有什么优势？影响基因工程菌发酵的因素。基因工程菌构建和基因工程菌生产其发酵争辩各自的目的、意义及相应争辩内容。培育方式：分批培育，补料分批培育，连续培育，透析培育，固定化培育。

10、补料分批培育 将种子接人发酵反应器中进行培育，经过一段时间后，间歇或连续地补加新颖培育基，使菌体进一步生长的培育方法。连续培育 将种子接人发酵反应器中，搅拌培育至肯定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以把握肯定稀释率进行不间断的培育。透析培育 透析培育是利用膜的半透性原理使代谢产物和培育基分别，通过去除培育液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。固定化培育 即将固定化技术应用于基因工程菌培育，基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培育，特殊是对分泌型菌更为有利。连续培育可为微生物供应恒定的生活环境，把握其比生长速率，可为争辩基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对

11、基因表达的影响等制造良好条件。 在连续式培育中，还可以将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开进行两阶段连续培育，并通过优化诱导水平、稀释率和细胞比生长速率这3个参数，可以保证在第一阶段培育时质粒稳定，在其次阶段可获得最高表达水平或最大产率。影响基因工程菌发酵的主要因素：1、培育基的影响。2、接种量的影响。3、温度的影响。4、溶解氧的影响。5、诱导时机的影响。6、诱导表达程序的影响。7、pH的影响基因工程菌发酵争辩内容：1、选择宿主菌：争辩不同宿主菌对外源基因表达的影响 2、基因工程菌的生长曲线测定 3发酵条件对外源基因表达的影响 4、重组质粒稳定性争辩。七、以包涵体表达形式的基因工程药物的分别纯

12、化过程和方法，分别纯化出具有活性的蛋白质的一般步骤及其操作要点。进行分别纯化争辩涉及到的争辩项目及内容。 过程方法及操作要点：1、 菌体细胞的收集与裂开（既要使菌体裂开率尽可能高，又要保持包涵体的完整性）。2、 包涵体的分别、洗涤与溶解（通过离心法使包涵体与上清液中的碎片及杂质蛋白分开，包涵体洗涤的基本原则是杂质去除率尽可能高而不溶解包涵体中的目的蛋白。溶解包涵体的试剂选择基本原则是对目的蛋白的溶解性强、选择性好；爱护蛋白质的生物活性；平安性；适合后续各种操作；成本低）。3、 变性蛋白的纯化（对包涵体抽提物接受柱层析、凝胶过滤、离子交换层析和HPLC等方法进一步分别纯化）。4、 蛋白质的复性（

13、恢复可溶性和生物活性，应考虑影响因素：蛋白质浓度、杂质含量、冲折叠速度、氧化还原剂用量和比例、重折叠配体的掺入、温度、pH、离子强度等）。分别纯化争辩：1、 破菌争辩：破菌方法及其条件争辩，镜检评价其裂开效果，原则是使菌体裂开率尽可能高，又要保持包涵体的完整性2、 包涵体的分别和洗涤争辩：（1）分别包涵体时的离心力和时间的考察；（2）洗涤剂及其他浓度、用量争辩；（3）洗涤时间和温度争辩。 包涵体洗涤操作的基本原则：（1）洗涤剂杂质去除率尽可能高，而不溶解包涵体中的目的蛋白；（2）分别包涵体时的离心力和离心时间尽可能满足将包涵体与细胞碎片等杂质很好地分别。3、 目的蛋白的变性（抽提）争辩：（1）

14、变性剂及其浓度、用量的争辩（2）变性操作时间和温度争辩（3）变性操作后的固液分别（离心力和离心时间）争辩。4、 变性蛋白的纯化争辩：对包涵体抽提物可实行柱层析、凝胶过滤、离子交换层析和HPLC等方法进一步分别纯化。 Ps：重组蛋白的纯化可以在包涵体溶解后进行，也可以在复性后进行，因此还应进行两种方法的对比争辩。5、 变性蛋白的复性争辩：考察比较不同复性方法对目的蛋白复性效果的影响。主要考察其对蛋白回收率和复性程度的影响；另外，还需要考察复性时间的影响因素，如蛋白质浓度、杂质的含量、重折叠速度、氧化还原剂的用量和比例、重折叠配体的掺入、温度、pH值和离子强度等对复性效果的影响。6、 目的蛋白的高

15、度纯化争辩：对经复性后得到的目的蛋白进行进一步高度纯化，以满足不同的需要。八、基因工程药物质量把握的必要性及其质控要点，基因工程药物最终产品的质量把握特点及要点。必要性：1、 它是利用获得细胞作为表达系统来制备产品，所获得的蛋白质往往分子量较大，并且具简单的表达结构；2、 很多基因工程药物都是参与人体一些生理功能精密的蛋白质，在极微量的差别的状况下产生显著效应；3、 宿主细胞中表达的外源基因在翻译、转录及工艺放大的过程中会产生变化。质控要点：1、 原料的质量把握。确保编码药品的DNA序列正确性，重组微生物来自单一克隆，所用的质粒纯而稳定。2、生产的质量把握。原始细胞库生产、有限代次的生产、连续

16、培育生产、分别纯化。3、最终产品的质量把握。产品的鉴别、纯度分析、生物活性测定、平安性稳定性考察和产品全都性的保证。质控特点：任何单一的分析方法都无法满足对该类产品的检测要求，它需要综合生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多门学科的理论和技术，才能切实保证基因工程产品的平安有效。第四章 酶工程制药一、酶工程制药的主要内容1、药用酶的生产：发酵生产，分别纯化，分子修饰2、酶法制药：酶催化反应、固定化、非水相催化二、酶法制药争辩中涉及到的争辩项目及内容1、 原料的选择及反应的争辩。 2、酶或酶系的选择争辩。 3、酶催化反应最佳工艺条件争辩。 4、产物的分别纯化争辩第五章 植物细胞培

17、育制药一、植物细胞的生理特性，植物细胞培育的基本流程和技术。生理特性：1、 比微生物细胞大得多；2、具有群体生长特性，单细胞难以生长，繁殖；3、对剪切力敏感，抗张力强度大，抗剪切力小；4、生长速度慢，操作周期长；5、简洁结成细胞团；6、大多植物细胞的生长及次级代谢物的生产都要求肯定的光照和时间，且不同波长的光具有不同的效果。基本流程：1、外植体的获得及预处理； 2、获得悬浮细胞株 3、悬浮细胞株筛选 4、植物细胞的扩大培育； 5、大规模培育基本技术：1、植物细胞的获得技术； 2、植物细胞的选育与改良技术； 3、植物细胞培育技术； 4、植物细胞培育次级代谢产物技术； 5、植物细胞培育生物转化技术

18、二、植物细胞猎取的主要方法及其操作过程，植物细胞培育制药的培育方法。愈伤组织培育的基本过程和操作。主要方法：从外植体直接分别，愈伤组织诱导猎取，原生质体再生操作过程：1、 外植体的选择与预处理。选择时需综合考虑的因素有外植体大小、同一植物不同部位的选取、不同物种的选择、植物年龄以及取材季节。留意灭菌剂和灭菌时间选择以及灭菌后无菌水洗。2、 直接分别：（1） 机械捣碎法：先将外植体轻轻捣碎，然后通过过滤和离心分别细胞；（2）酶解法：利用果胶酶，纤维素酶等处理，分别出具有代谢活性的细胞。3、 愈伤组织诱导法：（1）诱导培育基的制备 （2）外植体植入诱导培育基中培育生成愈伤组织 （3）愈伤组织继代培

19、育 （4）从愈伤组织分别得到植物细胞。4、 原生质体再生法（不要求）。培育方法：按培育对象分：愈伤组织培育，原生质体培育，小细胞团培育按培育基类型分：固体培育，液体培育按培育方式：悬浮细胞培育，固定化细胞培育基本操作和过程：1、 愈伤组织培育基的配制。 配制液体培育基 配制含有各种所需养分成分的液体培育基，其浓度是所需培育基浓度的2倍。 琼脂的配制与熔化 依据1.5%琼脂的比例称取琼脂，加入所需培育基体积一半的蒸馏水，放置一段时间，待琼脂吸水膨胀后加热使琼脂完全熔化。 分装 将上述熔化的琼脂趁热与液体培育基依据1:1的比例混合均匀，用稀酸或稀碱调整至所需的pH值，分装于培育皿、三角瓶或试管等培

20、育容器中。 灭菌 在120的条件下，灭菌1520min，冷却后备用。2、愈伤组织的选择。通常在愈伤组织诱导的10-15d左右进行继代培育，在继代培育的第10-15d进行新一轮的继代培育。3、接种。首先在无菌条件下，用镊子或小刀将选择好的愈伤组织块分割成若干小块，剔除附着在愈伤组织块上的原有培育基，必要时可以用无菌水清洗几次，然后在无菌条件下将处理好的愈伤组织小块转移到含有新颖固体培育基的培育皿中。4、培育。将培育皿置于培育箱中，在肯定条件下进行培育。培育肯定时间后，适时地进行下一轮的继代培育或接种到液体培育基中进行细胞悬浮培育。例：从愈伤组织获得植物细胞有哪两种操作方式？将愈伤组织接种到新颖的

21、固体培育基中是怎样操作的？（10分）答：方法1：对诱导获得的愈伤组织用镊子或小刀分割得到植物小细胞团；方法2：将愈伤组织转移到液体培育基中，加入经过杀菌处理的玻璃珠进行振荡培育，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞团和残渣，得到肯定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。 操作：在无菌条件下，首先用镊子或小刀将选择好的愈伤组织块分割成若干小块，将原培育基清洗洁净，然后将处理好的愈伤组织小块转移到含有新颖固体培育基的培育器皿中。三、植物细胞培育中提高植物次生代谢物生产的途径。（具例见教材）1、添加诱导因子：引起植物过敏反应，诱导植物特定基因表达，进而激活特定次生代

22、谢途径，积累特定的目的次生代谢物，具有种属专一性；2、前体饲喂：在植物细胞培育中加入次生代谢物合成的前体物质； 3、两相法培育：细胞在其中一相中生长并合成次生代谢物，而这些产物又通过主动或被动运输方式释放到细胞外，并被另一相所吸取，达到富集产物的目的； 4、培育条件的把握：通过优化培育基、光照、温度、通气等条件的调控，使细胞次级产物分泌变多； 5、在培育基中添加代谢产物合成抑制剂； 6、其他，如选育高产细胞株，二步法培育，新型生物反应器等。四、植物细胞培育次级代谢物生产的基本工艺过程，过程涉及到哪些争辩内容？如何进行争辩？工艺过程：1、 外植体的选择与处理； 2、植物细胞的获得； 3、植物细胞

23、的扩大培育； 4、植物细胞悬浮培育； 5、次级代谢物的分别纯化争辩的内容：1、外植体的选择和处理争辩； 2、愈伤组织诱导； 3、植物细胞的诱变、筛选； 4、细胞悬浮培育的争辩； 5、提取分别与纯化方法争辩五、植物细胞培育生物转化制药的基本工艺过程，过程涉及到哪些争辩内容？如何进行争辩？生物转化基本过程：1. 转化反应植物细胞筛选 2.外植体的选择和处理 3.培育基的选择和配置 4.细胞的猎取 5.稳定细胞系的建立 6.加入底物进行生物转化 7.转化产物的提取分别 8.产物检测争辩内容：1.转化持续时间的争辩 2.底物浓度的争辩 3.不同细胞密度的争辩 4.培育体系pH值的争辩 5.温度光照的争

24、辩六、植物细胞培育代谢物生产制药和生物转化制药其过程的影响因素。植物细胞培育代谢物影响因素：1.外植体的选择。不同外植体的悬浮细胞培育物，其最大次级代谢产物的累计时间各异。2.培育条件的影响 培育环境的内在因素： a。接种和诱导 b。基本培育基的组成： 1.磷 2.氮 3.碳源 4.植物生长调整剂 5.O2和pH值 6.渗出物 两步培育法 培育环境的外部因素： 温度 2.搅拌频率 3.培育容器的影响 4.光的影响生物转化制药其过程的影响：1、植物细胞的影响 1.转化系统的影响 2.细胞系的影响 3.细胞生长阶段的影响2、外源底物的影响（1）外源底物浓度的影响：外源底物对培育的植物细胞一般都是有

25、毒性的（2）外源底物结构的影响（3）外源底物添加方式的影响 不溶性的底物，先溶解后再加入；活用细粉末；用吐温或环糊精来促溶3、培育条件的影响培育基的组成、植物激素、刺激剂、抑制剂以及pH值、温度、光照等培育条件。第六章 动物细胞培育制药一、动物细胞的生理特点，生产用动物细胞的种类及其特点，生产用动物细胞的获得，工程细胞库的种类及要求，细胞的冷冻保存与复苏技术及其操作要领。生理特点：1、动物细胞的分裂周期长； 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象； 3、正常二倍体细胞的生长寿命有限； 4、对环境敏感； 5、对培育基要求高； 6、蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。细胞种类及特点：1、 原

26、代细胞：增殖力量有限，需大量动物。2、 二倍体细胞体：2n型染色体组，传代寿命有限，具有明显的贴壁依靠和接触抑制特点，无致癌性。3、 转化细胞系：具有无限繁殖超额力量，倍增时间较短，对培育条件和生长因子要求较低。4、 融合细胞系：杂交特性。5、 重组工程细胞系工程细胞库的种类及要求：1、 原始细胞库（MCB）:储存于MCB的细胞应当是单一来源的均质细胞，对二倍体细胞应当是群体倍增水平尽可能低的细胞。储存时需有该细胞的具体档案，包括该细胞系的历史，和对各种有害因子的检查结果。2、 生产用细胞（MWCB）储存于MWCB的细胞应当是从MCB来的，或从单一安瓿来，或从多个安瓿在溶化即刻混合在一起的然后

27、经培育扩增达肯定数量后，再分装储存形成的细胞库。该细胞库同样需要建档案，而且需进行无菌性的无细胞交叉污染的检查。细胞的冷冻保存与复苏技术及其操作要领：常用技术是液氮冷冻保存法，主要接受加入适量爱护剂的缓慢冷冻法保存细胞。步骤：细胞悬液制备加爱护剂分装和封口液氮冻存。复苏一般接受快速溶化法，以保证细胞外结晶快速溶化，以避开慢速溶化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。二、动物细胞体外培育的生长与增殖过程，动物细胞与微生物细胞和植物细胞在培育上的区分，动物细胞培育的方法和操作方式及其特点。生长与增殖过程：原代培育期传代培育期衰退期。培育区分：1、动物细胞无细胞壁，且大多哺乳动物细胞附着在固体或

28、半固体的表面才能生长；2、对养分要求严格，除氨基酸，维生素，盐类，葡萄糖或半乳糖外，还需要血清；3、动物细胞对环境敏感，包括pH，溶氧，温度，剪切应力都比微生物有更严的要求，一般需严格地监测和把握。培育方法及特点：1、 悬浮培育：适用于一切各类的悬浮细胞和兼性贴壁细胞。优点：操作简便，培育条件较均一，传质和传氧较好，简洁扩大规模培育。缺点：较难接受灌流培育，细胞密度一般较低（即不适于高密度培育）。2、 贴壁培育：适用于一切贴壁细胞和兼性贴壁细胞。优点：适用的细胞各类广，较易接受灌流培育，细胞密度高，缺点：操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培育条件不均一，传质和传氧较差。3、 贴壁悬

29、浮培育：将悬浮培育和贴壁培育两者结合，优势互补，主要方法有：微载体培育，包埋和微囊培育，结团培育。操作方法及特点：1、 分批式操作：细胞和培育基一次性加入反应器进行培育。2、 流加式操作：不断加入养分成分而不取出条件培育基（经培育已经含有细胞产物但不含细胞的培育基）。3、 半连续式操作：细胞和培育基加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中每隔一段时间取出部分培育物，补充同样数量新颖培育基，反应器内培育液的总体积保持不变。4、 连续式操作：连续地加入新颖培育基，同时等速地取出反应器内的培育液（连同细胞）。5、 灌流式操作：不断取出部分条件培育基（无细胞），补充等量新颖培育基。三、动物细胞大规模培

30、育的主要影响因素及其不良因素的把握。主要影响因素：1.细胞培育环境（养分条件、产物积累、pH、温度和渗透压） 2.乳酸和氨的毒性累积 3.必需养分物的添加 4.对细胞的剪切作用不良因素解决手段：设计适应细胞生长的无血清培育基；把握养分物的添加；削减产物消耗积累；剪切损害可通过反应器的优化被削减，另外在培育液中添加剪切抑制剂。四、动物细胞培育制药的基本工艺过程。目前用哺乳动物细胞大规模培育生产蛋白工业化过程的主要通用技术平台及其特点。如何进行动物细胞培育制药的争辩。动物细胞（捣碎）组织碎片（酶处理）单个细胞离心收集细胞（养分培育）培育瓶培育（酶）消化处理接种扩大培育种子细胞液氮保存取出细胞种子种

31、子解冻复活培育扩大培育接种大规模培育产物分别纯化产品。技术平台及特点：主要是以搅拌式生物反应器悬浮培育（70以上）作为通用技术平台, 平台工艺的特点是接受无血清培育（50以上）和成熟的流加和灌流工艺。悬浮培育工艺中影响细胞生产数量和质量的因素,主要应考虑细胞培育环境(养分条件、产物积累、pH、温度和渗透压) ,终产物(乳酸和氨) 毒性累积和必需养分物的添加等。设计适应细胞生长的无血清培育基,把握养分物的添加,削减产物消耗积累是解决问题的有效手段。 对于搅拌的剪切损害可通过反应器的优化被削减, 另外在培育液中添加剪切爱护剂。贴壁细胞生产工艺,最佳的生物反应器形式是搅拌式微载体悬浮培育系统,并可供应最有效的优化工艺和最适宜的流加工艺设计。最佳的工艺设计是高密度连续灌流培育。 流加培育和灌流培育是动物细胞培育工艺中最常用的两种操作方式。五、为什么要争辩不同宿主菌对目的蛋白表达的影响？是怎样进行争辩的？ 由于不同载体供应的不同增加子和启动子都有自己特异的结合蛋白，而只有能为它们供应这些蛋白的宿主菌才能使目的基因得到更好的表达。此外，不同大肠杆菌的不同种和亚种所含有的宿主蛋白酶种类和数量不同，对表达的产物会有不同程度的降解作用。故宿主菌的选择是