肉鸡中沙门菌污染监测

1、肉鸡中沙门菌污染监测 摘要 目的 对肉鸡养殖和屠宰环节进行沙门菌监测，确定肉鸡在养殖和屠宰环节中沙门菌的污染状况，分析肉鸡中沙门菌的污染来源，为食品平安风险评估供应基础数据，同时也为预防和把握由沙门菌起的食源性疾病供应科学依据。 方法 在四川省成都市、遂宁市选取肉鸡养殖场和屠宰场作为监测点。采集肉鸡活体肛拭、养殖场环境样本，肉鸡胴体，屠宰场环境样本进行沙门菌分别，并对检出菌株运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行分子分型，用微量肉汤稀释法进行14种抗生素药物敏感试验。 结果 共从2个肉鸡屠宰场和1个肉鸡养殖场采集样本417份，检出沙门菌12株，检出率为2.87%。通过PFGE分型，共得到4个带型。

2、其中遂宁养殖场的1株环境分别株和遂宁屠宰场的3株肉鸡胴体分别株具有相同PFGE型别，成都屠宰场的2株环境分别株和该屠宰场4株肉鸡胴体分别株具有相像PFGE型别。遂宁分别的4株沙门菌对14种抗生素100%敏感。成都分别的8株沙门菌对14抗生素耐药程度各异,其中4株沙门菌能耐受3种以上药物。结论 四川省部分地区肉鸡在养殖和屠宰环节存在沙门菌污染，且有多重耐药菌株消灭，应进一步加大监测力度。沙门菌是引起食源性疾病的常见致病菌之一。在自然界沙门菌分布广泛 , 主要由于食入污染食品,引起感染性腹泻。在全球范围内沙门菌引起的细菌性食物中毒都位居前列1,2，并且呈现上升趋势。在我国导致细菌性食物中毒的致病菌

3、中沙门菌位居首位3。鸡肉作为沙门菌污染的主要食物之一4，监测肉鸡中沙门菌的来源、污染和耐药状况,对因肉鸡沙门菌污染导致食物中毒的风险评估和预防、把握、治疗沙门菌引起的食物中毒具有格外重要的意义。近年来养殖中抗生素的过度和不正确使用导致动物中分别到耐药沙门菌的状况越来越普遍，且多重耐药的沙门菌也多有报道5。降低沙门菌对食品的污染是把握沙门菌食源性疾病的总要途径之一。通过溯源找出并消退污染源是防治沙门菌污染的有效手段。基于脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）的细菌分子分型技术已被多个国家用于建立了细菌分子分型网络及溯源平台（PulseNet，

4、Foodnet），并以此分析食源性致病菌来源和传播6。现今PFGE已被认为是沙门菌食物中毒的溯源分析的金标准。依据“2010年国家食品平安风险监测-肉鸡沙门氏菌专项监测”,在四川省内选取养殖场和屠宰场作为监测点,以肉鸡活体和屠宰后胴体作为监测对象开展监测工作，监测肉鸡在饲养和屠宰过程中沙门菌的污染状况，利用PFGE分子分型分析沙门菌的污染来源和集中途径，检测肉鸡中沙门菌的耐药状况。为四川省沙门菌风险评估供牢靠的基础数据，同时为预防和把握由沙门菌起的食源性疾病供应科学依据。1 材料与方法1.1监测点的设立 依据“国家食品平安风险监测-肉鸡沙门氏菌专项监测”要求，分别选取遂宁市规范化肉鸡养殖加工企

5、业的养殖场和屠宰场及成都市1大型屠宰场进行样本采集。监测养殖和屠宰前活鸡体内和屠宰后鸡胴体沙门菌带菌状况，及养殖场和屠宰场环境中沙门菌污染状况。1.2样品采集 监测点样本采集依据“国家食品平安风险监测-肉鸡沙门氏菌专项监测”供应方法。鸡活体肛拭采集是将拭子轻轻旋转插入鸡肛门内约34 cm处，紧靠肠壁表面黏液后退出后快速插回拭子管内并拧紧螺帽。鸡胴体采集是采集屠宰后深加工之前的胴体鸡。养殖场中实行活鸡肛拭，养殖场环境样本为实行多份鸡场地面土壤和鸡笼各部位表面涂抹拭子于同一采样袋中作为1份环境混合样本。屠宰场先实行屠宰前活鸡肛拭，再在屠宰后实行胴体鸡，单独包装冷藏送回试验室检验，屠宰场环境样本为宰

6、场台面各部位涂抹拭子和各种用具涂抹拭子于同一采样袋中作为1份环境混合样本。养殖场中采集鸡活体肛拭45份，鸡养殖场环境样本3份。屠宰场中采集鸡活体肛拭171份，鸡胴体176份，屠宰场环境样本12份。1.3 菌株分别和鉴定 样品处理依据“食品平安风险监测-肉鸡沙门氏菌专项监测”供应方法。沙门菌分别鉴定参照食品微生物学检验 沙门氏菌检验(GB 4789.4-2010)。疑似菌株生化鉴定接受全自动细菌生化鉴定仪(VITEK 32)。血清分型接受泰国SA公司诊断血清。1.4 药物敏感试验 分别得到的沙门菌用微量肉汤稀释法检测最低抑菌浓度(MIC)。结果判定依照抗微生物药物敏感性试验执行标准2010版(M

7、100-S20)判定,质控菌株ATCC25922来源于中国CDC养分与食品平安所。1.5 沙门菌PFGE分型分析 1.5.1 PFGE分型 沙门菌PFGE依据中国疾病预防把握中心推举的PlusNet的PFGE标准方法进行6，标准菌株H9812来源于中国细菌性传染病分子分型试验室，电泳以H9812/Xba I为Marker。取新颖琼脂培育物均匀悬浊于3ml细胞悬液(100mM Tris-HCL，100 mM EDTA， pH=8.0)中，调整浓度，使其OD值为4.04.2。取400µl菌悬液37孵育5 min,分别加入蛋白酶20µl（储存液浓度为20mg/ml）至终浓度 0.

8、5mg/ml,再与等体积1% Seakem Gold琼脂混合 ,加入模具。在室温下凝固后取出胶块加5ml细胞裂解液(50mM Tris-HCL，50 mM EDTA， 1% 十二烷基肌氨酸钠， 0.1mg/ml 蛋白酶， pH=8.0，)，混匀，54水浴轻摇2h，转速170rmp。50 ddH2O水浴10min洗胶块2次，TE 50水浴10min洗胶块4次。切2mm胶块加入195µl酶切缓冲液中，再加入5µl Xba，37酶切2h。酶切好的胶块粘在梳子上制胶、电泳，电泳时泵设为70，电泳温度14，电压梯度6V/cm，脉冲时间 2.1663.80s，电场夹角120°

9、，电泳时间19h。电泳胶用GlodRed染色，用Bio-Rad凝胶成像系统猎取电泳结果。1.5.2 聚类分析 数据分析利用BionumeriscV5.10软件对数据进行聚类分析,方法接受UPGMA（Unweighted Pair group Method using Arithmetic averages）。聚类相像性系数(距离)接受的是基于条带比较的Dice。依据聚类结果，按不同菌株的相像性系数进行分型，相像系数等于100%的不同菌株为同一PFGE型。2 结果2.1 肉鸡监测沙门菌分布 2010年食品平安风险监测-肉鸡沙门氏菌专项监测中沙门菌分布见表1。样本采样总量417份，其中活鸡肛拭子2

10、16份, 占监测总量的51.8%, 屠宰后胴体186份, 占监测总量的44.6%，环境样本15份。8、9月于遂宁养殖场共实行3批样本，遂宁屠宰场共实行6批样本。9、10月份于成都屠宰场共实行6批样本。监测中共检出阳性菌株12株，阳性率2.87%。遂宁养殖加工厂的养殖场环境中分别出1株，屠宰后胴体中分别出3株。成都屠宰场2批屠宰后胴体样本中共分别获得6株沙门菌，在屠宰场环境样本中分别出了2株沙门菌。阳性样本集中在屠宰后肉鸡胴体中，屠宰后胴体阳性率4.84%。2地屠宰场和养殖场的活鸡肛拭样本中都未检出沙门菌。2.2 沙门菌血清分型 经血清分型将检测得到的菌株分为3个血清型。在遂宁肉鸡胴体和肉鸡养殖

11、场环境中分别的4株均为D群的山夫顿堡沙门菌。在成都肉鸡胴体中分别的6株沙门菌中4株为C2群的布利丹沙门菌，其余2株为C1群的巴森海德沙门菌。成都屠宰场环境中分别的2株均为布利丹沙门菌。2.3 沙门菌PFGE分子分型 分别得到的沙门菌经PFGE分子分型得到4个PFGE型别。不同血清学型的沙门菌株在PFGE分型上也有明显的区分（图1）。遂宁屠宰后胴体中分别得到的3株沙门菌和1株从遂宁养殖场环境中分别的沙门菌具有相同的PFGE型。而从成都屠宰场获得的6株布利丹沙门菌可分为2个PFGE型，A型和B型，2者间相像度达到92.86%，仅存在有4根条带的差异。2株A型的沙门菌均来自于成都屠宰场环境，而4株B

12、型的沙门菌均来自于成都屠宰场肉鸡胴体。从成都屠宰场中分别的的布利丹沙门菌和巴森海德沙门菌(C型)间相像度为69.33%，而山夫顿堡沙门菌(D型)与其他PFGE型沙门菌相像度较低为59.19%。2.4 沙门菌抗生素敏感试验 12株沙门菌对14种药物的耐药性状况见表2。在分别出的阳性菌株中，遂宁分别出的4株山夫顿堡沙门菌(D型)均未消灭耐药性，而成都分别的8株菌对萘啶酸均消灭不同程度的耐药。相同PFGE型的沙门菌也具有相像的的耐药性（表3）。B型沙门菌主要对萘啶酸具有抗性，而C型和A型的沙门菌都能耐受3种以上抗生素。C型和A型的沙门菌对青霉素类和磺胺嘧啶都有很高的耐药性。除此之外，C型还对复方磺胺

13、类、四环素和氯霉素有较高的耐药性。注：SDI：磺胺嘧啶；SXT：甲氧苄啶/磺胺甲恶唑；TET：四环素；GEN：庆大霉素；AMK：阿米卡星；KAN卡那霉素；NAL：萘啶酸；CIP环丙沙星；CHL：氯霉素；AMP氨苄青霉素；AMC阿莫西林/克拉维酸；FEP：头孢吡圬；CTX：头孢噻肟；CRO：头孢曲松。3 争辩在自然环境中广泛存在沙门菌，而不同地区沙门菌有其分布特点。从各个采样点所获沙门菌分布来看，不同地点沙门菌血清型差异明显，不同区域有各自的沙门菌优势血清型。在遂宁鸡群中是山夫顿堡沙门菌，而成都屠宰场中则是布利丹沙门菌。成都屠宰场的肉鸡胴体带菌率高于遂宁屠宰场，这可能源于2地不同的管理模式。遂宁

14、加工厂肉鸡为自产自销模式，屠宰场鸡群均来自其养殖场，养殖和屠宰环节管理严格。而成都屠宰场为来样加工，鸡群来源于全省不同肉鸡养殖场，不同养殖场肉鸡沙门菌污染率不同，污染的沙门菌种类也有不同。成都屠宰场在屠宰不同来源肉鸡时其间没有明显间隔，屠宰工作人员也没有明确的职能区分，因而易产生交叉污染。在成都屠宰采集的同一批肉鸡胴体样本中就分别出了布利丹沙门菌和巴森海德沙门菌2种不同血清型的沙门菌。因而不同地区肉鸡沙门菌污染状况存在差异。基于PFGE技术的分子分型因与其他分型技术相比其区分度更强、重复性好,在污染溯源分析和流行病学分析中得到了广泛应用7,8。与传统分型方法相比PFGE从基因组层面对细菌进行分

15、型能获得基于遗传性状的型别，能更清楚的确定不同沙门菌菌株的亲缘关系。在基于PFGE的聚类分析中发觉，从遂宁屠宰后胴体中分别的3株沙门菌与养殖场环境中检出的沙门菌PFGE型相同（图1），并且屠宰的肉鸡均来自与该养殖场，可以确定遂宁监测中获得的沙门菌来源相同。养殖场环境中的沙门菌是肉鸡中沙门菌的重要污染源。成都屠宰场沙门菌的来源简单，影响因素较多。屠宰后鸡胴体的沙门菌污染则可能来源于屠宰场环境或肉鸡。通过的PFGE分析发觉，虽然屠宰场环境中检出的A型沙门菌与肉鸡胴体中的B型沙门菌PFGE型不同（图1），但2亚型间仅有4条带差异。依据Tenover的判定标准9，2型PFGE间约有2个独立基因的变异，

16、PFGE之间仍可能具有亲缘关系。在屠宰过程中肉鸡可能受到多方面的污染。屠宰过程中屠宰场环境可能会污染肉鸡，而带菌的肉鸡也可以与其他肉鸡直接接触或通过污染屠宰场环境导致其他肉鸡带菌。肉鸡养殖场所和屠宰环节为沙门菌污染的重要环节，对于肉鸡沙门菌污染来源的监测特殊是对屠宰环节需要制定更细致的监测方案和更多的监测数据。该监测中所获沙门菌的样本类型分布状况中可以发觉，沙门菌在养殖和屠宰环节中广泛存在，屠宰后肉鸡胴体中沙门菌污染率较高。在屠宰过程中及屠宰后肉鸡成批堆放增加了同群肉鸡间交叉污染的风险。沙门菌集中在3批屠宰后胴体样本中且相同批次中检出的沙门菌常具有相同的PFGE型，说明屠宰过程中存在交叉污染。

17、活鸡肛拭中未检出与养殖中使用抗生素可能具有肯定联系。抗生素的使用可以导致活体体内带菌率或带菌量降低而难以检出。在以后监测中应考虑检验肉鸡中的抗生素残留。细菌耐药性的逐年提高以及多重耐药甚至超级细菌的消灭对生物平安的影响已经引起很全球的警惕。在以往的监测中越来越多的多重耐药沙门菌被发觉5，而我国沙门菌耐药状况也不容乐观10。在我国养殖业中抗生素滥用状况严峻，抗生素的不正确和过度使用普遍存在。这也加剧了耐药细菌的产生和多重耐药菌的消灭。四川地区以往的检测中已经发觉能耐受从基本到高端各种抗生素的沙门耐药菌株11。调查食品中的沙门菌的耐药趋势和耐药谱，对抗生素的合理运用和防止耐药菌株的传播具有重要意义

18、。在这次监测中，不同地区分别得到的菌株耐药性差异较大。遂宁获得的4株沙门菌对14种抗生素均未消灭耐药性（表2），这有赖于其规范化的养殖管理以及养殖中抗生素的合理使用。而在成都屠宰场中分别得到的菌株都消灭不同程度的耐药性，而且有的还消灭了4株多重耐药沙门菌。成都屠宰场的肉鸡来源全省各地的养殖场，不同养殖场的管理和技术参差不齐，难免存在抗生素的滥用，造成耐药沙门菌的消灭。值得留意的是，分别得到的巴森海德沙门菌耐受的6种抗生素中青霉素与另2类抗生素氯霉素和四环素间存在拮抗作用，犹如时使用会导致药效降低，增加耐药菌消灭的可能性。在耐药性分析中发觉布利丹沙门菌两种PFGE型间存在耐药谱重叠。环境中的A型沙门菌除和胴体中B型沙门菌都同样耐受萘啶酸，说明2个PFGE型之间可能存在亲缘关系（表3）。此外，A