(上)证明力与证据能力规则演变规律探究

1、超高压提取山茱萸中熊果酸优化工艺研究请在此文上进行修改，并不接受修订。请补充作者和基金项目信息。摘要：【目的】研究超高压法提取山茱萸中熊果酸的最佳工艺条件，探讨山茱萸中熊果酸提取的适宜方法。【方法】在单因素试验的基础上，采用L9(34)正交试验对超高压提取山茱萸中熊果酸的工艺进行优化，以熊果酸得率为指标，考察料液比(g：mL)、乙醇浓度、超高压压力、加压时间对熊果酸得率的影响；同时与回流提取法和超声提取法进行比较。【结果】超高压提取山茱萸中熊果酸的优化工艺条件为：固液比1:22、乙醇浓度7570%、超高压压力320 MPa, 超高压时间4 min，该条件下熊果酸得率可达0.322%。【结论】超

2、高压提取熊果酸得率高，提取时间短，是一种提取山茱萸中熊果酸的适宜方法。关键词：超高压；山茱萸；熊果酸；提取工艺中图分类号:TS201.1 文献标识码：BStudy on extraction of ursolic acid from Cornus officlnalis seb.et zucc by ultra high pressure method Abstract: ：请根据修改后的中文摘要重新撰写英文摘要。【Objective】To study the optimum ursolic acid of extracting.conditions ursolic acid from Cor

3、nus officlnalis seb.et zucc by ultra high pressure(UHP). 【Objective】Basid on signal factor test, the L9(34) orthogonal design was used to optimum UHP extraction conditions which extract ursolic acid from Cornus officlnalis seb.et zucc . Using extraction yield of ursolic acid as index, the influence

4、of solid to liquid ratio, ethanol concentration,UHP pressure, UHP time were studied, and the yield with UHP method was compared to reflux extraction method and ultrasonic wave extraction method.Ultra high pressure (UHP) method was studied and was compared to reflux extraction method and ultrasonic w

5、ave extraction method. According to the signal factor test, the L9(34) orthogonal design was used to optimum extraction conditions. Using with extraction yield of ursolic acid as index, the influence of solid to liquid ratio, ethanol concentration,UHP pressure, UHP time were studied. 【Result】Optimum

6、 extraction conditions by UHP extraction were as follows: solid to liquid ratio1:22(g:mL), ethanol75ethanol70%, UHP pressure 320Mpa and UHP time 4min, The yield of UA was 0.322%.【Conclusion】The UHP extraction method was a suitable method for it has higher yield and shorter extraction time.Key words:

7、 Ultra high pressure; Cornus officlnalis seb.et zucc.; ursolic acid; extraction 【研究意义】山茱萸( Cornus officlnalis Sieb.et Zucc.)为山茱萸科山茱萸属小乔木（苏秀梅，2012），其果实含有丰富的功能性成分。研究表明，山茱萸中的熊果酸具有抗氧化、降血糖等作用（杨剑芳等,2006；袁菊丽和姜红波,2011；张茜等,2011）。因此，提取山茱萸中熊果酸成分，以开发保健食品具有广阔的前景。【前人研究进展】目前，一些研究者已经研究了一些山茱萸中熊果酸的提取方法。张如新等（2008）采用超声

8、法提取山茱萸中熊果酸成分，得到超声波法提取山茱萸中熊果酸的最佳工艺参数为：用15倍量无水乙醇浸泡24 h，在输入功率40%下超声10 min, 熊果酸得率为0.86。胥佰涛等（2009）采用发酵结合超声波辅助法提取山茱萸中的熊果酸，在30下、酵母接种量和原料质量比为3:80、摇床转速为150 r/min时，发酵效果好,在酒精浓度85、温度50、超声功率100 W、时间30 min条件下提取效果最好，熊果酸得率为0.2512。阮丽红和姜春鹏（2010）采用超微粉碎回流提取法提取山茱萸中熊果酸成分，结果发现较适宜的工艺条件为：粉碎粒度20m、提取温度70、提取时间22min、乙醇体积分数85%，熊

9、果酸得率可达0.213%。张永生等（2011）通过乙醇回流提取法对山茱萸中熊果酸的提取工艺进行了优化，得到优化的工艺条件为乙醇浓度为75、料液比为12 mL/g、提取时间为1.5 h，熊果酸得率达0.31。【本研究切入点】超高压提取是在常温条件下提取植物原料中有效成分的新技术，该技术具有提取时间短、能耗低、有效成分破坏小的优点。凌庆枝等（2008）采用超高压技术提取桑叶多糖；纵伟和李翠翠（2012）采用超高压法在常温下提取铁皮石斛中的多糖成分；董海丽和刘红（2012）采用超高压方法提取柿叶中熊果酸。但目前超高压技术在山茱萸中熊果酸提取的应用上仍未见报道。【拟解决的关键问题】本研究在单因素试验的

10、基础上，采用L9(34)正交试验对超高压提取山茱萸中熊果酸的工艺进行优化，并且将之与回流提取法和超声提取法进行比较，探讨山茱萸中熊果酸提取的适宜方法。1 材料与方法1.1 试验材料试验于2011年12月于鹤壁职业技术学院食品检测中心进行。山茱萸采于河南省西峡县，60烘干、粉碎至20目、真空包装备用；熊果酸对照品由中国药品生物制品检定所提供；乙醇试剂均为国产分析纯。主要仪器包括：UHP900×2-Z超高压处理装置（包头科发公司）、JY88-II超声波细胞粉碎机（上海新芝生物技术研究所）、旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、Agilent 1100 高效液相色谱系统（Agilent公司）。

11、1.2 试验方法1.2.1 超高压提取山茱萸中熊果酸 在山茱萸粗粉中，加入不同体积、不同浓度的乙醇溶液，混合均匀后装入聚乙烯塑料袋中进行真空包装，然后放入超高压装置的压力腔中，高压处理一定时间处理后过滤，3500 r/min离心15 min，离心后减压浓缩，测定熊果酸含量，计算熊果酸得率。1.2.2 回流提取山茱萸中熊果酸 在山茱萸粗粉中，按固液比1:20(g:mL)加入75%的乙醇溶液，加热回流2 h后过滤，3500 r/min离心15 min，离心后减压浓缩，测定熊果酸含量，计算熊果酸得率。1.2.3 超声提取山茱萸中熊果酸 在山茱萸粗粉中，按固液比1:20(g:mL)加入75%的乙醇溶液

12、，采用220 W超声处理30 min后过滤，3500 r/min离心15 min，离心后减压浓缩，测定熊果酸含量，计算熊果酸得率。1.2.4 熊果酸的HPLC测定 参照HPLC方法测定熊果酸（杨剑芳等,2007），色谱柱：Phenomsil BDS C18，4.6 mm×200 mm，5 m ；流动相：CH3OH：H2O：HAc 为85150.3；流速：1 mL/min；柱温：35；检测波长：215 nm。峰面积A与熊果酸浓度C（mg/mL）之间的回归方程为A=381.63C-3.0644（R2=0.9996）。2 结果与分析2.1 超高压提取山茱萸中熊果酸单因素试验2.1.1 固液

13、比对熊果酸提取得率的影响 采用70%乙醇溶液为溶剂， UHP压力350 MPa下保压4 min进行提取，不同固液比对熊果酸提取得率的影响见图1。由图1可知，随着固液比中溶剂用量的增加，熊果酸的提取得率增加，但当固液比达到1:20（g：mL）后，再增加溶剂用量，熊果酸得率增加缓慢。同时，过多的溶剂用量会带来后续浓缩强度增加的问题。因此，综合考虑，采用固液比1:20较好。 图1 固液比对熊果酸得率的影响横坐标直接改为1:5，其他的一样。Fig.1 Effect of solid to liquid ratio on the yield of ursolic acid 2.1.2 乙醇浓度对熊果酸提

14、取得率的影响 采用不同浓度的乙醇溶液为溶剂，固液比1:20（g：mL）、UPH压力350 MPa下保压4 min进行提取，乙醇浓度对熊果酸提取得率的影响见图2。由图2可知，随着乙醇浓度的增加，熊果酸的提取得率增加，但当乙醇浓度达到70%后，再增加乙醇浓度，熊果酸得率反而下降。这是由于按相似相溶原理，溶剂的极性与熊果酸相当，则熊果酸溶解度最大。70%乙醇溶液的极性与熊果酸相当，乙醇浓度过小或过大，则溶剂的极性与熊果酸不相当。 图2 乙醇浓度对熊果酸得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of ursolic acid2.1.

15、3 UHP压力对熊果酸提取得率的影响 采用70%乙醇溶液为溶剂，固液比1:20（g：mL），在不同UHP压力下保压4 min进行熊果酸提取，UHP压力对熊果酸提取得率的影响见图3。由图3可知，随着UHP压力的增加，熊果酸的提取得率增加，但当UHP压力达到300 MPa后，再增加压力，熊果酸得率反而下降。这是由于超高压提取的过程是加压后造成细胞破裂，使内容物溶出，在300 Mpa时，细胞破裂，熊果酸溶出增加；再继续增加压力，细胞过度破裂，造成细胞中其他杂质过多溶出，有效成分的传质速率降低，影响熊果酸游离到细胞外。因此，UHP压力为300 MPa时提取熊果酸较好。 图3 压力对熊果酸得率的影响 F

16、ig.3 Effect of UHP pressure on the yield of ursolic acid2.1.4 保压时间对熊果酸提取得率的影响 采用70%乙醇溶液为溶剂，固液比1:20（g：mL），在UHP压力300MPa下保压不同时间进行熊果酸提取，保压时间对熊果酸提取得率的影响见图4。由图4可知，随着保压时间的增加，熊果酸提取得率增加，但当保压时间达到4 min后，再继续增加保压时间，熊果酸得率增加缓慢。这是由于超高压提取过程就是加压后造成细胞破裂，使内容物溶出。本研究中，保压4 min时细胞已经破裂，熊果酸和周围溶剂之间达到传质平衡，再增加保压时间，熊果酸得率基本不变。因此，

17、保压时间为4 min时熊果酸提取效果较好。 图4 保压时间对熊果酸得率的影响 Fig.4 Effect of UHP time on the yield of ursolic acid2.2 熊果酸提取工艺条件的优化在单因素试验的基础上，选用L9(34)正交试验表，以熊果酸得率为指标，考察固液比、乙醇浓度、UHP压力、UHP时间对熊果酸得率的影响，试验设计和结果分别见表1和表2。由表2极差分析结果可知，各因素对熊果酸得率的影响程度依次为：DCBA，即UHP时间UHP压力乙醇浓度固液比。优化的提取条件为 A3B3为何不是B1，此外，请补充此工艺条件下熊果酸的得率。C3D2A3B1C3D2,即：U

18、HP时间4min、UHP压力320Mpa、乙醇浓度7570%、固液比1:22。在此工艺条件下进行验证试验，熊果酸的得率为0.322%。为何要突然出现此句话？且山茱萸的用量应是在试验材料中就应说明。 表1 因素与水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test因素/水平Factors/levels(A)固液比(g/mL) solid to liquid ratio(B) 乙醇浓度（%）ethanol concentration(C)UHP压力(MPa) pressure(D)UHP时间 (min) time11:18652803.521:2070300

19、4.031:22753204.5 表2 正交试验结果 Tab.2 Result of orthogonal test编号number(A)固液比(g/mL) solid to liquid ratio(B) 乙醇浓度（%）ethanol concentration(C)UHP压力(MPa) pressure(D)UHP时间 (min) time得率(%)yield11:18652803.50.22121:18703004.00.31831:18753204.50.30441:20653004.50.26251:20703203.50.26761:20752804.00.28471:226532

20、04.00.31281:22702804.50.27191:22753003.50.289k10.2810.2650.2590.259k20.2710.2850.2900.305k30.2910.2920.2940.279R0.0200.0270.0350.046对表2的试验结果进行方差分析和F检验，F检验结果（表3）表明，UHP时间和UHP压力对熊果酸得率在所考察的范围内影响显著,而乙醇浓度和固液比对熊果酸得率在所考察的范围内影响均不显著。表3 方差分析结果Tab.3 Result of variance analysis因素 factors偏差平方和sum of square自由度free

21、domF/F0.05 显著性significanceA0.00120.571不显著(no)B0.00120.571不显著(no)C0.00221.143显著(yes)D0.00321.714显著(yes)误差error0.018采用山茱萸2 kg，按上述最佳条件进行验证实验，熊果酸得率为0.322%。为何要突然出现此句话？且山茱萸的用量应是在试验材料中就应说明。2.3 不同提取方法熊果酸提取得率比较将山茱萸分别采用超高压、回流和超声法进行提取，比较提取后熊果酸得率和提取所用的时间可知，3种不同的提取方法中，超高压法熊果酸提取得率不仅高，且提取时间短（表4）。 表4 3种方法提取山茱萸中熊果酸的

22、得率和提取时间 Tab 4. Compare of extraction yield and time of three methods 方法method超高压提取法ultra high pressure method回流提取法reflux extraction超声提取法ultrasonic extraction 得率(%)yield0.3220.3150.287时间(min) time4120303 讨论山茱萸是一种资源丰富的药食两用植物资源，是开发保健食品的较好原料，对其活性成分熊果酸的分离提纯及药理学进行深入研究，开发精制、深加工转化产品是其发展方向。目前，山茱萸熊果酸最常用的提取方法是

23、回流法，该方法对设备条件要求不高，操作方法简单，但熊果酸提取率不高，且提取时间长；通过采用超声强化提取可提高其得率，缩短时间，但超声容易造成有效成分破坏，且提取时间仍然需要30 min以上；超微粉碎法通过对细胞进行破坏，提高提取熊果酸提取得率，但其对细胞的破坏程度有限，得率仍有待提高。本研究采用的超高压提取法，其是通过加压破坏山茱萸细胞，促进熊果酸溶出，在提取过程中，细胞在压力作用下被破坏，但由于为非热提取，熊果酸破坏小，且提取过程中细胞在几分钟内即被破坏，提取时间极大缩短，得率得到提高。4 结论采用超高压法提取山茱萸中熊果酸的优化工艺条件为固液比1:22、乙醇浓度7570%、UHP时间4 m

24、in、UHP压力320 MPa，熊果酸得率可达0.322%，具有提取时间短、得率高的特点，在提取山茱萸中熊果酸中具有很好的应用前景。参考文献：根据我刊要求，应将所有作者罗列出来，并修改英文。董海丽,刘红.2012.超高压提取柿叶中熊果酸工艺条件的优化J.湖北农业科学,16: 3567-3569.Dong H L. Liu H.2012. Optimization for utra hgh pessure etraction of usolc aid in dospyros kaki L.f. laves J.Hubei Agricultural Sciences,16: 3567-3569.凌

25、庆枝,李晓,魏兆军, 纵伟等. 2008.桑叶多糖超高压提取工艺的研究J. 食品与机械,2:50-53.Ling Q Z,Li X, Wei Z J, et alZong W. , Study on technology of extraction polysaccharides from Morus abla L. leavesJ Food & Machinery,2:50-53.阮丽红,姜春鹏.2010.湿法超微粉碎提取山茱萸中熊果酸工艺条件的优化J.湖北农业科学, 10:2521-2523.Yuan L H, Jiang C P.Extraction of ursolic aci

26、d from cornus offtcinalis by wet ultrafine grinding technolioyJ.Hubei Agricultural Sciences, 10:2521-2523.苏秀梅. 2012.吴茱萸与山茱萸的鉴别J.海峡药学, (03) :44-45Shu X M.2012. Dsting of tetradium ruticarpum and cornus offtcinalis J.Strait Pharmaceutical Journal., (03) :44-45胥佰涛,何国庆,李心泓, 海宁 沈生荣等.2009.超声波辅助法提取山茱萸发酵产物中

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29、测定山茱萸及其浸泡酒中熊果酸和齐墩果酸总量J. 酿酒科技,2007,11:100-103. Yang J F, Lu F P, Gao W Y, Huang M. Y.et al.等.2007.Determination of the total amount of ursolic acid and oleanolic acid in cornus officinalis and its steeping wine by HPLC J. Liquor-making Science& Technology,2007,11:100-103. 袁菊丽,姜红波.2011.山茱萸的主要化学成分及药理作用J.化学与生物工程,28(5):7-9Yuan J L,Jiang H B.2011. Main chemical composition and pharmacological effect of cornus officinalis J.Chemistry & Bioengineering,28(5):7-9张茜,朱亚利,张德甫, 胡巧云等.2011. 山茱萸