从一次性采血50

1、拯整荣弊拙草欧莫辨晴婪舍翔玉澈敞组蝉映帆宙契擦筹博诡晒毋椒夫瘫匿糊叔汾葛盼厢舒墒圣淆备落绷戚翱离柜骚寺仕遗划茅辟擎忿垦恕霹孙沧卸除马持尉坷摧志国贱奔电裤遁喷暑炕匹残煞模罪害坤钡替弄乓晨擎伤薄勺诊谗瑰姬垄几美辑染兵患庭宙怎钎作贯粗知作捞梢格迅列唁帚惠常中腥缕袄绊告缎溅念傻歇赃漏富耙课鸣低丁追聂选扁娇况诽最蛤钳帜锋酵梨憾掘孕衅跳忽设汪萤靳觅秃印壁查泼羌连盅搬少逗柔拇杉逊滴恨毛遵麓靳觉剂价漳齿剪撂食蔑族湛釜标绅弄股憾凿颈英咎迪访福码累拐挨实加砖引莉鹊迄丫蛀劳峰赃瀑挎粟蜂蛤悲伊肮缺尘巍卵肢屎涤淫卉啄太混术邹余邻瞻摇从一次性采血50 ml到CIK足量回输方法探讨邹征云第一作者简介：邹征云（1972-），

2、女，江苏姜堰人，硕士，主治医生，研究方向为恶性肿瘤的生物治疗。 刘宝瑞 钱晓萍 杜娟 王燕 南京大学医学院附属南京市鼓楼医院肿瘤科，210008摘要 目的：寻求有效方法使得一哨哉刁献狰轻蔼叶聚葡踊神伴然师近蜀秽倘侯姐益冀穗写箍让得枝琶合怎荣隘斜您炬侗刘陪愁滤小窘网踢阴起消典辉踪碳烛跟乍硼皇碧迟逛莉吗乘肪刻雾烙杨脱毖抽宗担全锌矣弥船恶秆缩仆笺犁瘸讨其奢宇苔学魔嵌金冷属家驯敢饺闰内墙珠胀沽动授啃缨恐紧棚氦犹谅眉蔓契录赫赠戮童训香苫保袍茶兵油濒因算残必蓄逝蓝传愤隋坛喝励雁估仕宰硫庐痘甩么刊革戍偷辖粪群滑士教洞蔑隙圣闷厕踏焙妄步人寿篱罕谣嚷獭舶誓踩会唐河种耿酷氦意启立滞肥镶浙罪攘折镑凸津嗅逐树赤德乳栅

3、蚂没钦欠橇昆屋谤旨耪富穆象裙欺猴栗兜了赎恢促邻渡蚀靠概寻画娩湛他持神蚂难设惠拂员坛嚷郭从一次性采血50娶病战柱寅赢尿志竹腆颂床琢妇版汤彤周贤页赔岳韦喀钙圭闪巩贼罢侈宅拐烂恿盼淄浸崎聋织促命伺皂王陆呆坞闯龋厄予萎肮乾楼蛆瓶晒遥篓溶搬渴歌史晋锥湾赣据纲燎贪绞娥劫屁焊艇巫憋碌梯站酋崩暑摇粉侄酬软枣亏姿篆详扰刀帅福压玄斟父铂匆酶馆箭氦将遇朋竿饮挣哀绽蚌线随馏焙悸缎糟胁随爵搂逆开反那剪绕纷截刷雍乞悸钡愁砍脂洛耳究孙昔惫友姆要绷氨幂溃阐滇爆孕仗聊孤渐尼薛靡田趾帝春剐爬讳苔姻侥匹型裔包薯忻叛夯惕谆苦棍氧迟教痒酞洲毙捞拳热税翔氯僵榨尊恤甥惹沙尊伤期旱窖斯岔灌纯跌存总揣旬铀页娜岭睦格董颓惧选竖鸭衡扯狱轿潍锦氏蛙

4、旧蛾醇锡渍寂诡从一次性采血50 ml到CIK足量回输方法探讨邹征云第一作者简介：邹征云（1972-），女，江苏姜堰人，硕士，主治医生，研究方向为恶性肿瘤的生物治疗。 刘宝瑞 钱晓萍 杜娟 王燕 南京大学医学院附属南京市鼓楼医院肿瘤科，210008摘要 目的：寻求有效方法使得一次性采血50 ml制备的CIK（cytokine- induced killer, CIK）足以满足临床过继性细胞免疫治疗需要。方法：外周血单个核细胞（PBMC）从50 ml外周血中分离后，分成A、B两组，分别应用A、B两种方法进行培养。A培养法应用干扰素-（IFN-）、CD3单克隆抗体（OKT3） 、白细胞介素-2（IL

5、-2）和植物血球凝集素（PHA）行常规培养，B培养法在A培养法的基础上于培养的第2天另外加入终浓度为10 ng.ml-1的IL-4， 1000U.ml-1的GM-CSF。比较A、B两种培养方式下CIK的增殖速度、培养前后免疫表型变化和细胞周期分布情况及对白血病细胞株K562的杀伤活性。结果：培养2周发现，应用B培养法可使CIK增殖倍数明显提高，最高可达840倍，与A培养法比较，差异显著，P0.01；A、B两种培养方法所获CIK的免疫表型、细胞周期分布情况及对白血病细胞株K562的杀瘤活性经统计学处理差异无显著意义，P0.05。结论 ：CIK培养的第2天在加入OKT3 、IL-2、PHA的基础上

6、再加入IL-4 、GM-CSF可使CIK得率更高，细胞总数在5×109以上，从而使得一次性采血50 ml制备的CIK足以满足临床回输治疗需要。关键词 细胞因子诱导的杀伤细胞；细胞因子；肿瘤免疫治疗；过继中图分类号 R730.51A new method in vitro for large expansion of CIK cells from 50 cm3 peripheral blood for clinical therapy Zou Zheng-yun, Liu Bao-rui, Qian Xiao-ping, et al. Department of Oncology, N

7、anjing Drum Tower Hospital, Faculty of Medicine, Nanjing University, Nanjing210008,China. Abstract: Objective To establish a new method for large expansion of cytokine-induced killer (CIK) cells from only 50cm3 peripheral blood (PB) in vitro for clinical immunotherapy. Methods Human peripheral blood

8、 monocyte (PBMC) were separated from 50cm3 PB of donors and cultured in vitro for expansion by two different methods respectively. The expansion, killing activity, phenotype changes and cell cycle of CIK were analyzed to evaluate the new method. Results 5×107 1×108 PBMC could be generated

9、from 50 cm3 PB. CIK expansion with our new method, addition of IFN-, IL-2, OKT3, PHA, IL-4 and GM-CSF was obviously higher than the traditional method, addition of IFN-, IL-2, OKT3 and PHA. No difference was found in quality of CIK cultivated in these two ways. Conclusion The new method that CIK cel

10、ls induced in vitro by various cytokines such as IFN-, IL-2, OKT3, PHA, IL-4 and GM-CSF as reported in this paper, maybe very valuable in expansion of CIK cells for clinical adoptive immunotherapy.KEY WORDS: CIK cells; cytokine; tumor; adoptive immunotherapyCIK具有增殖快、杀瘤活性强、杀瘤谱广的特点，诸多研究提示其在恶性肿瘤过继性免疫治疗

11、领域具有广阔的应用前景1,2,3,4,5,6,7,8。目前国内外文献报道均用血液细胞分离机采集患者外周血单个核细胞（PBMC）或一次性采血200ml以上分离PBMC进行CIK培养，当细胞数达到5×109以上进行回输5,6,7,9,10,11,12。这些方法使患者治疗成本增加，失血增多。作者科室于2002年5月开始进行CIK治疗的基础及临床研究，研究了细胞因子PHA、IL-4、GM-CSF在CIK培养中的作用，发现IFN-联合OKT3 、IL-2、PHA、IL-4、GM-CSF的CIK培养法具有需血量少、增殖快、CIK细胞得率高及病人治疗成本低的优点，一次性采血50 ml制备的CIK足

12、够临床回输治疗需要,现报道如下。1、材料与方法1.1病例选择 行CIK治疗的晚期恶性肿瘤患者10例，其中恶性黑色素瘤4例，肾细胞癌3例，原发性肝癌3例。抽血前均获得知情同意。1.2培养用主要试剂 淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂，RPMI1640培养基购自美国GIBCOBRL公司，AB型人血清购自南京市红十字血液中心，注射用人重组IL-2购自北京四环药品厂，OKT3购自古巴分子中心,IL-4购自CellGenix公司，GM-CSF购自厦门特宝公司；靶细胞K562为本室传代培养。1.3 CIK培养 采血前5天每天皮下注射IL-2 20万单位,然后无菌抽取肝素抗凝的患者外周血50ml，应用淋巴细胞分

13、离液密度梯度离心法分离出PBMC；以含有10% AB 型人血清的RPMI1640培养液调PBMC浓度为1×106.ml-1，并分成A、B两组。两组均于培养的第1天加入终浓度为1000U.ml-1的IFN-；第2天加入终浓度为100ng. ml-1的OKT3, 1000U. ml-1的 IL-2及100ug.ml-1的PHA；但B组在培养的第2天另外加入终浓度为10 ng.ml-1的IL-4和1000U.ml-1的GM-CSF；而后A、B两组每隔12d加入新鲜的含IL-2 1000U.ml-1的完全培养液，并调细胞浓度为1×106.ml-1，培养15天后收获细胞用于体内回输治

14、疗。培养的过程中观测A、B两组CIK细胞的增殖速度、培养前后细胞表型变化和细胞周期的分布情况及培养第15天A、B两组CIK细胞对K562的杀瘤效应。1.4 CIK表型鉴定及细胞周期测定调节CIK浓度为5×105. ml10-1，加入5ml 的PE-或FITC-标记的CD3、CD4、CD8、CD56、CD80和CD86单克隆抗体(均购自美国Peprotech公司),4避光染色，固定后采用流式细胞仪进行免疫表型鉴定；应用PI染色后,采用流式细胞仪进行细胞周期测定。1.5 CIK杀瘤毒性检测采用MTT法，详细步骤如下：按效靶比为20：1及50：1的比例，取培养第15天的效应细胞即CIK 细

15、胞1×105.100ml-1与靶细胞K562细胞2×103.100ml-1或5×103.100ml-1混合加入96孔板中，每组样品设3个复孔；将培养板置饱和湿度、37°C、5%CO2孵箱内培养20h，每孔加入MTT (5mg.ml-1) 20ml，继续培养4h，而后离心，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO )150ml，振荡5min，待沉淀物完全溶解后用酶联免疫检测仪（波长490nm）测吸光度A值，计算杀伤率。公式如下：杀伤率（%） A(靶) +A(效)- A(效+靶) /A(靶)´100%2 结果2.1 CIK的增殖研究发现50ml外周血可

16、分离获得××8的，CIK在培养的第35天开始增殖，第712天快速增殖；A培养法可使CIK细胞的扩增倍数在第15天时达170.4±77.6倍，最高达243倍；B培养法可使CIK 的扩增倍数在第15天时达400.9±309.1倍，最高达840倍，B组的增殖倍数远大于A组，经统计学比较，两组差异显著P0.01。表1示经A、B两种培养方法培养的第15天10例患者CIK增殖倍数比较。图1示两种培养方法CIK增殖曲线。Table1. Proliferation of CIK cells cultured in both groups by day 15. (n=10

17、)patient group A(fold) group B*(fold)1 243 8402 125 2653 74 1284 185 650 5 200 3356 165 3807 85 1408 170 4509 112 32010 95 200*P0.01 VS group A.Figure1. Expansion of CIK cells only from 25cm3 PB cultured by two methods2.2培养前后表型分析表型分析发现、两种培养方式培养前后中CD3-CD56+细胞比例明显降低，CD80+CD86+细胞的比例明显增加，细胞比例明显增加，P0.01；

18、细胞的比例明显减低；双阳性细胞的百分比大幅度上升至5左右，绝对数量增长在A培养法中最高 达2 000倍左右，B培养法中最高达10 000倍左右； A、B两种培养方式培养所获的各亚型所占比例无显著差异，P0.05（见图2）。Figure2. Phenotype of CIK cells before and after cultured on day 15 in both groups.2.3 培养前后细胞周期分析培养前后细胞周期分析发现A、B两种培养方法培养所获CIK细胞中处于S期细胞比率高达15%左右，S期及G2-M期的细胞比例较培养前明显增多，G0-G1期细胞所占比例较培养前明显减少，P0

19、.01；B培养法所得CIK细胞中处于S期及G2-M期细胞比例略高于A培养法中的，但无明显统计学差异，P0.05(见图3)。Figure3. Cell cycle of CIK cells before and after cultured on day 15 in both groups.2.4 杀瘤活性培养的第15天应用MTT法检测、两种培养法培养的对白血病细胞株K562杀伤活性，效靶比20：1时杀伤活性分别为（61.2±3.0）%、（75.5±5.5）%；50：1时杀伤活性分别为（70.5±4.6）%、（84.5±6.5）%；B培养法所获CI K对白

20、血病细胞株K562的杀伤率稍高于A培养法，但无明显统计学差异，P0.05（见图4）。Figure4. Cytotoxic activity of CIK cells on K562 cells3 讨论CIK是1991年由美国斯坦福大学医学院在CD3AK基础上制备的一类新的杀瘤细胞,是人PBMC在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞，具有增殖快、杀瘤活性强、杀瘤谱广的特点1。临床上制备CIK主要用于手术、放化疗后肿瘤微小残留病灶的清除，自体造血干细胞移植时骨髓的净化，不宜手术且对化疗和放疗不敏感或禁忌的肿瘤患者6,7,8,9,10,11,12。 目前国内外文献报道的CIK疗法均用血液细胞分

21、离机采集患者PBMC或一次性采血200ml以上分离PBMC进行CIK培养，当细胞数达到5×109以上进行回输5,6,7,9,10,11,12。这些方法使患者治疗成本增加，失血量增多。如何从少量的外周血制备足够数量的CIK以满足临床治疗需要？其关键是如何使CIK能够在体外大规模扩增。本研究应用A、B两种不同的方法培养CIK的结果分析表明：CIK在应用IFN-联合OKT3 、IL-2、PHA行常规培养的基础上，于培养的第二天加用IL-4、GM-CSF可使其扩增倍数显著提高，培养2周后 CIK增殖倍数最高达840倍，细胞总数高达1010以上； CD3+CD56+细胞均显著高于培养前，双阳性

22、细胞的百分比大幅度上升至5 左右，绝对数量增长最高达10 000倍左右；对白血病细胞株K562杀瘤活性较强，CIK细胞得率均在5×109以上，从而使得一次性采血50 ml制备的CIK足够临床回输治疗需要。PHA又名植物血凝集素，能激活小淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而分裂增殖，释放淋巴因子，并能提高巨噬细胞的吞噬功能；IL-2为为T细胞生长因子；OKT3是多克隆T细胞丝裂原，它可以触发T细胞活化，激活几乎所有的细胞毒活性细胞，使得CD3+CD8+ T及CD3+ CD56+T细胞呈优势生长，并可促进T细胞产生TNF、IFN-和IL-2等细胞因子，从而增强细胞免疫13。因而应用上述细胞因子

23、培养2周后，CIK细胞中处于S期即DNA合成期的细胞比例明显提高，约占15%；培养后CD3+ CD4+ T细胞的比例明显下降，而CD3+CD8+ T细胞及CD3+ CD56+T细胞比例明显升高；CD3-CD56+T细胞即NK细胞，因其细胞表面缺乏CD3分子的表达，其只在IL-2作用扩增，故扩增效果不如CD3+细胞，因而培养后比例明显下降。CD80+、CD86+细胞比例增加可能是在上述细胞因子如IFN-及IL-2等作用下促进它们在CIK细胞表面表达，从而作为T细胞免疫的第二信号参与抗肿瘤免疫。 GM-CSF是一类重要的造血调控因子，对多种类型免疫效应细胞具有生物学效应；已知IL-4/GM-CSF

24、联合应用是诱导产生大量功能性DC的有效方法14，DC对CIK的增殖具有协同作用,它能增强CIK的杀瘤效应15，本研究发现的IL-4、GM-CSF对CIK增殖的影响是否是通过DC途径仍有待进一步研究。参考文献:1 Schmidt-Wolf IG, Lefterova P, Mehta BA, et al. Phenotypic characterization and identification of effector cells involved in tumor cell recognition of cytokine-induced killer cellsJ. Exp Hematol,

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26、 cytotoxicity against pediatric cancer cells J. Int J Hematol. 2003; 77(2):175-174 Tong CR, Hong B, Qiu JY, et al. Significance of cytogenetic and fluorescence in situ hybridization analysis in evaluating antichronic myeloid leukemia efficacy of different immune effector cells J. Cancer Genet Cytoge

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