端粒酶—肿瘤治疗研究新方向——周冰峰、龙妮娅

1、贵阳医学院医学生物技术专业酶工程论文（2010级） 题 目 端粒酶肿瘤治疗研究新方向 班 级 医学生物技术专业2010级 学生姓名 周冰峰 龙妮娅 完成日期 2013 年 11 月 18 日 端粒酶肿瘤治疗研究新方向周冰峰 龙妮娅摘要：端粒（telomere）是存在于真核细胞染色体末端的一段富含GC串联重复序列的结构；端粒酶（telomerase）是一种由蛋白质和RNA构成的核糖核蛋白体，为RNA依赖的DNA聚合酶，也即逆转录酶，可以催化端粒DNA的合成。正常人体细胞的端粒酶活性检测呈阴性，而在85%以上恶性肿瘤患者的肿瘤细胞中端粒酶是高度活跃的，呈现阳性，也即在端粒酶作用下，肿瘤细胞染色体端

2、粒不会随细胞分裂而缩短，因此，端粒酶活性是诊断多数恶性肿瘤、判断愈后的良好指标，我们可以运用端粒酶作为治疗肿瘤的靶点，为肿瘤治疗提供一个新的研究方向。关键词：端粒 端粒酶 细胞 肿瘤治疗1、 端粒和端粒酶的发现 （一）端粒早在20世纪30年代，诺贝尔奖得主Hermnn Muller和Barbara Mcclintock 已经观测到染色体的末端结构在避免染色体之间的融合起到重要的作用，从而猜测它可能有保护染色体的作用1,2，之后，在20世纪70年代初对DNA聚合酶特性的深入研究引申出染色体并没有随着复制后RNA引物的降解而缩短，其自然末端也没有相互融合，这就暗示了有一个特殊的结构在保护染色体复制

3、过程中免遭融合、缩短，由此，人们把染色体末端这一特殊结构定义为端粒（telomere）3。 （二）端粒酶真核生物DNA的复制只能沿着5一3方向进行，并需要有互补单链作模板，还要求有一定长度的RNA作为引物。随着引物的切除，随从链5末端总有一段相当于RNA引物长度的DNA不能完整复制下来，这必然导致染色体DNA随着每一次的细胞分裂其端区不断缩短，这就是Warson于1972年提出的“末端复制问题(end replication problem)”4。但Larson和Spangler等在对对数生长期的四膜虫的研究中却发现其端区不见缩短，甚至还有所延长。针对这一矛盾，Blackburn和Greide

4、r等5认为四膜虫端区的延长不可能是DNA聚合酶作用的结果，而是另有原因。后来他们在四膜虫的细胞提取液中发现了一种酶活性成分，能往端粒区添加重复序列TTGGGG，当时称之为末端转移酶，这就是现在所称的端粒酶(telomerase)。2、 端粒酶的结构和作用机制 （一）端粒酶的结构端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白酶复合体，具有逆转录酶活性能够以自身的RNA为模板合成端粒DNA。端粒酶结构主要包括3部分：端粒酶RNA( telomerase RNA，TR)；端粒酶催化亚单位(telomerase catalytic subunit，TERT)和端粒酶相关蛋白质1(telomerase associate

5、dprotein 1，TPlTLPl)；另外，还有hSP90(heat shock protein 90)，p23和dyskerin等6。这其中最关键的结构就是TR和TERT。人端粒酶RNA（hTR）主要负责指导端粒重复序列的合成，hTR的结构改变或成分的丢失均会影响端粒酶的活性。其次，端粒酶催化亚单位（hTERT）是一个包含1132个氨基酸残基的多态链，它具有逆转录酶的共同结构，也即7个蛋白质域以及端粒酶催化亚基独特的T框架保守区域，其编码基因位于染色体5p上；hTERT是端粒酶起作用的关键结构和主要调控亚单位，它可以通过逆转录hTR模板序列，合成端粒DNA重复序列并且添加到染色体末端，从而

6、延长端粒长度。（2） 端粒酶的作用机制 端粒酶的活性调控，包括 mRNA 剪接与成熟，hTERT 和 hTR 基因转录，不同组分之间的定位和移位，转录后修饰，具有活性的端粒酶组合，端粒酶结合到端粒产生延长作用等多个水平进行。伴随端粒酶活性的增加，hTERT-mRNA表达水平也相对应成一定比例增加，并且在癌细胞和正常组织中的表达有很大的不同，据此可认定，调控人类端粒酶活性的主要亚单位是 hTERT，只要 hTERT 表达，其他亚单位就会与其共同构成高活性的端粒酶全酶7。因此，端粒酶的核心作用是延长端粒，从而维持端粒在复制分裂中保持一定长度，为细胞具有不断复制提供遗传基础。 TR和TERT是端粒酶

7、发挥作用的核心组分，分别提供模板和逆转录酶合成端粒DNA。癌细胞中端粒酶的激活及活性的维持可能是多种因素在多个水平对不同分子靶作用的结果。正常组织广泛表达hTR和hTP1，而hTERT的表达被抑制，大多数端粒酶阳性的肿瘤和永生化细胞系中均表达hTERT；此外，在端粒酶阴性细 胞中导入hTERT即可检测到端粒酶活性，这就说明hTERT的表达与端粒酶活性是平行的，hTERT的激活对肿瘤细胞中端粒酶活性的激活是“必须的和足够的”8。所以在端粒酶的激活过程中hTERT基因在细胞中的表达是决定端粒酶活性的关键9。3、 端粒酶活性的检测技术端粒酶的常用检测方法有三种：（1） 端粒重复序列扩增法(telom

8、ere repeat amplification protocol，TRAP)它是端粒酶活性检测的基本方法10，在此基础上又衍生出许多更加简便灵活的检测方法，比如TRAP-PAGE、TRAPELISA等；但是对于端粒酶的活性检测的灵敏度都会因为取样的位置不同而有所差异，总体来说， 使用TRAP检测体液样本的端粒酶活性，从提取、扩增至读取结果，用时23 h，仅包含离心、加样等基本的分子生物学检测技术操作，并且可以参考试剂盒的标准对阳性及阴性结果进行简单、及时的判读，是一种快速、简便、灵敏的端粒酶活性检测方法。（2） RT-PCR法检测hTERT的表达（3） 用32P标记的端粒（CCCTAA）探针

9、或用Hinf1和Ras1酶解的基因组DNA杂交，检测端粒的长度 四、端粒酶在肿瘤治疗方面的应用正常细胞中的端粒酶活性检测是呈现阴性的，而85%以上恶性肿瘤细胞中的端粒酶活性是高度表达的11，这就说明，肿瘤细胞的端粒酶活性因为某些原因被激活，使端粒不断维持在一定的长度，细胞因此逃过正常的衰亡而成为无限增殖的细胞；端粒酶活性与恶性肿瘤之间的密切关系，为肿瘤的诊断提供了有效的标志物12。因此，端粒酶是正常细胞转变为肿瘤细胞的关键性物质，是抗肿瘤治疗的重要靶点。而且，正常细胞与肿瘤细胞中端粒酶的表达、端粒的长度和细胞动力学的差异，使得选择端粒酶作为药物靶标成为相对安全有效的治疗手段13。由于端粒酶活性

10、是通过TERT基因的转录机制来严格调控的。通过克隆TERT基因启动子结构区域，研究者发现TERT基因启动子是高GC富含区，缺少TATA盒和CAAT盒。TERT基因核心启动子上存在一些潜在的转录因子结合区，如E.box (CACGTG)、SPl、CEsts等。这些结构特征使得TERT基因启动子具有高肿瘤靶向性及较强的启动活性，从而成为肿瘤靶向基因治疗中具有巨大潜力的启动子14。 近年来，针对端粒酶为作用靶点的抗肿瘤研究非常活跃，其研究目标就是寻找各种有效的途径来抑制肿瘤细胞的端粒酶活性，目前主要的途径有以下几种15： （一）阻断端粒酶RNA的模板作用，包括：反义hTR、反义寡核苷酸、锤头状核酶和

11、肽苷酸等；我们以反义寡核苷酸为例，讲述肿瘤治疗中以反义寡核苷酸为靶点的应用；研究发现，针对人端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）11个碱基区域的治疗可以直接抑制端粒酶的活性，因此是寡核苷酸治疗的理想靶点。不论端粒酶全酶的结构如何，hTR的模板区域一定会连接到端粒的重复结构，因此就会出现靶寡核苷酸的暴露，这为寡核苷酸介导的治疗提供了理论基础16。有报道称以hTR为靶点的反义寡核苷酸可降低胃癌细胞系SW480（人结肠癌细胞株）的活性，并同时诱导其凋亡17。 （二）针对端粒酶催化亚基的抑制剂：反义hTERT抑制剂、端粒酶蛋白抗体、PKC调节剂等；目前，对于端粒酶催化亚基的

12、抑制剂，国内外研究的比较深入的是反义h TERT抑制剂，其抑制肿瘤的机制是：针对端粒酶RNA组分中含有与端粒DNA序列互补的碱基模板序列设计的反义核苷酸，它具有阻断其模板的作用，从而抑制DNA端粒酶合成端粒DNA序列。因此，反义hTERT抑制剂可以抑制肿瘤细胞的端粒酶活性并导致细胞死亡。已经有实验证明，用反义hTERT转染人Hela细胞，发现端粒DNA逐渐丢失，经2326个分裂周期后细胞就开始死亡18。这一实例就证明了用端粒酶作为靶点去设计端粒酶抑制剂是肿瘤治疗的一个极具前景的新方向。5、 结语2009年的三位诺贝尔奖得主为我们揭示了端粒保护染色体的一系列机制，以及端粒与细胞癌变、衰老之间的密

13、切关系，也为后来的研究者提供了一个崭新的研究端粒酶治疗肿瘤方面的思路和研究路线，使我们从染色体的层次深刻的认识了肿瘤细胞，并且结合端粒酶在肿瘤细胞中的高表达特性，为肿瘤的诊断、端粒酶靶向抗肿瘤药物的研制提供了更高效、专一的位点；尽管越来越多的端粒酶研究都取得很好的结果，但是仍然有一些问题需要我们去解决：第一，并不是所有的肿瘤患者和肿瘤类型都能检测到端粒酶的活性，因此，这些细胞可能会对端粒酶靶向的治疗方法不敏感。第二，当端粒酶活性被抑制后，端粒的长度需要一段时间缩短至一定程度时才能引起细胞凋亡。因此，从药物治疗开始到产生一定的治疗作用会有一段时间的滞后期。第三，肿瘤细胞常常会启动其它补偿机制而逃

14、脱治疗的压力，在以端粒酶为靶向的治疗中刺激与端粒酶功能相似的其它基因的表达。这些都是需要我们去应用生物技术解决的问题，但是，相信总有一天，人类会利用端粒酶研究更多的端粒酶抑制药物，从根本上克服肿瘤。 参考文献1杨品红，王志陶，王志勇.端粒和端粒酶的发现及应用.生物技术通报, 2010 (8):46-5123钟天映,陈媛媛,毕利军.端粒与端粒酶的研究解读2009年诺贝尔生理学或医学奖.生物化学与生物物理进展,2009, 36(10): 1233-12384WATSON J DOrigin of concatemerie T7 DNAJ.Nat NewBioI, 1972, 239(94):197

15、-2015GREIDER C W,BLACKBURN E HIdentification of a specific telomere terminal transferase activity in TetrahymenaextractsJ.Cell,1985,43(2 Pt 1)：405-4136孔令平,汪华侨.端粒和端粒酶与衰老、癌症的潜在关系2009年诺贝尔生理学或医学奖简介.自然杂志,2009,31(6):327-3317朱军,丁建强,冯云.端粒、端粒酶研究及应用进展.中国医药科学,2012,02 (7): 59-628卫立辛,吴孟超.端粒酶:肿瘤治疗研究的新希望.中国肿瘤生物治疗杂

16、志,20 06,13(5):325-3289王峰,刁勇,许瑞安.人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子在肿瘤基因治疗中的应用.中国生化药物杂志,2012,33(5):687-68910刘岩,徐美林,王菁,吴秉铨,钟镐镐,方伟岗.端粒酶活性和免疫细胞化学在肿瘤细胞学诊断中的应用.中华病理学杂志,2012,41(3):181-18511黄志伟,隋英丽.反义端粒酶RNA抑制肿瘤细胞的研究进展.中国现代普通外科进展, 2012,15(12):978-97912von Figura G,Hartmann D,Song Z,et al.Role of telomere dysfunction in aging and its detection by biomarkers.J Mol Med,2009-08-08Epub ahead of print13钟天映,陈媛媛,毕利军.端粒与端粒酶的研究解读2009年诺贝尔生理学或医学奖.生物化学与生物物理进展,2009, 36(10): 1233-123814王峰,刁勇,许瑞安.人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子在肿瘤基因治疗中的应用.中国生化药物杂