植物总DNA的提取

1、实验1植物总DNA的提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。实验目的学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。实验原理植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采

2、用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高

3、峰在260nm。纯的DNA样品A260/2801.8，纯的RNA样品A260/2802.0，并且1g/ml DNA溶液A260=0.020。实验器材1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料实验试剂1、3×CTAB buffer（pH8.0）100mM Tris 25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% -巯基乙醇2、TE缓冲液（pH8.0）10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA

4、 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95乙醇5、液氮 实验步骤1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。4、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中，在4下8000rpm离心10min。6、离心管中出现3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。（根据需要，上清

5、液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。）7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。8、小心取下这些纤维状沉淀，加12 mL 70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。9、将粗制品溶于TE缓冲液。10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。注意事项1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。思考题1、 CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？2、 液氮研磨的原理是什么？实验2 质粒DNA的提取和酶切质粒

6、DNA是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。质粒是细菌独立于染色体外的遗传物质，是环状的双链DNA分子。由于质粒比较小，并且能进行独立的自我复制，常常被改造为克隆和表达的载体分子。限制性内切酶（Restriction enzyme，RE）是在细菌内发现的细菌降解外来DNA的保护机制。由于限制性内切酶通过识别特定的核酸双链序列并在特定的位点切断磷酸二酯键。不同的限制性内切酶识别的序列不同。实验目的通过本实验掌握碱裂解法提取质粒和限制性内切酶酶切的基本原理，掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。实验原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介

7、于12.012.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。限制性内切酶通过识别特定的DNA序列并在特定序列的特定位点打开磷酸酯键。实验器材1、恒温培养箱2、恒温摇床3、 台

8、式离心机4、 高压灭菌锅5、 Tip头、Eppendorg管6、 含有目的质粒的E.coli菌株实验试剂1、 溶液I50mmol/L 葡萄糖5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）2、 溶液II0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等体积混合3、溶液III5mol/L乙酸钾 60mL冰乙酸 11.5mL水 28.5mL4、 TE缓冲液10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA(pH8.0)5、 70%乙醇（放-20冰箱中，用后即放回）6、 EcoRI 及其缓冲液7、

9、HindIII及其缓冲液实验步骤1、 将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中，37振荡培养过夜。2、 取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。4、 将细菌沉淀悬浮于100L冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。5、 加200L溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。6、 加入150L溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。7、 12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。8、 向上清液加入等体积的饱和酚

10、，混匀。9、 12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。10、向上清液加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置510min。12000r/min离心5min。倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。11、1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。12、20L TE缓冲液，使DNA完全溶解，-20保存。13、取4L所提取的质粒DNA，加入1L酶切缓冲液，EcoRI或HindIII 1L，用超纯水补至总体积10L。37保温2h以上。14、酶切样品待琼脂糖电泳检测。注意事项操作时，避免剧烈震荡。思考题1、实验操

11、作中，饱和酚的作用是什么？2、SDS和NaOH的作用是什么？参考文献精编分子生物学实验指南（第四版） 美 F M奥斯伯，R E 金斯顿等主编 科学出版社2005图 pBluescriptII SK质粒载体实验3 PCR基因扩增PCR技术是在1985年由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明的聚合酶链反应。这一技术具有划时代意义的。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。实验目的学习和掌握PCR反应的基本原理与实验技术。实验原理多聚酶链式

12、反应（polymerase chain reaction , PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。1、 变性：加热使模板DNA在高温下（94）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2、 退火：使溶液温度降至5060，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。3、 延伸：溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按53方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高

13、温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。实验器材1、 PCR热循环仪2、 tip头、冰盒3、 PCR管4、 超纯水5、 DNA相对分子质量标准物6、 移液枪实验试剂1、10×缓冲液500mmol/l KCl100mmol/l TrisHCl(pH8.3 ,室温)15mmol/lMgCl20.1% 明胶2、4×dNTP1

14、mmol/l dATP1mmol/l dCTP1mmol/l dGTP1mmol/l dTTP3、Taq酶 5U/L4、DNA模板 1ng/L5、引物1 、引物2 引物溶液浓度10pmol/l实验步骤1、在PCR管内配制20L反应体系：反应物体积/L10×buffer2.0dNTP1.0引物11.0引物21.0Taq酶0.5Template1ddH2O13.5总体积 202、按下列程序进行扩增：、95预变性5min、95变性1min、55退火1min、72延伸1min、重复步骤30次；、72延伸10min3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配制0.7%琼脂糖凝胶，取10L扩增产物电泳。保

15、持电流40mA。电泳结束后，紫外灯下观察结果。注意事项1、PCR加样时，尽量保持低温操作，避免酶失活和模板、引物降解。3、 取样时注意不要污染药品。思考题1、什么是引物二聚体？出现引物二聚体的原因是什么？ 2、PCR仪的热盖设置有什么优点？参考文献1、PCR技术操作和应用指南 主编 林万明 人民军医出版社 1995年2、PCR技术实验指南美C.W.迪芬巴赫 G.S.德维克斯勒科学出版社 2003年实验4 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是 D-半乳糖-3,6-L 半乳糖。许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网

16、孔型凝胶。该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在pH4.0-9.0 的缓冲液中稳定。由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于0.05时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如DNA分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。实验目的学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术和原理，以及溴化乙锭染色检测核酸的实验技术。实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同

17、数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA,简称cccDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂（open circular

18、 DNA ,简称OCDNA），线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linear DNA, 简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。溴化乙锭可以嵌入核酸分子，并且在紫外灯下产生荧光，可用于检测核酸物质。实验器材1、琼脂糖凝胶电泳系统2、凝胶成像系统3、DNA marker4、 检测样品5、 琼脂糖实验试剂1、5×TBE（5倍体积的TBE贮存液）配1000ml 5×TBE：Tris 54g硼酸27.5g0.5mol/l EDTA

19、20ml（pH 8.0）2、凝胶加样缓冲液（6×）溴酚蓝 0.25%蔗糖 40%3、溴化乙锭溶液（EB） 0.5g/ml 实验步骤（一）制备琼脂糖凝胶1、按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb0.3 5600.6 1200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.132、称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml 0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。（二）胶板的制备1、 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两

20、端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。2、 有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。3、 将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。4、 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。5、 加入电泳缓冲液至电泳槽中，让缓冲液盖过凝胶。（三）加样用移液枪将将上样缓冲液与DNA样品按1:5比例混合，加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。（四）电泳1、接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。2、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。3

21、、将凝胶小心放入溴化乙锭溶液中，染色30min。 4、将染色后的凝胶放入凝胶成像仪中拍照。注意事项因为EB是强致癌物质，因此染色操作中应注意安全不要接触，并且保持环境的洁净。参考文献精编分子生物学实验指南（第四版） 美 F M奥斯伯，R E 金斯顿等主编 科学出版社2005实验5 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验目的1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。2.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，用于分离蛋白质。实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳形式。单体-丙烯酰胺和交联剂-甲叉双丙烯酰胺相互作用可形成聚丙烯酰胺，该聚合反应以TEMED作为催化剂，以APS 作为引发剂。丙烯酰胺和甲叉

22、双丙烯酰胺的比例可决定凝胶网孔的大小，交联剂所占比重越大，凝胶的网孔就越小。C=ONH2C=ONHCH2C=ONHCH2=CH+APTEMEDNHCH2C=ONHCH2CHC=ONH2CH2CHC=ONH2CH2CHC=ONH2CH2CHC=ONH2丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2=CHCH2=CH CH2 CHC=OCH2CH利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离主要依据以下两个因素： 蛋白质所带静电荷：在不同的pH条件下蛋白质所带电荷不同。在一定的电场条件下蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向移动，移动速率取决于蛋白质表面电荷的数量，电压越强或电荷越多则蛋白质移动的越远。其次，蛋白质的

23、形状和大小：蛋白质在电泳中所受的阻力主要取决于样品的大小与凝胶网孔大小之间的关系。蛋白质分子越小或凝胶网孔越大，所分离样品所受阻力就愈小，则在电场中的迁移率就越大。在非变性电泳中，天然蛋白质的分离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素共同影响，作用的结果。电压 x 样品静电荷迁移率 =  摩擦力浓缩效应可显著提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率，该效应可通过引入浓缩胶和不连续缓冲溶液系统而获得。浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶。它是由较低浓度的丙烯酰胺构成，当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网孔大，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分

24、离胶之间。 另外，浓缩胶还具有比分离胶更低的pH。浓缩胶内的缓冲溶液是Tris-HCl（pH 6.7）,该pH远低于Tris的pK值(8.1)。分离胶内的缓冲溶液是pH 8.9的Tris-HCl，而电泳正负两极的缓冲溶液均为pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲溶液。在浓缩胶中，小分子并带有大量负电荷的Cl-在凝胶中的移动速率较快，而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速率较慢。由于二者在同一电场中，具有相同的电流，由此形成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在Cl-的后面，带有负电荷的蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和Cl-之间向正极移动。当样品进入pH 8.9的分离胶时，甘氨酸的解离度增加，在电场中的迁

25、移率高于样品，蛋白质不再夹于两种离子之间向正极移动，这时的蛋白质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离。样品缓冲溶液 Tris/HCl pH 6.7Tris/甘氨酸 pH 8.9-+Tris/甘氨酸 pH 8.9分离胶 Tris/HCl pH 8.9浓缩胶 Tris/HCl pH 6.7实验材料1. 实验器材Bio-Rad公司Mini-Protean型电泳仪；电源（电压200V，电流500mA）；100沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50l或100l）；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。2. 实验试剂试剂号配方pH1分离胶缓冲溶液 1mol/L HCl 48.0 ml 三羟甲基氨基甲烷 36.

26、3 g 加蒸馏水到100ml8.92单体交联剂 丙烯酰胺 （Acr） 30g 甲叉丙烯酰胺（Bis） 0.8g加蒸馏水到100ml3过硫酸铵 100mg/ml4四甲基乙二胺（TEMED）5浓缩胶缓冲溶液 1mol/L HCl 48ml 三羟甲基氨基甲烷5.89 g 加蒸馏水到100ml6.76电极缓冲溶液 甘氨酸 28.8g三羟甲基氨基甲烷6.0 g 加蒸馏水到1000ml, 用前稀释10倍8.37染色液 CBB G-250 0.1g 溶于95%乙醇后，加蒸馏水到100ml8示踪染料 溴酚蓝 0.05g溶于100ml 蒸馏水9样品：蛇毒干粉200mg溶于20ml, pH6.7缓冲溶液（5）中，

27、再加入25%蔗糖20ml和溴酚蓝（8）10ml凝胶溶液的配方试剂分离胶（ml）浓缩胶(ml)125蒸馏水341.252.5-6.1950.050.005-1.01.257.640.100.005总体积（ml）1010Aa浓度（g%）7.53.0实验操作1.凝胶柱的制备 取l0cm×0.6cm的玻璃管，选择较平整的一端为底端，量取7.5cm、8cm两处，画线；底端管口用小块胶布封口，插入橡皮垫中，垂直放置于试管架中。用巴斯德滴管吸取分离胶，缓慢贴壁加胶到管内7.5cm处，立即加蒸馏水至8cm处。待分离胶凝固后，将胶面上的水分甩掉，残留的水分用滤纸条吸干，用滴管速加浓缩胶到分离胶面上至8

28、cm处，再小心地加一层覆盖水。2.安装电泳槽选择无气泡、无裂缝、长度合适的小玻璃管，撕掉胶布，安装到电泳仪上，注意要紧密，以防止上槽缓冲溶液漏液；向下槽注入电极缓冲液，注意用弯头滴管除去玻璃管下端的气泡；再向上槽倒入电极缓冲液淹没小管，同样用滴管除去气泡。 3.加样用微量注射器取样品液30l，沿壁加在浓缩胶面上，注入时要慢，避免激起电极缓冲液。4.电泳连接电极，上槽与负极相连，下槽与正极相连；调节电流为lmA管，待示踪染料进入分离胶时调节电流为2mA管，待示踪染料接近凝胶管底部约0.5cm处，切断电源，电泳时间为2小时3小时。5.剥胶取下凝胶管，用局麻针头注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶

29、柱-与管壁之间，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分开，然后用洗耳球轻轻在玻管的一端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于编号的试管内，用蒸馏水冲洗几次。6.染色将考马斯亮蓝染色剂倒入放有胶条的小试管中，没过胶条；60水浴保温40分钟50分钟后取出，用水冲洗2次3次，观察结果。实验结果观察凝胶条中的蛋白质与考马斯亮蓝染色剂结合后所形成的蓝色复合物，并通过画图记录结果。思考题聚丙烯酰胺凝胶电泳分离生物大分子的基本原理？ 样品液中加入蔗糖和溴酚蓝的目的是什么？实验6DNA重组实验目的用T4DNA连接酶将载体pBR322 EcoR -CIP处理的DNA片段，与目的基因5.4KbEcoR 片段连接起

30、来，构建体外重组DNA分子，同时学习几种DNA连接的方法。实验原理重组的DNA分子是在T4DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲液系统中，将上述二种酶切后的DNA分子进行连接。（一）DNA连接酶的作用步骤1T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶AMP复合物（腺苷酰酶）2酶AMP复合物再结合到具有5´-磷酸基和3´-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。3产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。（二）DNA的连接方式在T4DNA连接酶的作用下的DNA连接反应，一般是随机的，但也可以通过对载体、目的基因的处理以控制与调整DNA的有效连接。连接的方式有：1自连2两种片

31、段相连3三个片段以上的自连与互连（三）连接反应的条件1缓冲液：一般商品酶都带有10倍的缓冲液，有Mg2、ATP作为辅助因子，提供能量，同时也有些保护与稳定酶活性的物质，如DTT（二硫苏糖醇）以防止酶的活性基因氧化失活。BSA（小牛血清蛋白）维持一定的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低的酶变性失活。2温度：连接反应温度在37时有利于连接酶的活性，但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的，EcoR 酶所产生的末端，仅仅通过四个碱基对相结合，这不足以抵抗该温度下的分子热运动。因此在实际操作时，DNA分子粘性末端的连接反应，其温度是折中采取催化反应与末端粘合的温度，为1216。3时间：1216 121

32、6小时（过夜）；或78 23天。实验材料1pBR322 EcoR -CIP处理DNA片段。25.4Kb含有Str的EcoR 回收DNA片段。3T4DNA连接酶实验仪器仪器、器皿（见附录）试剂：10×T4DNA连接酶缓冲液 660mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 50 mmol/L MgCl2 50 mmol/L DDT 50 mmol/L ATP实验步骤1取3只Eppendorf管，一管做重组连接，一管做pBR322未经CIP处理的自连，另一管做pBR322经CIP处理的自连。2用微量进样器按下表分别取样各溶液于Eppendorf管中。DNA酶切反应物10×T4

33、连接缓冲液ddH2OT4DNA连接酶总体积pBR322 EcoR-CIP5l（100ng）5.4Kb EcoR 片段5l（约400ng）2l7l1l20lpBR322 EcoR-CIP3l（60ng）2l14l1l20lpBR322 EcoR3l（60ng）2l14l1l20l加样顺序为ddH2O，10×T4缓冲液，DNA片段，最后加T4DNA连接酶（放于冰浴中）连接酶取好后应立即放回20保存。3盖紧盖子用手指弹匀Eppendorf管，于台式离心机上转2秒钟，以集中样品。4将3管连接样品放入温度12恒温水浴锅中，过夜。5第二天上午各管取约25ng的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，观察

34、连接反应效果，电泳时要加入pBR322 EcoR酶切片段作电泳对照。思考题1连接反应为何选择在低温下长时间连接？实验7大肠杆菌感受态细胞的制备及转化在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。实验目的学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感

35、受态细胞的实验技术及热激转化的实验技术。实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。实验器材1、超净工作台2、低温离心机3、恒温摇床4、恒温箱5、恒温水浴器6、 Eppendorf管、Tip头7、 转化的目

36、的质粒8、 大肠杆菌菌株DH59、 试管、培养皿、锥形瓶实验试剂1、1mol/l CaCl2溶液（高压灭菌）2、LB液体培养基配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：胰蛋白胨（bacto-typtone）10g酵母提取液（bacto-yeast extract）5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121湿热灭菌20 min。 3、LB固体培养基1000ml加15g琼脂。4、氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20冰箱保存。实验步骤1、从大肠杆菌DH5平板上挑取一个单菌落接于2mL LB液体培养基的

37、试管中，37振荡培养过夜。2、取0.5ml菌液转接到一个含有50ml LB液体培养基锥形瓶中，37振荡培养23 h。（此时，OD6000.40.5，细胞数务必<108/ml，此为实验成功的关键）。3、吸菌液1ml加入Eppendorf 管，10,000rpm离心15sec回收细胞。4、用冰预冷的0.1mol/l CaCl2 500L悬浮沉淀。5、再离心15 sec（10000rpm），回收细胞。6、 再用冰预冷的0.1mol/l CaCl2 60L重悬沉淀。7、 在-4下可保存2周（24 d时，转化效率最高）。此细胞为感受态细胞。 8、同时做两个对照管：受体菌对照：60L 感受态细胞 +

38、 2L 无菌水质粒对照：60L 0.1mol/L CaCl2溶液 + 2L 质粒DNA溶液 9、将管放到42循环水浴12min。 10、冰浴2min。 11、每管加800L LB液体培养基，37培养1 h（慢摇）。12、将适当体积（200L）已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。13、.倒置平皿37培养1216 h，观察细菌生长情况。注意事项1、超净上无菌操作注意安全。2、实验过程中尽量避免杂菌污染。思考题1、 CaCl2制备感受态的可能原因是什么？2、 如果平板培养后出现卫星斑的可能原因是什么？3、 如何提高转化的效率？参考文献精编分子生物学实验指南（第四版） 美 F M奥斯伯，

39、R E 金斯顿等主编 科学出版社2005实验8细菌总RNA提取实验目的了解RNA的特性，掌握Trizol法提取RNA的原理及操作技术。实验原理RNA分子是化学性质非常活跃的分子。在提取细胞内RNA在的过程中，RNA分子容易受细胞内核酸酶、化学试剂、机械震荡等多种因素影响而发生分子结构的破坏，导致提取失败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出核酸酶活性。Trizol适用于从多种组织和细胞中快速分离总的RNA。溶液与试剂1、Trizol试剂2、氯仿3、异戊醇 4、无水乙醇，4保存5、70%乙醇，4保存6、超纯水7、2DEPC(二乙基焦碳酸酯)

40、操作步骤材料准备 E.coli细胞过夜活化，第二天按10%转接新培养基继续培养4h。1、离心收集细胞样品经无菌水清洗后，用液氮速冻，将组织磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时,将粉末转移到Eppendorf管中。每100mg组织加入1.0ml的Trizol.细胞样品:用常规方法收集细胞,按照106-107个细胞，加入1mlTrizol.。注意：如果者细胞数很少(102-104)，在样品中加入800ul的Trizol。剧烈振荡或用匀浆器匀浆。2、加入200ul氯仿/异戊醇(24:1)或氯仿，剧烈振荡混匀30秒。3、12000转/分，4，离心10分钟。4、将上清液小心转移到RNase-free 1.5ml

41、离心管中，加入与上清等体积的异丙醇,-20置30分钟。注意：不要吸取任何中间层物质,否则会出现Genomic DNA 污染。5、12000转/分，4，离心5分钟。6、小心移去上清液，防止沉淀丢失。7、用70%酒精洗涤两次，每次700u，12000转/分,4离心5分钟。8、尽可能彻底的吸走上清，防止丢失RNA沉淀。9、真空离心干燥3-5分钟或者放在室温下将酒精空干。10、沉淀用30-50ul的DEPC水融解，检测，-70保存。结果采用电泳技术或光谱技术检测RNA的浓度、纯度情况。注意事项全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作

42、习惯预防微生物污染。实验9 探针制备实验目的通过本实验掌握地高辛标记探针的制备方法。实验原理探针实际是已知的基因片段，应该该片段与待测样品杂交，如果靶基因和探针的核苷酸序列互补，就可以根据碱基配对的原则进行核酸分子杂交，从而达到检测的目的。地高辛标记探针利用偶联抗体或抗生物素蛋白的磷酸酯酶检测经修饰的碱基，用氮蓝四唑（Nitro blue tetrazolium, NBT）显色，氮蓝四唑转变为不溶于水的有色物质，沉淀在杂交的原位。采用随机引物法筛标记反应液，以随机合成的六聚体核苷酸（ hexanucleotiide ）为引物， dATP 、 dCTP 、 dGTP 、 dTTP 和 DIG&#

43、173;11­dUTP 为合成底物，单链DNA为模板，在 Klenow 酶的作用下，合成渗入DIG的DNA 链。地高辛标记属高效标记反应，以 1 g DNA 探针为例， 1 h 反应可产生 0.8 g 标记探针，20 h可产生 2g 探针。同时，该标记方法操作简单，适用于含量10 ng -3 g，片段大小100 bp­10 kb，线性或高度卷曲 DNA 探针制备。仪器、材料与试剂（四） 仪器1 、 水浴锅2 、 离心机（二）材料1 、 探针核酸片段2 、 PCR 小管（三）试剂1 、 10mM EDTA2 、 DIG random labeling Mix （高效）实验步骤

44、1 、 用超纯水稀释1g DNA 至总体积16g 。2 、 DNA 热变性：将 DNA 置沸水中，水浴 10 min ，迅速插入冰中 3min 以上。3 、 加 4 l DIG random labeling Mix （高效），混匀后 2 000rpm 离心 5 min 。4 、 置 37 反应至少2 h ，反应时间越长,产量越高。5 、 加入2 l 0.2M EDTA 或65度10分钟终止反应。反应液可在­20 保存至少1年以上，可反复使用 。实验安排PCR 实验完成后，将产物纯化即可开始探针制备。实验10Southern 杂交实验目的通过本实验了解 Southern 杂交的原理，

45、学习 Southern 杂交的转膜和杂交技术操作的详细过程。实验原理Southern 杂交是一种在复杂背景基因中识别特异 DNA 序列的重要技术，是 Southern 在 1975 年首先发明的。基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可以按碱基互补配对的原则退火形成双链。杂交的双方是待测核酸和标记探针。杂交过程是高度特异的。将电泳分离的 DNA 片段在凝胶上经 N aOH 处理变性，用硝酸纤维素膜（ nitrocellulose filterMembrane,NC膜）放在凝胶上，使之按原有的顺序将条带转移到 NC 膜并固定。这就是 Southern 转膜过程。Southern

46、杂交是将膜上的DNA 与DIG标记的探针杂交，通过碱性磷酸酶显色检测结果。仪器、材料与试剂（一）仪器1 、 电泳槽2 、 电泳仪3 、 杂交炉或摇床（二）材料1 、 DIG 标记探针2 、 NC 膜（ 5 cm X 5cm ）（三）试剂1 、变性液：1.5M NaCl, 0.5M NaOH2 、 中和液： 3 M NaCl, 0.5M Tris­HCl, pH 7 . 43 、 转移液（ 20 × SSC ）： 3M NaCl, 0.3M Na3Citrat, pH 7.0（ 2 × SSC ）： 0 .3M NaCl, 0.03M Na3Citrat, pH 7

47、.04 、 Wash SolutionI ： 2 × SSC 、 0.1%SDS5 、 Wash SolutionII ： 0 .5 × SSC 、 0.1%SDS6 、 （预）杂交液： 5 × SSC, N­laurolysarcosine,0.02%(w/v), SDS,1%(w/v), Blocking reagent, 50% 甲 酰胺7 、 Anti­DIG­AP （碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体）8 、 BCIP/NBT 储备液9 、 冲洗液： 0.1MTris­HCl ， 0.15 MNaCl ， pH7.410 、封闭液： 0.1%Blocking reagent / 0.1MTris­HCl