注射用紫杉醇脂质体包封率有关物质含量测定检验方法学确认方案

1、注射用紫杉醇脂质体包封率、有关物质、含量测定检验方法学确认方案文件编号：VP-4F97MV-002012年10月南京绿叶思科药业有限公司Nanjing Luye Sike Pharmaceutical Co.,Ltd目 录1.概述12.目的13.范围14.风险评估15.计划确认时间16.确认人员及职责17.确认前准备28. 确认内容39. 可接受标准810. 偏差调查及异常情况811. 综合分析与结果评价812. 验证结论和监测建议813. 附件91. 概述现行的注射用紫杉醇脂质体质量标准为国家药品标准WS-718(X-529)-2002，为了确认包封率、有关物质、含量测定检验方法在本公司质管

2、部实验室条件下的适用性，特制定本确认方案。2. 目的确认注射用紫杉醇脂质体质量标准（国家药品标准WS-718(X-529)-2002）中包封率、有关物质、含量测定检验方法在本公司质管部实验室条件下的适用性。3. 范围本确认方案适用于注射用紫杉醇脂质体国家药品标准WS-718(X-529)-2002中包封率、有关物质及含量测定检验方法在本公司质管部实验室的方法学确认。4. 风险评估编号风险影响SPD风险等级确认活动1未按照方案执行。导致确认结果不可信。322高确认前对参与确认的人员进行培训。2未按照SOP执行操作。导致确认结果不可信。322高确认过程和结果由另一人进行复核。注：S: 严重性 P:

3、可能性 D:可检测性5. 计划确认时间确认实施时间计划为2012年10月26日至 2012年11月10日。 6. 确认人员及职责6.1 确认小组组长姓名部门职务责任王晟质管部检验员负责确认方案的起草，在方案批准后，对确认小组成员进行本方案的培训。负责确认方案的实施。确认过程中，如有偏差，及时报告并配合调查，保证按偏差处理程序进行调查和处理。确保报告的生成、审核和批准。6.2 确认小组成员姓名部门职务责 任毛圣淼质管部检验员在方案批准后，按确认方案实施，收集、整理数据，完成确认记录，对确认过程中出现的偏差及时报告并配合调查。待确认完成后，起草确认报告。7. 确认前准备7.1 确认相关文件（检查记

4、录见附表一：确认文件检查记录）7.1.1 方案建立的依据l 注射用紫杉醇脂质体质量标准（WS-718(X-529)-2002）l 中国药典（2010年版） 药品质量标准分析方法验证指导原则l 药品GMP指南（2011年版） 分析方法的验证和确认7.1.2 公司相关管理制度l 偏差管理规程（SMP-QA-024）l 验证程序管理规程（SMP-QA-032）l 验证文件管理规程（SMP-QA-030）7.1.3 确认必备的操作规程无。7.1.4 相关质量标准和检验规程及检验仪器的操作规程l Agilent1200 高效液相色谱仪操作维护保养规程（SOP-EM-521）l METTLER-TOLED

5、O XS105分析天平操作规程（SOP-EM-519）7.2 参与确认人员的培训确认开始前必须保证所有人员都经过相应的培训，并做好培训记录。（见附表二：人员培训记录）7.3 支持仪器/设备有效期确认确认开始前必须对确认中所需要的检测仪器/设备的有效期进行检查，保证所用检验仪器/设备在确认实施中是处于合格有效的，并做好检查记录。（见附表三：检验仪器的有效性记录）8. 确认内容8.1 试剂及仪器设备试剂列表试剂名称来源紫杉醇对照品自标（云南汉德）甲醇（色谱纯）Tedia Company,InC. USA注射用水制水三室分析仪器列表设备名称生产公司名称型号设备编号电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司X

6、S105002高效液相色谱仪美国安捷伦科技公司Agilent 1200014色谱柱汉邦科技4C18254F090109048.2 包封率检验方法学确认 检验方法色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇:水（3:1）为流动相，检测波长为227nm。理论板数按紫杉醇峰计算，应不低于1000。供试品溶液的制备：取本品1瓶，加5%葡萄糖注射液7.5ml,旋涡混匀10分钟,使成每1ml中含紫杉醇约为4mg的乳浊液。测定法：取用水充分溶胀后的葡聚糖凝胶(SephadexG-50，100-300µ)加入内径为0.7cm的层析柱中,使凝胶层高约为21cm，用水100ml分次加入柱中，使柱平衡

7、，精密吸取供试品溶液0.2ml,沿管壁加至凝胶层面上，用少量水冲洗层析柱壁，每次1ml，共两次，使样品进入凝胶柱，然后用细玻璃棒轻轻搅匀样品层（约1cm高）。用水洗脱，自洗脱液出现轻微浑浊，即开始定量收集洗脱液15ml，摇匀，精密量取2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即为测定被包封的紫杉醇含量ME的溶液。凝胶柱再用不同浓度的乙醇梯度洗脱（沿管壁缓缓依次加入33%乙醇3ml，66%乙醇3ml及无水乙醇），弃去洗脱液10ml，立即开始定量收集游离紫杉醇部分，共收集5ml，作为测定MF的溶液。照含量测定项下的色谱方法，取ME 和MF溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积

8、按下式计算包封率和回收率：包封率（%）=×100% 回收率（%）=式中：ME为被包封在脂质体中的紫杉醇的峰面积 MF为未被包封的游离紫杉醇的峰面积。 为总紫杉醇的峰面积。8.2.2 确认项目的确定根据药品GMP指南（2011年版） 分析方法的验证和确认，参照含量测定法的确认项目，应该要确认的项目有专属性、精密度；由于包封率的样品由收集获得，可能存在收集不完全而使结果产生偏差，所以准确度也需确认，在本方案中增加回收率实验。则需要确认的项目为专属性、精密度、准确度。8.2.3 专属性8.2.3.1 操作方法按处方量精密称取辅料，置于20ml西林瓶中，加入5%葡萄糖注射液7.5ml，涡旋振

9、荡10min，配置成空白辅料溶液。取空白辅料溶液，按照项下的测定法操作，将收集到的ME、MF和ML各精密量取20l注入液相色谱仪。记录色谱图。8.2.3.2 接受标准用空白辅料溶液收集得到的ME、MF和ML色谱图在紫杉醇峰位置均应无干扰。 进样精密度8.2.4.1 操作方法按照项测定法配制ME溶液，分别精密量取20l注入液相色谱仪，连续测定6次，记录色谱图。8.2.4.2 接受标准连续6次测定的ME主峰面积的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。8.2.5 重复性8.2.5.1 操作方法取注射用紫杉醇脂质体3瓶，分别加入5%葡萄糖注射液6.2、7.5、9.4ml涡旋振荡溶解，每瓶按照项下的测

10、定法分别操作3次，计算包封率。8.2.5.2 接受标准9次包封率的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。8.2.6 回收率8.2.6.1 操作方法取注射用紫杉醇脂质体3瓶，分别加入5%葡萄糖注射液6.2、7.5、9.4ml涡旋振荡溶解，每瓶按照项下的测定法分别操作3次，计算回收率。8.2.6.2 接受标准9次回收率均应在98.0102.0%之间，其相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。8.3 有关物质检验方法学确认8.3.1 检验方法色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇:水（3:1）为流动相，检测波长为227nm。测定法：取本品适量，加甲醇制成每1ml中约含紫杉醇1.5mg的溶

11、液，作为供试品溶液；精密量取适量，加甲醇稀释制成每1ml中含紫杉醇0.045mg的溶液，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱方法，取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分峰的高达记录仪满量程的30%；再准确量取对照溶液和供试器溶液各20l，注入液相色谱仪，记录供试品溶液色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，计算各杂质峰面积的总和，不得大于对照溶液的主峰面积的1.5倍（4.5%）。8.3.2 确认项目的确定 根据药品GMP指南（2011年版） 分析方法的验证和确认，有关物质应该要确认的项目有专属性、定量限、精密度；由于有关物质检测没有规定已知杂质，因此不

12、进行准确度确认。 专属性8.3.3.1 操作方法精密称取注射用紫杉醇脂质体0.63g，用甲醇溶液定容于10ml容量瓶，制成每1ml中约含紫杉醇1.5mg的供试品溶液。按处方量配制空白辅料溶液：精密称取各辅料，置于20ml容量瓶中，用甲醇溶解定容。精密量取上述溶液各20ul，按照有关物质供试品溶液方法注入液相色谱仪，记录色谱图。8.3.3.2 接受标准在该色谱条件下，空白辅料在紫杉醇位置不出峰。 进样精密度8.3.4.1 操作方法取1瓶注射用紫杉醇脂质体，精密称取供试品0.63g，加甲醇溶于10ml容量瓶中，制成每1ml中约含紫杉醇1.5mg的供试品溶液，精密量取供试品溶液3ml,加甲醇溶于10

13、0ml容量瓶中，制成每1ml中含紫杉醇0.045mg的对照溶液。分别精密量取对照溶液20ul，按照有关物质方法注入液相色谱仪，连续测定6次，记录色谱图。8.3.4.2 接受标准6次测得的对照主峰面积的相对标准偏差（RSD）应不大于5.0%。8.3.5 定量限精密称取紫杉醇对照品15mg，用甲醇溶液定容于10ml容量瓶，制成每1ml中约含紫杉醇1.5mg的供试品溶液。用甲醇逐步稀释供试品溶液并精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，观察紫杉醇峰的信噪比，直至峰高为基线噪音的10倍时，记录此时紫杉醇对照品的进样量，即为其定量限。 重复性8.3.6.1 操作方法取4瓶注射用紫杉醇脂质体，分别精密

14、称取供试品0.63g，加甲醇溶于10ml容量瓶中，制成每1ml中约含紫杉醇1.5mg的供试品溶液，精密量取供试品溶液3ml,加甲醇溶于100ml容量瓶中，制成每1ml中含紫杉醇0.045mg的对照溶液，分别精密量取20ul注入液相色谱仪，计算有关物质的值。共配制6份供试品溶液进行检验。8.3.6.2 接受标准6份供试品溶液有关物质的值的相对标准偏差（RSD）应不大于5.0%。8.4 含量测定检验方法学确认 检验方法色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇：水（3:1）为流动相，检测波长为227nm。理论板数按紫杉醇峰计算，应不低于1000。测定法：取本品3瓶，分别加甲醇使溶解，转移至2

15、00ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度；精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇5ml，摇匀，用流动相稀释至刻度。精密量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图。另取紫杉醇对照品约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。含紫杉醇(C47H51NO14)应为标示量的90.0110.0%。 确认项目的确定 根据药品GMP指南（2011年版） 分析方法的验证和确认，含量测定的确认项目为专属性和精密度，准确度经评估后确定是否需进行确认。由于含量测定中供试品溶液的配制为甲醇溶解和稀释，准确度

16、不会受实验室条件的影响，由于准确度已经方法学验证，本次不再进行确认。8.4.3 专属性由于注射用紫杉醇脂质体含量测定和有关物质的色谱条件一致，且有关物质测定方法中各辅料的浓度远大于含量测定方法中辅料的浓度，故含量测定方法的专属性无需另外确认。8.4.4 进样精密度8.4.4.1 操作方法精密称取紫杉醇对照品10mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，制成含紫杉醇0.04mg/ml的对照品溶液。精密量取20l注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。8.4.4.2 接受标准 6次的紫杉醇的峰面积的相对标准偏差（RSD）不得大

17、于2.0%。 重复性.1 操作方法对照品溶液：精密称取紫杉醇对照品约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。供试品溶液：取本品3瓶，分别加甲醇使溶解，转移至200ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度；精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇5ml，摇匀，用流动相稀释至刻度。共制备6份供试品溶液。精密量取供试品溶液和对照品溶液各20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。8.4.5.2 接受标准 6份供试品含量的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。9. 可接受标准 确认按照确认方案执行，各检测项目符合合格标准。

18、项目标 准包封率进样精密度连续6次进样的主峰面积的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。专属性用空白辅料溶液收集得到的ME、MF和ML色谱图中在紫杉醇峰位置均应无干扰。重复性9次包封率的值的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。回收率9次回收率均应在98.0102.0%之间，其相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。有关物质进样精密度连续6次测得的有关物质值的相对标准偏差（RSD）应不大于5.0%。专属性空白辅料在紫杉醇位置不出峰。定量限定量限的紫杉醇峰的性噪比应10.0。重复性所得6份有关物质的值的相对标准偏差（RSD）应不大于5.0%。含量测定进样精密度连续进样6次的峰面积的相对标准偏

19、差（RSD）不得大于2.0%。专属性空白辅料在紫杉醇位置不出峰。重复性六份含量的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。10. 偏差调查及异常情况实验过程中任何失败的测试，方案实施过程中任何验证项目偏离标准均需复核和评估并查出原因。11. 综合分析与结果评价确认小组成员负责完成各项确认记录并起草确认报告。确认组长综合确认实施情况及结果，就注射用紫杉醇脂质体质量标准（国家药品标准WS-718(X-529)-2002）检验方法在本公司质管部实验室条件下是否适用作出评定及结论。12. 确认结论和监测建议确认小组根据确认过程和结果提出确认结论和日常监测建议，报确认委员会审批，由确认委员会决定本次确认是

20、否有效和是否发放确认合格证书。13. 附件附表一：文件检查记录附表二：人员培训记录附表三：检测仪器的有效性记录附表四：确认结果记录附表五：异常情况统计表附表六：偏差清单附表一： 文 件 检 查 记 录确认项目名称： 注射用紫杉醇脂质体包封率、有关物质、含量测定检验方法学确认确认项目编号： VA-4F97MV-00 第1页 共1页> 序号文件名称文件编号存放处结论：检查人/日期：复核人/日期：附表二： 培 训 记 录确认项目名称：注射用紫杉醇脂质体包封率、有关物质、含量测定检验方法学确认确认项目编号：VA-4F97MV-00 第1页 共1页> 培训主题：主讲人：培训部门：培训时间：培

21、训方式：培训地点：培训内容：部门/班组姓名签字部门/班组姓名签字附表三：检 测 仪 器 的 有 效 性 记 录 确认项目名称：注射用紫杉醇脂质体包封率、有关物质、含量测定检验方法学确认确认项目编号：VA-4F97MV-00 第1页 共1页> 序 号仪器名称检定/计量/校验编号有效期至结论：检查人/日期：复核人/日期：附表四：确认结果记录确认项目名称：注射用紫杉醇脂质体包封率、有关物质、含量测定检验方法学确认确认项目编号：VA-4F97MV-00 第 1 页 共 8 页包封率进样精密度温度：，湿度： %。仪器： 高效液相色谱仪，编号： ；色谱柱系列号 。结果：峰面积AsAs RSD(%)可

22、接受标准：连续6次进样的主峰面积的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。结论：符合规定 不符合规定检验人/日期 复核人/日期 专属性温度：，湿度： %。仪器： 高效液相色谱仪，编号： ；色谱柱系列号 。结果：可接受标准：用空白溶液收集得到的ME、MF及空白溶液色谱图中在紫杉醇峰位置均应无干扰。结论：符合规定 不符合规定检验人/日期 复核人/日期 重复性温度：，湿度： %。仪器： 高效液相色谱仪，编号： ；色谱柱系列号 。结果：附表四：确认结果记录确认项目名称：注射用紫杉醇脂质体包封率、有关物质、含量测定检验方法学确认确认项目编号：VA-4F97MV-00 第 2 页 共 8 页ME峰面积ME

23、峰面积平均MF峰面积MF峰面积平均ML峰面积ML峰面积平均包封率（%）回收率（%）包封率RSD（%）123456789可接受标准：9次包封率的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。结论：符合规定 不符合规定检验人/日期 复核人/日期 回收率附表四：确认结果记录确认项目名称：注射用紫杉醇脂质体包封率、有关物质、含量测定检验方法学确认确认项目编号：VA-4F97MV-00 第 3 页 共 8 页温度：，湿度： %。仪器： 高效液相色谱仪，编号： ；色谱柱系列号 。结果：ME峰面积ME峰面积平均MF峰面积MF峰面积平均ML峰面积ML峰面积平均包封率（%）回收率（%）回收率RSD（%）1234567

24、89可接受标准：9次回收率均应在98.0102.0%之间，其相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。附表四：确认结果记录确认项目名称：注射用紫杉醇脂质体包封率、有关物质、含量测定检验方法学确认确认项目编号：VA-4F97MV-00 第 4 页 共 8 页结论：符合规定 不符合规定检验人/日期 复核人/日期 有关物质进样精密度温度：，湿度： %。仪器： 电子天平，仪器编号： ； 高效液相色谱仪，编号： ；色谱柱系列号 。结果：称样量（g）定容体积(ml)峰面积AsAs RSD(%)可接受标准：6次测得的对照主峰面积的相对标准偏差（RSD）应不大于5.0%。结论：符合规定 不符合规定检验人/日期

25、复核人/日期 专属性温度：，湿度： %。仪器： 电子天平，仪器编号： ； 高效液相色谱仪，编号： ；色谱柱系列号 。结果：附表四：确认结果记录确认项目名称：注射用紫杉醇脂质体包封率、有关物质、含量测定检验方法学确认确认项目编号：VA-4F97MV-00 第 5 页 共 8 页辅料胆固醇卵磷脂葡萄糖苏氨酸称样量（g）定容体积(ml)紫杉醇位置有无峰可接受标准：空白辅料在紫杉醇位置不出峰。结论：符合规定 不符合规定检验人/日期 复核人/日期 定量限温度：，湿度： %。仪器： 电子天平，仪器编号： ； 高效液相色谱仪，编号： ；色谱柱系列号 。结果：称样量（mg）定容体积(ml)稀释倍数最终浓度(µg/ml)定量限(ng)信噪比可接受标准：空白辅料在紫杉醇位置不出峰。结论：符合规定 不符合规定检验人/日期 复核人/日期 重复性温度：，湿度： %。仪器： 电子天平，仪器编号： ； 高效液相色谱仪，编号： ；色谱柱系列号 。结果：附表四：确认结果记录确认项目名称：注射用紫杉醇脂质体包封率、有关物质、含量测定检验方法学确认确认项目编号：VA-4F