ILK在cGVHD狼疮样小鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用

1、ILK在cGVHD狼疮样小鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用         08-11-21 15:47:00     作者：黄霞，王美美    编辑：studa20【摘要】  目的 观察整合素连接激酶（ILK）在慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼疮样小鼠肾脏中的表达，探讨其在狼疮肾炎肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法 建立cGVHD狼疮样小鼠模型，将小鼠分成正常对照组(A组)、12周模型组(B组) 和16周模型组(C组)，每组

2、6只。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、western blot、免疫组织化学法分别检测ILK 、E-钙粘蛋白和-平滑肌肌动蛋白（-SMA）mRNA和蛋白在肾组织中的表达。结果 RT-PCR和western blot方法分别检测到B、C两组小鼠肾组织ILK、-SMA mRNA和蛋白表达较A组升高(P均0.01)， E-钙粘蛋白表达降低(P均0.01)。ILK蛋白和mRNA表达与-SMA表达呈正相关（r分别为0.83，0.86，P均0.01），与E-钙粘蛋白表达呈负相关（r分别为-0.84，-0.89，P均0.01）。免疫组化结果表明，与A组相比，B、C两组小鼠肾小管及间质均可见ILK、

3、-SMA蛋白显著表达，而E-钙粘蛋白的表达显著减少。结论 cGVHD狼疮样小鼠肾组织中ILK蛋白及mRNA表达明显上调，可能通过介导肾小管上皮间充质细胞转分化而参与了狼疮肾炎肾间质纤维化的进程。 【关键词】  移植物抗宿主病；狼疮肾炎；粘蛋白类；肾小管；小鼠；动物实验Abstract:  Objective  To determine the expression of integrin-linked kinase (ILK) in renal tissue of mice with chronic graft versus host disease (cGVHD

4、) lupus nephritis and its relationship with the epithelial-mesenchymal transition.  Methods  cGVHD lupus nephritis mice models were conducted. All the mice were divided into three groups: group A (control group, n=6), group B (12-week model group, n=6) and group C (16-week model group, n=6

5、).  The mice were killed twelve weeks later (group B) or sixteen weeks later (group C), respectively. The protein and mRNA expressions of ILK, alpha-SMA and E-Cadherin in kidney were detected by using immunohistochemistry, western blot and RT-PCR, respectively.  Results  The  pro

6、tein and mRNA expression of E-cadherin were significantly down-regulated (P<0.01) in group B and group C compared with group A, while expressions of ILK and  alpha-SMA were up-regulated, respectively (P<0.01). The protein and mRNA expressions of ILK were positively correlated with alpha-S

7、MA (r=0.83, and 0.86, all P<0.01), but  adversely associated with E-cadherin (r=-0.84, and -0.89, all P<0.01).  Conclusion  The elevating expression of ILK may play an important role in the process of lupus nephritis through mediating the epithelial-mesenchymal transition.  

8、;   Key words:  graft versus host disease; lupus nephritis; mucins; kidney tubules; mice; animal experimentation狼疮肾炎（lupus nephritis，LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus， SLE）最常见临床表现之一，其病理改变具有多样性及不均一性，以肾小球、肾血管、肾间质的损害为主要特征，后期可发展为肾小球硬化、纤维性新月体、间质纤维化及其肾小管萎缩等。与其他慢性肾脏疾病一样，肾脏纤维化是各型LN进展到终

9、末期的必经阶段。肾小管上皮细胞间充质转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肾脏纤维化的发生发展中起重要作用，近年来一些研究提示整合素连接激酶（integrinlinked kinase，ILK）可能是介导EMT的关键因子1，但是在LN中EMT的形成以及ILK与EMT关系的研究报道尚少。我们以慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus  host disease，cGVHD）狼疮样小鼠为模型，观察不同时期ILK、E-钙粘蛋白和-平滑肌肌动蛋白(-SMA)在肾组织中的表达，并探讨ILK在狼疮肾炎肾小管上皮细胞转分化中的作用

10、。1  材料与方法1.1  实验动物  810周龄（C57BL/6J×DBA/2）F1代杂交雌性小鼠（以下称F1代鼠）及46周龄DBA/2雌性小鼠购自中山大学医学动物中心，体重（19.99±1.99）g，SPF级。1.2  模型的建立与分组  按随机设计原则将F1代鼠分为正常对照组（A组）、12周模型组（B组）及16周模型组（C组），每组6只小鼠。建立cGVHD狼疮样小鼠模型。取DBA/2小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞，制成单细胞悬液（约60%脾细胞、30%胸腺细胞及10%淋巴结细胞）。分别于第0、3、7、10天注射于模型组F1

11、代鼠，每次注射给予细胞数约为50×106个。正常对照组于相同时间点经尾静脉注射与单细胞悬液等体积的生理盐水。于首次注射单细胞悬液之日起，于第12周末处死B组小鼠，于第16周末处死A组和C组小鼠。处死后立即取下肾脏，将肾包膜完全剥离后，一部分保存于-80以备提取总RNA和蛋白质，另一部分固定于10%中性福尔马林溶液中，经石蜡包埋后切片进行组织病理检查及免疫组织化学实验。1.3  组织病理切片  2m连续切片，至经多聚赖氨酸包被的载玻片上，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，分别行苏木素伊红（hematoxylineosin，HE）染色和Masson染色。1.4  免

12、疫组织化学  SP法进行免疫组化染色。将肾组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，3%过氧化氢室温孵育10min灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，10%正常羊血清封闭，37孵育15min，分别滴加兔抗小鼠ILK抗体（150，Upstate公司）、兔抗小鼠E-钙粘蛋白抗体（1100，Sigma公司）、兔抗小鼠-SMA抗体（1100，Santecruz 公司）4孵育过夜，再依次加入生物素偶联的羊抗兔IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，各37孵育15min 二氨基联苯胺(DAB)染色，显微镜下控制显色，HE复染，常规脱水、透明、封片镜检。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照

13、。1.5  western blot  取80保存的肾组织5080mg，加适量裂解液后匀浆，冰中静置30min，离心，取上清，测蛋白浓度，加蛋白上样缓冲液，煮沸4min，瞬时高速离心，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移蛋白至PVDF膜上，丽春红染色观察转膜情况，TBST洗膜，5BSA封闭，分别加入兔抗小鼠ILK抗体，兔抗小鼠E-钙粘蛋白抗体、兔抗小鼠-SMA抗体、兔抗小鼠，室温孵育1.5h，TBST洗膜，化学发光显示结果。图片扫描保存后用Totallab 2.01分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。以GAPDH为内参，用目的蛋白条带灰度值与内参灰度值的比值代表目

14、的蛋白的相对表达含量。1.6  逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)表  引物序列（略）PCR反应体系5×PCR缓冲液10l，MgCl2(25mmol/L) 4l，dNTPs(10 mmol/L)1l，上下游引物各1l（10mol/L），cDNA模版1l，TaqDNA聚合酶（5U/l ）(TAKARA公司)0.25l，补足双蒸水至50l。97预变性后，94变性30s，59退火50s，72延伸1min为一个循环，共38个循环后，72终末延伸7min。1.7  统计学处理  计量资料采用±s表示，使用SPSS 13.0统计软件，两组间比较采

15、用检验，两变量间相关性采用直线相关分析。2  结果2.1  肾脏病理改变  模型组肾小球系膜区增宽，基质大量增生；小管多灶性萎缩，管腔内可见蛋白管型及细胞管型，B组间质大量单个核细胞浸润并有基质沉积，C组细胞数减少并出现部分肾小管空泡化。Masson染色可见C组小鼠肾小球囊壁，肾小管间质有明显的胶原纤维沉积，B组胶原纤维较C型组少，主要位于肾小管间质。A组肾组织未见明显胶原沉积。2.2  免疫组织化学检测结果  见图。ILK在A组肾小球及肾小管上皮细胞中无明显表达，在B组小鼠肾组织小管及间质中表达增强，而在C组小鼠肾组织中表达较B组进一步增加。

16、E-钙粘蛋白几乎表达于A组所有上皮细胞中，而在B组、C组小鼠随着肾小管上皮细胞结构的破坏，表达减弱。A组-SMA仅表达于血管平滑肌细胞和间质少量成纤维细胞，B组小鼠肾小管上皮细胞和间质-SMA的表达开始升高，C组小鼠肾小管上皮细胞和间质中-SMA阳性细胞数明显增加。A图  A组肾小球及肾小管上皮细胞中无明显表达；（略）           B图  B组小鼠肾组织小管及间质中表达增强；（略）             C图